超濾對繅絲蠶蛹蛋白肽感官品質的影響

曾藝濤，羅金鳳，丁曉雯，*，黃先智

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 4007 15；2.西南大學蠶學與系統生物學研究所，重慶 400715）

超濾對繅絲蠶蛹蛋白肽感官品質的影響

曾藝濤1，羅金鳳1，丁曉雯1，*，黃先智2

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 4007 15；2.西南大學蠶學與系統生物學研究所，重慶 400715）

目的：分析酶解繅絲蠶蛹蛋白所得肽經超濾處理后的性質，為其深度開發利用提供參考。方法：超濾分離酶解繅絲蠶蛹蛋白肽，氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatogra phy-mass spectrometer，GC-MS）測定揮發性成分。結果：繅絲蠶蛹蛋白肽經超濾后各組分（5.0 mg/mL）的明度（L*值）、偏向 綠程度（a*值）、偏向黃程度（b*值）均為大于3 000 D組分＞酶解原液＞200～3 000 D組分，且顏色由中黃色（酶解原液）變為深黃色（大于3 000 D組分）和淺黃色（200～3 000 D組分）；121 ℃滅菌處理對它們的色澤無顯著影響（P＞0.05）；各組分吸濕性強度為200～3 000 D組分＞酶解原液＞大于3 000 D組分，其中200～3 000 D組分的最高吸濕率達到42.24%；超濾后繅絲 蠶蛹蛋白肽的氣 味由刺激性難聞氣味（脫脂蠶蛹蛋白粉）轉變為有肉香（200～3 000 D組分）、果香及甜香味（大于3 000 D組分）。結論：超濾提升了繅絲蠶蛹蛋白肽的感官品質。

繅絲蠶蛹蛋白肽；超濾；性質；抗氧化性

我國是世界蠶桑業的發源地，目前產繭量和產絲量占世界的80%左右［1］。蠶蛹是家蠶生命周期的一個發育階段，其蛋白質含量高達45%～55%［2］。蠶蛹蛋白含有18 種氨基酸，其中人體必需的8 種氨基酸含量超過總量的40%，高于世界衛生組織（World Health Organization，WHO）和聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）提出的參考蛋白模式，且比例適當，是一種優質的蛋白源［3］。蠶蛹自古就作為滋補強身的食物，是具有保健功效的食品［4］。但由于繅絲過程要經過高溫、強堿等處理，導致繅絲蠶蛹蛋白的感官和理化性質都發生了一定的劣變［5］，限制了繅絲蠶蛹蛋白在食品工業中的應用。

近年來，利用酶工程技術，將繅絲蠶蛹蛋白開發為生物活性肽的研究時有報道，但主要集中于工藝的研究［6-9］，缺乏對酶解和分離之后樣品功能性質的研究。繅絲蠶蛹蛋白除了水不溶性和免疫原性限制了其在食品中的應用外，繅絲蠶蛹蛋白及繅絲蠶蛹蛋白生物活性肽的感官可接受性與食用品質直接影響了其在食品工業中的應用。因此，本研究擬對本實驗室前期酶解得到的繅絲蠶蛹蛋白肽進行超濾，研究超濾對繅絲蠶蛹蛋白肽感官品質與抗氧化性的影響，以期為酶解繅絲蠶蛹蛋白肽的利用提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

脫脂繅絲蠶蛹蛋白 自制。將干燥的繅絲蠶蛹粉碎，以石油醚（30～60 ℃）作溶劑用索式提取器抽提12 h以去除其中的脂肪，將剩余物干燥、粉碎而得脫脂蠶蛹蛋白粗粉。

繅絲蠶蛹蛋白水解專用酶（酶活力10 萬U/g） 南寧東恒華道生物科技有限公司；茚三酮、氨基酸混合標準品 日本和光純藥工業株式會社；檸檬酸、檸檬酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl hydrazyl，DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司；其他實驗室常用試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

