稠李花色苷的純化及體外抗氧化活性

劉劍利，劉 曉，曹向宇*，于 慧，楊思敏，孫宇航

（遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036）

LIU Jianli， LIU Xiao， CAO Xiangyu*， YU Hui， YANG Simin， SUN Yuhang

（School of Life Science， Liaoning University， Shenyang 110036， China）

稠李花色苷的純化及體外抗氧化活性

劉劍利，劉 曉，曹向宇*，于 慧，楊思敏，孫宇航

（遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036）

目的：建立AB-8大孔樹脂純化稠李花色苷的方法，并檢測稠李花色苷體外抗氧化活性。方法：通過AB-8大孔樹脂對稠李花色苷的動態吸附與解吸條件優化，確定最佳純化條件；采用四唑氮藍（nitroblue tetrazolium，NBT）光化還原法測定花色苷體外抗氧化活性，2'，7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluoresce in diacetate，DCFH-DA）法觀察花色苷對H2O2誘導的N 2A細胞氧化損傷的保護作用。結果：稠李花色苷的最佳動態純化條件是：吸附流速0.01 mL/s，粗提液質量濃度8 mg/mL，過柱次數2 次；解吸劑乙醇體積分數70%，流速0.01 mL/s，pH 3，純化之后稠李花色苷的色價為57.1，純化了16.31 倍；NBT實驗結果表明，稠李花色苷具有清除超氧陰離子自由基的能力，且具有較好的劑量-效應關系；0.025 mg/mL的稠李花色苷能夠保護H2O2損傷的N2A細胞，0.05 mg/mL的稠李花色苷能夠降低細胞內活性氧水平。結論：AB-8大孔樹脂是純化稠李花色苷的一種有效方法，稠李花色苷在一定質量濃度范圍內具有較好的體外抗氧化活性。

稠李；花色苷；純化；大孔樹脂；抗氧化；活性氧

LIU Jianli， LIU Xiao， CAO Xiangyu*， YU Hui， YANG Simin， SUN Yuhang

（School of Life Science， Liaoning University， Shenyang 110036， China）

稠李，為薔薇科稠李屬的植物，果期一般在5-10月。稠李果實味澀，微甜，形狀卵球形，徑長可達0.8～1 cm，果皮為紅褐色至紫色［1］。稠李屬植物因較耐濕寒，并且花香濃郁，為早春觀賞植物之一。稠李在我國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、河北、山西、河南、山東等地均有分布。由于稠李的樹皮、葉、花和果均可入藥，樹干可做木材，因此其用途廣泛［2］。

花色苷不僅具有很高的營養價值，也是替代合成色素的理想材料［3］。同時它具有較好的抗腫瘤、抗癌、抗炎等作用［4-6］，還可與活性氧反應，減少和消除活性氧對生物體的傷害［7-8］，因此，花色苷越來越受到人們的關注，在食品領域、醫藥與化妝品、保健品行業都有著巨大的應用價值和開發價值。

目前，國內外對于稠李的研究主要集中在稠李苗木繁育和稠李葉片成分分析兩個方面［9］，對稠李花色苷的研究也主要集中在花色苷制備及功能研究上［10-11］，而對其分離純化、抗氧化方面少有報道［12］。花色苷類化合物的分離純化方法很多，有萃取法、添加劑法、重結晶法、層析法、高速逆流色譜技術法等，但均存在不同程度的缺點，從而限制了其工業化的生產［13-14］。目前采用的分離純化花色苷類化合物的主要方法是大孔樹脂吸附法，它具有效率高、質量穩定、成本低且操作簡單易行等優點［15］。本實驗采用AB-8大孔樹脂對稠李花色苷進行有關吸附-解吸性能的純化研究，并對純化后的稠李花色苷進行了體外抗氧化活性和細胞水平損傷保護作用的研究，以期為稠李資源開發和深加工轉化提供理論基礎和實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

薔薇科稠李屬稠李 遼寧大學校內采集并冷凍保存；AB-8大孔樹脂 南開大學化工廠。

氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）、甲硫氨酸 國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸 加拿大BioBasic公司；核黃素 北京奧博星生物技術有限公司；氯化鉀、鹽酸、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2儀器與設備

HH-W420數顯三用恒溫水浴箱 金壇市晶玻實驗儀器廠；DZKW-D-6數顯電熱恒溫水浴鍋 上海申光儀器儀表有限公司；721N可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；JW-3021HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；CHRIST冷凍干燥機 北京鑫盛鴻陽科技有限公司；063335型電子蠕動泵 上海青浦滬西儀器廠；SHA-2型恒溫搖床 上海比朗儀器有限公司；RE-52CS-2型旋轉蒸發儀 上海虹昕電子儀器儀表有限公司。

