脂肽類生物表面活性劑Surfactin的乳化性

戴 超，郭芳芳，陸兆新，別小妹，張 充，呂鳳霞*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

脂肽類生物表面活性劑Surfactin的乳化性

戴 超，郭芳芳，陸兆新，別小妹，張 充，呂鳳霞*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

采用白金板法對Surfactin的表面活性進行研究，并用濁度法和離心法對其乳化性進行研究。結果表明：Surfactin的臨界膠束濃度為9.03×10－5mol/L，可將水的表面張力由73.98 mN/m降至最低27.48 mN/m。在濃度為1×10－3～1.2×10－2mol/L的NaCl溶液中，Surfactin溶液的表面張力隨鹽濃度升高逐漸降低并最終穩定在34 mN/m；Surfactin在121 ℃處理20 min后，其表面張力仍能保持在37.10 mN/m；在pH值為2～12范圍內，其表面活性穩定并良好；表明Surfactin具有較強的NaCl濃度、溫度、pH值的耐受性。濁度法測得Surfactin親水親油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值為14，對所需HLB值為12～16的油相乳化性能良好。

脂肽類生物表面活性劑；Surfactin；乳化性；親水親油平衡值

脂肽類生物表面活性劑（lipopeptides biosurfactants）主要是由芽孢桿菌產生的一類胞外分泌的次級代謝產物。它們具有生物相容性、生物降解性、較高的表面活性及抗菌活性等特性，其超強的表面活性被廣泛應用于石油開采、環境治理、生物醫療、農業、化妝品和食品工業等領域。乳化劑是表面活性劑中的一種，是食品工業上不可或缺的食品添加劑種類之一，有分散不相溶兩相物質的能力［1-2］。Surfactin的結構中有著親水的氨基酸殘基基團和疏水的脂肪烴鏈，這決定了Surfactin具有乳化劑的性質［3］。這顯示了它在食品工業中具有巨大的應用前景，比如與淀粉結合，改善產品質構；阻止小液滴互相凝結，改善產品穩定性；與蛋白質相互作用，增進面團的網絡結構，增強韌性等［4-6］。由于不同結構的生物表面活性劑其物理化學性質，如表面活性、最適pH值和對熱的穩定性等不同，這也就決定其功能和應用領域。目前，對脂肽類表面活性劑研究較多的是表面活性素（surfactin），Surfactin雖應用廣泛，但多用于原油的開采和環境治理上，關于其乳化性的應用報道甚少。因此，對脂肽類生物表面活性劑的乳化性等相關性質進行研究對其今后的應用具有重要的現實意義。同時，Surfactin具有的乳化性和抗菌性符合功能性食品和綠色食品添加劑的要求，因而本實驗采用白金板法對Surfactin的表面活性進行了研究，并用濁度法和離心法對其乳化性進行了研究，細化地研究Surfactin的乳化性，為其在食品以及化妝品等行業中巨大的潛在應用價值提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Surfactin樣品由淀粉液化芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）fmb50發酵分離純化制得。

松節油 上海運佳黃浦制藥有限公司；豆維家大豆油南京邦基糧油有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

AY120電子精密天平 日本Shimadzu公司；Dragon-med移液器 大龍興創實驗儀器有限公司；Orion 3 STAR pH計 美國Orion公司；HYG-A全溫搖瓶柜 太倉實驗設備廠；Centrifuge 5804R冷凍離心機德國Eppendorf公司；BC/BP-225SB海爾冷柜 海爾集團；LABOROTA-4001旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；B25系列乳化機 上海貝而特流體設備有限公司；DCAT21型表面張力儀 德國Dataphyscis公司。

1.3方法

1.3.1Bacillus amyloliquefaciens fmb50的發酵

取菌種fmb50斜面置于37 ℃培養箱活化18～24 h，從斜面挑取兩環接種于一級種子培養基（1 L搖瓶，裝液量200 mL），搖床（33 ℃、180 r/min）培養18～24 h，從一級種子液中以體積分數3%的接種量接種于二級種子液，再從二級種子液中相同的接種量接種于基礎發酵培養基（100 L發酵罐，裝液量60 L），在33 ℃、200 r/min、罐壓0.045 MPa的條件下培養36 h。

1.3.2臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）的測定

采用Whilhelmy白金板法測定表面張力，將制備液相純化的Surfactin同系物混合并測定含量（10.75 g/L）稀釋至不同倍數：30、40、50、60、80、100、150、250、500、1 000、2 000、4 000、6 000 倍；對應為358.33、268.75、215.00、179.17、134.38、107.50、71.67、43.00、21.50、10.75、5.38、2.69、1.79 mg/L。測定添加以上質量濃度Surfactin純水的表面張力；并根據表面張力的變化趨勢確定CMC。

1.3.3NaCl濃度對Surfactin溶液表面張力的影響

配制1×10－3、2×10－3、4×10－3、6×10－3、8×10－3、10×10－3mol/L濃度的NaCl溶液，并以水做對照，測定Surfactin質量濃度為10.75 mg/L的水表面張力。