MSM-2008實驗用超濾微濾膜分離裝置、HPS-3聚醚砜卷式超濾柱、RO-1812芳香聚酰胺卷式納濾柱 上海摩速科學器材有限公司；SHZ-Ⅲ真空泵 上海亞榮生化儀器廠；ALPAAI-4LSC真空冷凍干燥機 美國Sigma公司；pHs-3C酸度計 上海三信儀表廠；UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司；KjelFlex K-360全自動凱氏定氮儀 瑞士Büchi公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；UltraScan PRO測色儀 美國HunterLab公司；Trace DSQⅡGC/MS氣質聯用儀 德國Finigan公司；DM-5MS毛細管色譜柱 美國Dima公司；65 μm PDMS/DVB萃取頭 美國Supelco公司；KOQYO ES-315高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司。

1.3方法

1.3.1繅絲蠶蛹蛋白肽的制備

根據本實驗室前期的研究結果，取脫脂繅絲蠶蛹蛋白粗粉用純水配制成7 g/100 mL的酶解底物，用1 mol/L的NaOH調節pH值為7.2，按質量濃度3 g/100 mL的加酶量加入繅絲蠶蛹蛋白水解專用酶，在溫度53 ℃酶解4 h。酶解過程中不斷滴加1 mol/L的NaOH或HCl維持pH值穩定。沸水浴10 min滅酶結束酶解，流動水冷卻，4 000 r/min離心15 min，收集上清液冷凍備用。測得上清液還原力吸光度為0.75，超氧陰離子自由基（O2－·）和DPPH自由基清除率分別為34.54%和79.38%［10］。

1.3.2繅絲蠶蛹蛋白肽的超濾分級

1.3.2.1抽濾

將繅絲蠶蛹蛋白酶解液用0.45 μm有機濾膜抽濾，去除酶解液中的大顆粒雜質。

1.3.2.2超濾

將抽濾后酶解液上超濾分離裝置進行超濾。超濾條件為壓力0.25 MPa，常溫，用截留分子質量為3 000 D有機超濾膜，得到分子質量大于3 000 D和小于3 000 D的超濾片段；將后者再用截留分子質量為100～200 D的有機濾膜處理，超濾條件為壓力0.4 MPa，常溫，得到分子質量為200～3 000 D組分和分子質量小于200 D的組分。收集酶解原液、分子質量大于3 000 D組分和200～3 000 D組分進行真空冷凍干燥作為檢測樣本備用。

1.3.3不同分子質量的繅絲蠶蛹蛋白肽感官性質評價

1.3.3.1色澤測定

稱取不同分子質量的繅絲蠶蛹蛋白肽樣品，用去離子水配成質量濃度為5 mg/mL的溶液，用色差儀測定，記錄樣品的L*、a*和b*值。

1.3.3.2121 ℃滅菌實驗

參考張銳昌［11］的方法，將不同分子質量的繅絲蠶蛹蛋白肽配成2.5、5、10、30、50 mg/mL的溶液，在121 ℃加熱滅菌30 min，自然冷卻，觀察溶液處理前后色澤、有無沉淀和掛壁等感官變化。

1.3.3.3吸濕性測定

參考張銳昌［11］測定吸濕性的方法。取1 g不同分子質量的繅絲蠶蛹蛋白肽置于自然室內環境下，容器上面適當遮掩。每天定點準確測定其質量，以質量變化百分比和放置時間作圖，觀察繅絲蠶蛹蛋白及其酶解產物的吸濕性，連續8 d。

式中：mi為按照時間取點準確測定蠶蛹蛋白及其酶解產物的質量/g；m0為初始蠶蛹蛋白及其酶解產物的質量/g。

1.3.3.4揮發性成分的測定

頂空固相微萃取法（head space solid-phase microextractions，HS-SPME）提取不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白肽中的氣味物質［12］：稱取樣品0.5 g于15 mL萃取瓶中，加入5 mL蒸餾水，蓋上瓶蓋，搖勻備用。頂空瓶置于50 ℃恒溫水浴中平衡30 min。將65 μm PDMS/DVB萃取頭插入進樣口于250 ℃氦氣中老化30 min。將老化好的萃取頭插入穩定50 ℃水浴中的頂空瓶內液面上方，伸出纖維頭，每次固定推出4 cm，不與液面接觸，萃取40 min。萃取完后縮回纖維頭、拔出進樣器，然后迅速插入到氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）的進樣口，伸出纖維頭，解析4 min。同時啟動儀器采集數據，得出色譜圖后，根據譜庫（NITS MS Search 2011）檢索及人工解析確定其化學結構，采用峰面積歸一化法確定其相對含量。