1.3方法

1.3.1稠李果實花色苷的制備［16］

取稠李果實去柄，破碎，去核，于－80 ℃冰箱冷凍，冷凍干燥后取出，用體積分數為60%的乙醇按照1∶30（m/V）的比例混合均勻，在超聲功率為300 W的條件下超聲45 min，離心，取上清液比色。收集提取液，用旋轉蒸發儀進行濃縮，最后冷凍干燥，得到稠李果實花色苷粉末。

1.3.2花色苷含量的測定

根據pH示差法［17］測定稠李果實中花色苷的含量，通過全波長掃描，確定稠李花色苷在可見光區的最大吸收波長是520 nm。根據花色苷的結構特性，當pH值為1.0時在520 nm波長處有最大吸收峰，而當pH值為4.5時，花色苷就轉變為無色查耳酮形式，在520 nm波長處沒有吸收峰，用示差法計算溶液中總花色苷含量，根據公式（1）計算花色苷含量。

式中：A0、A1分別為pH 1.0、4.5時花色苷在520 nm波長處的吸光度；V為提取溶液總體積/mL；n為稀釋倍數；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質量/（g/mol）；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數26 900/（L/（mol·cm））；m為稠李果實質量/g；b為比色皿厚度/cm。

1.3.3大孔樹脂動態純化花色苷

1.3.3.1大孔樹脂的預處理［18］

用蒸餾水對大孔樹脂進行充分淋洗，置于無水乙醇中浸泡24 h，蒸餾水清洗殘留乙醇；然后酸堿處理，用體積分數為5% HCl溶液浸泡12 h后，用蒸餾水洗至中性；然后用質量分數為2% NaOH溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性。

1.3.3.2吸附流速對花色苷動態吸附率的影響

量取5 份50 mL花色苷粗提液，測定吸光度A0，然后將粗提液均速過柱1 次，流速分別為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mL/s，分別測定流出液的吸光度A1，根據公式（2）計算不同流速下的吸附率［19］。

1.3.3.3粗提液質量濃度對花色苷動態吸附率的影響

將花色苷粗提物分別配制成質量濃度為1、2、4、8、16 mg/mL的溶液，分別測定吸光度A0，然后溶液依次過柱，流速為0.01 mL/s，分別測定流出液的吸光度A1。按照公式（2）計算各自的吸附率。

1.3.3.4過柱次數對花色苷動態吸附率的影響

量取50 mL花色苷粗提液，測定吸光度A0，然后將粗提液分別過柱1～5 次，流速調為0.01 mL/s，分別測定流出液的吸光度A1。按照公式（2）計算各自的吸附率。

1.3.3.5乙醇體積分數對花 色苷動態解吸率的影響

將同一批次中吸附了花色苷的大孔樹脂等量分配，量取5 份體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，依次通過樹脂柱，分別測定流出液吸光度A2，根據公式（3）計算解吸率［19］。

1.3.3.6解吸流速對花色苷動態解吸率的影響

將同一批次中吸附了花色苷的大孔樹脂等量分配，量取5 份體積分數70%乙醇溶液，流速分別調為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mL/s，依次通過樹脂柱后，測定流出液的吸光度A2，按照公式（3）計算不同流速的解吸率。

1.3.3.7pH值對花色苷動態解吸率的影響

根據相關文獻［20-21］可知，花色苷在酸性條件下較穩定，而在堿性溶液中，其穩定性受較大影響，因而將同一批次中吸附了花色苷的大孔樹脂等量分配，量取5 份體積分數70%乙醇溶液，將pH值分別調至2、3、4、5、6，以0.01 mL/s的速率通過樹脂柱。每次過柱后測定流出液吸光度A2，按照公式（3）計算解吸率。

1.3.4稠李花色苷色價的測定［22］

按照最佳的純化條件對稠李果實花色苷進行純化，經減壓濃縮、冷凍干燥得到花色苷粉末。準確稱取0.10 g的花色苷粉末，用pH 3.0的檸檬酸緩沖溶液定容到100 mL，稀釋一定倍數，在520 nm波長處測定其吸光度，并按照公式（4）計算稠李花色苷色價E。