色譜條件［13］：DM-5MS毛細管色譜柱（50 m× 0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：230 ℃；升溫程序：色譜柱初始溫度45 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升溫至80 ℃，以10 ℃/min升溫至160 ℃，以2.5 ℃/min升溫至180 ℃，以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min，載氣為氦氣，流量：1 mL/min。

質譜條件：接口傳輸線溫度：250 ℃，離子源溫度：250 ℃，離子化方式：電子轟擊（electron impact，EI）離子源，掃描模式：全掃描模式，質量范圍m/z 34～450，溶劑延遲0 min，程序升溫結束時檢測結束。

1.4數據處理

實驗結果均是3 次以上重復實驗的平均值，采用Excel 2007、SPSS17.0進行數據分析，Excel 2007作圖。

2　結果與分析

2.1不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白肽的色澤

L*、a*、b*值是食品色度的重要評價指標，L*值表示明度，L*值越大明度越大；a*值表示紅綠偏向，正值越大偏向紅色的程度越大，負值越大偏向綠色的程度越大；b*值表示黃藍偏向，正值越大偏向黃色的程度越大，負值越大偏向藍色的程度越大［14］。在常溫條件下，5.0 mg/mL繅絲蠶蛹蛋白肽酶解原液呈中黃色，大于3 000 D組分呈深黃色，200～3 000 D組分呈淺黃色，其L*、a*、b*值如表1所示。

表1　超濾前后繅絲蠶蛹蛋白肽的色差分析Table 1 Color parameters of silkworm pupa-derived peptide factions after ultrafiltration

由表1可知，各組分的L*值、a*值、b*值與酶解原液相比，其明度（L*值）、偏向綠程度（a*值）、偏向黃程度（b*值）均為大于3 000 D組分＞酶解原液＞200～3 000 D組分，且各組分間均具有顯著性差異（P＜0.05）或極顯著差異（P＜0.01）。這可能是因為在酶解過程中蛋白質分解為肽和氨基酸的同時，產生了有色的肽，且這些肽大多數分子質量大于3 000 D，經超濾后有色肽大部分殘留在了大于3 000 D組分里，導致其呈深黃色，小部分留在200～3 000 D組分里，導致其呈淺黃色。

2.2不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白肽的滅菌穩定性

由于含蛋白水解物的食品營養比較豐富，在加工和殺菌過程中需要經過高溫處理才能長期保存，故蛋白水解物的熱穩定性很重要。蛋白水解物熱穩定性是指蛋白水解物受熱不凝集、保持溶解的能力［15］。為達到室溫條件下長期存放的目的，本研究將不同質量濃度的超濾后繅絲蠶蛹蛋白肽經121 ℃ 30 min高壓滅菌，自然冷卻后觀察色澤變化，結果見表2、3。

表2　滅菌對繅絲蠶蛹蛋白肽色澤的影響Table 2 Effect of sterilization on the color of peptides from silkworm pupa protein

由表2可知，在50、30、10、5、2.5 mg/mL質量濃度條件下的兩種組分滅菌前后，顏色無顯著變化。說明滅菌對大于3 000 D組分與200～3 000 D組分顏色無顯著影響。

表3　滅菌前后蠶蛹蛋白肽的色差分析Table 3 Color parameters of silkworm pupa-derived peptide facti ons after sterilization

由表3可知，滅菌前后不同分子質量、不同質量濃度繅絲蠶蛹蛋白肽的L*、a*、b*無顯著變化，這與表2所觀察的顏色變化相一致。且全部溶解，無沉淀，無掛壁現象，相比張銳昌［11］制備的小麥蛋白肽在滅菌后0.5 mg/mL質量濃度以上的多肽出現掛壁和沉淀的現象，該不同分子質量的繅絲蠶蛹蛋白肽均表現出了良好的熱穩定性。

2.3不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白肽的吸濕性

吸濕性指材料在空氣中能吸收水分的性質［16］。高吸濕性的材料具有高保濕型，能夠應用在化妝品、紡織及食品行業中，解決產品失水、保濕問題。在實驗過程中發現，酶解后的繅絲蠶蛹蛋白肽凍干后極易吸潮，因此對其吸濕性進行了評價，其變化趨勢如圖1所示。