式中：A為樣品在520 nm波長處的吸光度；m為花色苷粉末樣品質量/g；r為測定吸光度時所吸樣品被稀釋的倍數。

1.3.5NBT光化還原法測定稠李花色苷的體外抗氧化活性［23］

配制質量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的稠李花色苷溶液進行實驗。具體參考呂淑霞［24］的方法略有改進。

1.3.6稠李花色苷對H2O2誘導N2A細胞損傷的影響［25］

用含體積分數10%胎牛血清的培養液配成單個N2A細胞懸液，以每孔105個細胞接種到6 孔板，每孔體積2 mL，接著在37 ℃，體積分數5% CO2培養箱中進行細胞培養24 h，然后對細胞進行處理，設置3 個實驗組，分別為正常對照組、模型組和花色苷處理組。其中模型組H2O2濃度為0.5 mmol/L，花色苷處理1組用0.5 mmol/L H2O2和0.025 mg/mL的花色苷作用于細胞，花色苷處理2組用0.5 mmol/L H2O2和0.05 mg/mL的花色苷作用于細胞，繼續培養1 h，顯微鏡下分別觀察不同組細胞的狀態并計算貼壁細胞數目百分比。

1.3.7稠李花色苷對H2O2損傷的N2A細胞內活性氧含量的影響［26］

將N2A細胞進行種板，對照組加入0.5 mmol/L H2O2，花色苷處理組加入0.05 mg/mL的花色苷和0.5 mmol/L H2O2，去除細胞培養液，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）淋洗后，加入終濃度為20 μmol/L稀釋好的2'，7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），包上錫紙，37 ℃培養箱內溫育30 min，再用PBS進行淋洗，加入甲醇0.5 mL，－20 ℃固定30 min，再次淋洗后，加入丙酮（4 ℃預冷）0.5 mL固定6 min，然后每5 min用PBS淋洗3 次，最后進行封片觀察。

1.4數據分析

實驗重復3 次測定，結果表示為±s，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2　結果與分析

2.1稠李果實花色苷含量

根據pH示差法，測得花色苷的含量為（0.897±0.013） mg/g，冷梅等［27］測得紫葉稠李花色苷的含量為（0.830±0.033）mg/g，本研究得到含量比其高8%。

2.2大孔樹脂動態純化稠李花色苷結果

2.2.1吸附流速對稠李花色苷動態吸附率的影響

圖1 吸附流速對稠李花色苷動態吸附率的影響Fig.1 Effect of sample loading flow rate on the dynamic adsorption rate of Padus racemosa anthocyanins

圖1為吸附流速對稠李花色苷動態吸附率的影響，在吸附流速為0.01 mL/s時，AB-8大孔樹脂對稠李花色苷的吸附率為80.7%，而吸附流速為0.20 mL/s時，吸附率僅為41.2%，吸附率隨流速的增加而降低。流速越低，稠李花色苷經過柱子所需的時間越長，與樹脂接觸的時間也就越久，從而吸附效果越好，因而在后續的吸附實驗中采用吸附流速為0.01 mL/s。

2.2.2粗提液質量濃度對稠李花色苷動態吸附率的影響如圖2所示，粗提液的質量濃度對稠李花色苷動態吸附率的影響不大，在質量濃度為8 mg/mL時，動態吸附率達到最大值，為89.2%。而當質量濃度繼續加大時，樹脂的吸附能力有所下降，原因可能是花色苷質量濃度的提高使得與花色苷競爭吸附的雜質的含量也增加，影響了花色苷在樹脂內部的擴散［28］。因而，選擇8 mg/mL的粗提液質量濃度為吸附原液質量濃度。

圖2　稠李花色苷粗提液質量濃度對動態吸附率的影響Fig.2 Relationship between Padus racemosa anthocyanin concentration and dynamic adsorption rate

2.2.3過柱次數對稠李花色苷動態吸附率的影響

圖3　過柱次數對稠李花色苷動態吸附率的影響Fig.3 Effect of sample loading number on the dynamic adsorption rate of Padus racemosa anthocyanin

如圖3所示，隨著過柱次數的增多，樹脂對稠李花色苷的吸附效果略有增加，其中在過柱2 次后，吸附率為94.7%，而過柱5 次時的吸附率為96.4%。通過數據的比對可以得出：過柱2 次以后，吸附率增加的幅度不大，因此，出于實際操作和經濟方面的考慮，過柱2 次為最佳選擇。

2.2.4乙醇體積分數對稠李花色苷動態解吸率的影響

圖4　乙醇體積分數對稠李花色苷動態解吸率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the dynamic desorption rate of Padus racemosa anthocyanins

乙醇可以使大孔樹脂溶脹，減弱大孔樹脂和被吸附物質之間的作用力，并且能夠溶解被吸附的物質。如圖4所示，當乙醇體積分數＜70%時，稠李花色苷的解吸率隨著乙醇體積分數的增大而增大；在70%時的解吸率為25.8%，而當乙醇體積分數＞70%時，解吸率下降，在乙醇體積分數為80%時，解吸率為24.5%。因而，乙醇的體積分數選擇為70%。

2.2.5解吸流速對稠李花色苷動態解吸率的影響

圖5　解吸流速對稠李花色苷動態解吸率的影響Fig.5 Effect of flow rate on the dynamic desorption rate of Padus racemosa anthocyanins

如圖5所示，隨解吸流速的增加，乙醇對吸附了稠李花色苷的大孔樹脂的解吸效果呈下降趨勢，在0.01 mL/s時的解吸率為35.5%，而當流速為0.20 mL/s時，解吸率下降至25.4%，并且隨著解吸流速的增加，解吸率略有降低，因而為獲得比較高的解吸率，解吸流速選取0.01 mL/s進行實驗。

2.2.6pH值對稠李花色苷動態解吸率的影響

圖6　pH值對稠李花色苷動態解吸率的影響Fig.6 Effect of pH on the dynamic desorption rate of Padus racemosa anthocyanins

pH值對稠李花色苷動態解吸率的影響如圖6所示，隨著pH值的增大，稠李花色苷的解吸率呈現為先上升后下降的趨勢。當pH值為3時，解吸率最大，達68.2%，并且稠李花色苷在酸性條件下比較穩定。因此，后續實驗中采用實驗條件為pH 3，以獲得最好的解吸效果。

2.3稠李花色苷的色價

按最佳純化條件進行純化，稠李花色苷的吸附率為95.6%，解吸率為68.2%。純化前的色價為3.5，純化之后色價為57.1，純化了16.31 倍。張勇等［29］利用AB-8大孔樹脂對土豆色素進行純化，最終純化后的色價為43.15，是純化前的8.4 倍；董周永等［30］用AB-8大孔樹脂純化紅心蘿卜花色苷，最終純化后的色價為47.8，是純化前的12 倍，證明AB-8大孔樹脂是對花色苷純化的有效方法，同時本研究得到的純化方法效果相對好一些，但是對花色苷的純化還不夠完善，還可以利用凝膠層析、膜分離技術、超濾等方法進一步純化，并且還可采用高效液相色譜的方法對純化之后的花色苷進行鑒定。

2.4稠李花色苷的體外抗氧化活性

按照抗氧化物抑制NBT在光下的還原作用原理，來確定花色苷體外抗氧化活性。核黃素首先被光還原，有氧化物質存在下，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化，而產生超氧陰離子自由基（），可將NBT還原為藍色的甲腙，后者在560 nm波長處有最大吸收，而花色苷可清除，抑制甲腙的形成［24］。于是在光還原反應后，反應液藍色愈深，說明花色苷的抗氧化性愈低，反之花色苷的抗氧化性愈高。由圖7可知，稠李花色苷具有體外抗氧化活性，且隨著花色苷質量濃度的增大，其對清除能力有上升的趨勢。

圖7　稠李花色苷的體外抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of Padus racemosa anthocyanins in vitro

2.5稠李花色苷對H2O2誘導N2A細胞損傷的保護作用

通過0.5 mmol/L的H2O2處理能夠顯著降低N2A細胞的活力。然而，加入稠李花色苷之后，可以對N2A細胞進行保護，阻止H2O2對N2A細胞的損傷，其結果如圖8、9所示。

圖8　各組N2A細胞的形態Fig.8 Mo rphology of N2A cells in four experimental groups

圖9　稠李花色苷對HH2O2誘導N2A細胞損傷的保護作用Fig.9 Protective effect of Padus racemosa anthocyanins on H2O2-induced N2A cell damage

由圖8、9可知，正常對照組的細胞折光性強，細胞規則，貼壁狀態良好；模型組細胞變圓，折光性變弱，貼壁不良，而稠李花色苷處理組細胞形態較模型組有所改善。H2O2能夠損傷細胞膜的完整性，降低細胞的活性，對細胞的損傷很大，加入濃度為0.5 mmol/L的H2O2后，顯微鏡觀察貼壁細胞數目只達到正常對照組的31.4%，但是，經0.025 mg/mL的花色苷處理后，貼壁細胞數目為正常對照組的72.2%，與模型組比較，差異極顯著（P＜0.01），經0.05 mg/mL的花色苷處理后，貼壁細胞數目為正常對照組的84.9%，與模型組比較，差異極顯著（P＜0.01）。由此，可以得出稠李花色苷對H2O2誘導的N2A細胞損傷具有很強的保護作用，能夠顯著提高細胞的活性，且具有較好的劑量-效應關系。張麗霞等［31］通過形態學觀察、四甲基偶氮唑藍實驗得到黑莓花色苷對H2O2誘導的血管內皮細胞損傷有保護作用，Heo等［32］發現草莓花色苷同樣可使H2O2誘導損傷細胞的存活率增加，都證明了花色苷對H2O2損傷的細胞具有較好保護作用。