圖1　不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白肽吸濕性變化Fig.1 Moisture absorption curves of silkworm pupa-derived peptides with various molecular weights

由圖1可知，放于自然環境下，繅絲蠶蛹蛋白肽超濾前后各組分的吸濕率隨著存放天數增加逐漸增大，1～2 d時達到最大，其中200～3 000 D組分、酶解原液、大于3 000 D組分、脫脂繅絲蠶蛹蛋白粉的吸濕率分別為42.24%、40.12%、33.28%、17.54%，各分子質量組分均表現出很強的吸濕性，這可能是因為蛋白經酶解后會暴露出親水基團，從而增加了其吸水性［17］。隨著時間的延長，吸濕率有下降的趨勢，到第5天時4 種組分的吸濕率降到最低，分別為24.89%、23.78%、18.56%、9.25%。這可能是吸潮后在樣品表明形成一層膜，阻擋了水汽進入樣品內部［18］。5 d后，4 種樣品的吸濕率逐漸趨于穩定，第7天時分別保持在33.54%、33.54%、25.01%、14.51%。

各組分的吸濕率為200～3 000 D組分＞酶解原液＞大于3 000 D組分＞脫脂蠶蛹蛋白粉，這可能是因為脫脂蠶蛹蛋白粉經酶解并超濾后變為小分子肽，其表面的微孔結構增多，增強了吸濕性［19］。以上結果說明，相比脫脂繅絲蠶蛹蛋白粉，200～3 000 D分子質量的吸濕速率很快，具有良好的吸濕性和一定的保濕作用，食品加工過程中，可以解決面包和蛋糕等焙烤食品易失水、干燥的問題，在化妝品領域可用于毛發、皮膚的保濕劑。

2.4不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白及肽的氣味成分

氣味是影響感官的重要因素，為了探究酶解并超濾對繅絲蠶蛹蛋白肽氣味的影響，本實驗對脫脂蠶蛹蛋白粉、大于3 000 D和200～3 000 D繅絲蠶蛹蛋白肽HS-SPME萃取物進行GC-MS分析，結果見圖2。

圖2　不 同分子質量繅絲蠶蛹蛋白及肽組分揮發性成分的SPME-GC/MS圖C/MSFig.2 Total ion chromatograms of volatile components in silkworm pupa protein and its peptide fractions subjected to solid phase microextraction

經儀器所配置的NITS MS Search 2011進行檢索，組分的相對含量經數據處理系統按峰面積歸一化法計算得出，其分析結果見表4。脫脂蠶蛹蛋白粉共鑒定出3-甲基己烷、2-甲基戊烷、二甲基三硫醚、十八烯酸4 種化合物占總組分的65.70%，大于3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白肽共鑒定出右旋萜二烯、2-乙基己醇、叔十六硫醇等10 種化合物占總組分的29.68%，200～3 000 D的繅絲蠶蛹蛋白肽組分鑒定出2-乙基己醇、二甲基三硫醚、苯乙醛等9 種化合物占總組分的73.76%。說明超濾改變了蠶蛹蛋白的氣味成分，且200～3 000 D組分中的揮發性化合物總量＞脫脂蠶蛹蛋白粉＞大于3 000 D組分。對蠶蛹蛋 白及不同組分水解液的氣味化合物種類及其相對含量進行總結歸納，結果見表5。

表4　繅絲蠶蛹蛋白及不同分子質量繅絲蠶蛹蛋白肽揮發性成分及其相對含量Table 4 Volatile components and their relative contents in silkworm pupa protein and its peptide fractions with different molecular weights

表5　蠶蛹蛋白及酶解液不同組分的揮發性化合物的種類及其相對含量Table 5 Chemical classes and relative contents of volatile components extracted from silkworm pupa protein and its peptide fractions with

由表5可知，脫脂蠶蛹蛋白粉檢出的氣味化合物種類較少，主體氣味成分烴類所占比例比較大（58.13%），其次含有一定的醚類（9.95%）和酸類化合物（1.56%）。烴類（3-甲基己烷、2-甲基戊烷）呈現的刺激性難聞氣味占主導，醚類（二甲基三硫醚）呈現辛香氣味，少量的酸類化合物（十八烯酸）呈現豬油氣味［20］。