2.6稠李花色苷對H2O2損傷的N2A細胞內活性氧水平的影響

圖10　稠李花色苷對HH2O2損傷的N2A細胞內活性氧水平的影響Fig.10 Effect of Padus racemosa anthocyanin on ROS activity in N2A cells

如圖10所示，相對于正常細胞（圖10A），0.5 mmol/L H2O2處理的氧化應激條件下，細胞熒光信號顯著增強，說明細胞內活性氧水平較高（圖10B），加入0.05 mg/mL稠李花色苷后，細胞內熒光信號強度顯著降低（圖10C），說明細胞內活性氧水平降低，即稠李花色苷能夠抑制細胞氧化應激。Ullah等［33］通過活性氧的熒光實驗，也同樣證明了花色苷能夠降低細胞內活性氧水平。

3　結 論

本實驗確定了AB-8大孔樹脂純化稠李花色苷最佳條件為：吸附流速為0.01 mL/s，粗提液質量濃度為8 mg/mL，過柱2 次；解吸劑乙醇體積分數為70%，解吸流速為0.01 mL/s，pH值為3。純化之后稠李花色苷的色價為57.1，純化了16.31 倍。分離純化的稠李花色苷對O2－·清除能力較強，并存在劑量-效應關系；稠李花色苷對H2O2誘導的N2A細胞損傷具有較強的保護作用，DCFH-DA法觀察稠李花色苷具有較好的降低細胞內活性氧水平作用，說明稠李花色苷具有較好的體外抗氧化活性。本研究為稠李花色苷深加工和保健食品的開發利用提供了基礎資料和理論依據，但是有關稠李果實花色苷對H2O2誘導的N2A細胞損保護作用的確切機制以及對正常細胞的影響如何，還有待進一步研究。

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Purification and in vitro Antioxidant Activity of Anthocyanins from Padus racemosa

Purpose： To establish the best purification conditions for anthocyanins from the fruit pulp of Padus racemosa with AB-8 macroporous resin and detect the in vitro antioxidant activity of the extracted anthocyanins. Methods： The adsorption and desorption properties of macroporous resin AB-8 for anthocyanins from Padus racemosa were investigated to optimize the purification procedure， and the antioxidant activity in vitro was detected by nitroblue tetrazolium （NBT） photochemical reduction method. The protective effect of the extracted anthocyanins against oxidative stress induced by H2O2in N2A cells was analyzed by 2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate （DCFH-DA） fluor escent probe assay. Results： The best purification conditions were achieved by adsorption performed twice with at a flow rate of 0.01 mL/s after adjustment of the crude extract concentration to 8 mg/mL and subsequent desorption with 70% ethanol acidified to pH 3 at a flow rate of 0.01 mL/s. The color value after purification was 57.1， achieving a 16.31-fold purification factor. The anthocyanins had a strong superoxide anion radical scavenging capacity in a dose-dependent manner. N2A cells could be protected by the anthocyanins at a concentration of 0.025 mg/mL， and the level of reactive oxide species in N2A cells could be reduced by the anthocyanins at 0.05 mg/mL. Conclusion： Macroporous resin AB-8 is an effective adsorbent for the purification of Padus racemosa anthocyanins， and Padus racemosa anthocyanins have strong antioxidant activity in vitro in a certain concentration range.

Pad us racemosa； anthocyanin； purification； macroporous resin； antioxidant； reactive oxide species

TS264.4

A

1002-6630（2015）15-0005-06

10.7506/spkx1002-6630-201515002

2014-10-05

國家自然科學基金委員會科學部主任基金項目（31240005）；遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目（LJQ2013002）；遼寧省高等學校科學研究一般項目（L2014007）；遼寧省科技廳農業攻關計劃項目（2011211001）；遼寧大學博士科研啟動項目

劉劍利（1980—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：liujianli119@163.com

曹向宇（1980—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xycaolnu@163.com