大于3 000 D 繅絲蠶蛹蛋白肽檢出7 類氣味化合物，醛類（15.26%）是其主導成分，其次是酮類（5.99%）。醛類（天然壬醛、正戊醛、癸醛）呈現的油脂、甜香、花香氣味占主導，酮類（2，6-二甲基-2，6-十一碳二烯-10-酮）的果香味［21］占其次。

200～3 000 D繅絲蠶蛹蛋白肽檢出6 類氣味化合物，酸類占48.9%，其次是醛類（8.47%）和醇類（6.22%）。酸類（十八烯酸）呈現的肉香味占主導，醛類（異戊醛、苯乙醛）帶有的果香和醇類（2-乙基己醇）帶有的花香和果香［22］占其次。

以上結果表明，脫脂蠶蛹蛋白經酶解并超濾所得到不同分子質量的多肽其氣味由刺激性難聞占主導轉變為肉香（200～3 000 D）、甜香及花香味（大于3 000 D）占主導，氣味得到一定程度的改善。

3　結 論

超濾分級后酶解產物感官性狀部分發生改變，超濾后的繅絲蠶蛹蛋白肽經各組分的明度（L*值）、偏向綠程度（a*值）、偏向黃程度（b*值）均為大于3 000 D組分＞酶解原液＞200～3 000 D組分，且顏色由中黃色（酶解原液）變為深黃色（大于3 000 D組分）和淺黃色（200～3 000 D組分）；滅菌處理對超濾樣品的顏色、性狀都沒有顯著性影響；樣品各組分均具有強烈的吸濕性，其吸濕性大小為200～3 000 D組分＞酶解原液＞大于3 000 D組分＞脫脂蠶蛹蛋白粉，其中200～3 000 D組分的吸濕率最高，可達42.24%；超濾使酶解的繅絲蠶蛹蛋白肽的氣味由刺激性難聞氣味（脫脂蠶蛹蛋白粉）轉變為主要含有肉香（200～3 000 D組分）、果香及甜香味（大于3 000 D組分）。

總體來說，超濾使繅絲蠶蛹蛋白肽的感官品質得到了進一步的提升，提高了其在食品及其他工業的應用價值。今后的研究方向可對200～3 000 D次級組分進行下一步分離純化，以期獲得一級多肽，另外，也可進行蠶蛹蛋白肽產品的開發。

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Effect of Ultrafiltration on Sensory Quality of Peptides Derived from Silkworm Pupa Protein

ZENG Yitao1， LUO Jinfeng1， DING Xiaowen1，*， HUANG Xianzhi2
（1. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Storage， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400715， China； 2. Institute of Sericulture and Systems Biology， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Objective： To analyze properties of peptides produced by enzymatic hydrolysis of silkworm pupa protein. Methods： The peptides from silkworm pupa protein by enzymatic hydrolysis were separated and purified by ultrafiltration and the volatile components were measured by GC-MS. Results： The lightness （L*）， redness （a*） and yellowness （b*） of three separated fractions （5.0 mg/mL） followed the decr easing order of higher than 3 000 D ＞ enzymatic hydrolysate ＞200-3 000 D. Furthermore， the color of the hydolysate and its higher and smaller-molecular-weight fractions was medium，dark and light yellow， respectively， without any significant changes after sterilization at 121 ℃ （P ＞ 0.05）.The 200-3 000 D fraction had the highest hygroscopicity （42.24%） followed by the hydrolysate， and the lowest hygroscopicity was noted for the ＞ 3 000 D fraction. The silkworm pupa protein smelled unpleasant and was hydrolyzed into the 200-3 000 D fraction with a meat-like aroma and the ＞ 3 000 D fraction with a sweet fruit-like fragrance. Conclusion： The sensory properties of peptides derived from silkworm pupa protein are improved by ultrafiltration.

silkworm pupa-derived peptide； ultrafiltration； properties； antioxidant capacity

TS218

A

1002-6630（2015）15-0029-06

10.7506/spkx1002-6630-201515007

2014-10-08

國家現代農業（蠶桑）產業技術體系建設專項（CARS-22-ZJ0503）

曾藝濤（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：278436891@qq.com

丁曉雯（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：xiaowend@sina.com