1.3.4溫度對Surfactin溶液表面張力的影響

在20、40、60、80、100、121 ℃溫度條件下，處理10.75 mg/L的Surfactin溶液20 min；冷卻至室溫，測定其表面張力。

1.3.5pH值對Surfactin溶液表面張力的影響

在pH 2、4、6、8、10、12條件下測定10.75 mg/L的Surfactin溶液的表面張力。

1.3.6乳化性和乳化穩定性的測定

1.3.6.1濁度法

配制0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/100 mL的Surfactin樣品，每10 mL樣品溶液加入3 mL大豆油，10 000×g乳化10 s，立即從底部取樣20 μL并加入0.1%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）20 mL測定500 nm波長處的吸光度（A0）作為乳化性（emulsifying activity，EA）［7］，同樣的方法，在15 min后測定A15。乳化穩定性（emulsify stability，ES）［8］的計算見下式。

式中：A0為0時刻的吸光度；ΔT為時間差/min，此處取5 min；ΔA為ΔT內的吸光度差，即ΔA = A0－A15。

1.3.6.2離心法

配制0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 g/100 mL的Surfactin樣品，每10 mL樣品溶液加入5 mL所需親水親油平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB）值為14的油相，振蕩乳化10 s后立即于3 000 r/min分別離心5 min和10 min，測定乳化層高度，其中離心5 min后測定乳化層高度并按下式計算得EA，離心10 min后測定乳化層高度，按下式計算得ES［9］。

式中：h'為液體總高度/cm；h為離心5 min或10 min后乳狀層高度/cm。

1.3.7HLB值的測定

用大豆油（所需HLB = 6）和松節油（所需HLB = 16）配制成所需HLB值分別為6、8、10、12、14、16的油相。每15 份油相中加入5 份質量濃度為0.1 g/100 mL的Surfactin樣品，振蕩乳化10 s，立即從底部取樣20 μL并加入0.1 g/100 mL的SDS 10 mL，取樣在500 nm波長處測定吸光度。其中乳化穩定性最好的油相所需HLB值就是Surfactin樣品的HLB值［10-11］。

2　結果與分析

2.1CMC的測定結果

當表面活性劑在溶液中的質量濃度達到一個定值會自發聚集成膠束，表面活性劑的這一質量濃度叫做CMC［12］。所以通過對液體表面張力變化的測定就可以測出某種表面活性劑的CMC。本實驗采用白金板法測定CMC，將Surfactin稀釋成13 種質量濃度，測定各質量濃度Surfactin溶液的表面張力，根據表面張力的變化趨勢確定CMC，結果如圖1所示。

圖1　不同Surfactin質量濃度下溶液的表面張力Fig.1 Surface tension of surfactin at different concentrations

由圖1可知，純水的表面張力為（73.98±0.02） mN/m，隨著Surfactin質量濃度的增加，溶液的表面張力顯著下降，當質量濃度大于91.38 mg/L時，溶液的表面張力基本保持不變，維持在27.48 mN/m。表明Surfactin的CMC為 9.03×10－5mol/L。

2.2NaCl濃度對Surfactin溶液表面張力的影響

圖2　NaCl濃度對Surfactin溶液表面張力的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration on surfactin surface tension

由圖2可知，隨著NaCl濃度由低升高，溶液的表面張力逐漸減小，最低（NaCl濃度14×10－3mol/L）降至33.768 mN/m。即在濃度為1×10－3～1.2×10－2mol/L的NaCl溶液中，Surfactin溶液的表面張力隨NaCl濃度升高逐漸降低并最終穩定在34 mN/m，說明Surfactin對NaCl濃度具有較高的耐受性［13］，在較高的NaCl濃度下仍具有較強的表面活性，為其在食品工業中的應用提供依據。

2.3溫度對Surfactin溶液表面張力的影響

圖3　溫度對Surfactin溶液表面張力的影響Fig.3 Effect of temperature on surfactin surface tension

由圖3可知，Surfactin在20～100 ℃溫度處理后表面活性穩定在36 mN/m左右，121 ℃時表面張力略有增大，達到37.1 mN/m，說明高溫高壓同時作用會分解少量的Surfactin。但總體來看，Surfactin還是具有優良的熱穩定性［14］。

2.4pH值對Surfactin溶液表面張力的影響

圖4　pH值對Surfactin溶液表面張力的影響Fig.4 Effect of pH on surfactin surface tension

由圖4可知，Surfactin在pH值為2～12的水溶液中表面活性穩定，表面張力穩定在29～33 mN/m之間。在pH值為2～4時，溶液表面張力略有上升，其中pH值為3時表面張力最大（32.80 mN/m），這大概是因為Surfactin的等電點接近3，在該pH值附近Surfactin的溶解度較低所導致的［15］。

2.5HLB值的測定結果

為了鑒別Surfactin是水包油（O/W）還是油包水（W/O）型的乳化劑，需對其HLB值進行測定，在HLB值分別為6、8、10、12、14、16的油相中測定，結果見圖5。

圖5　Surfactin對不同油相的乳化性和乳化穩定性Fig.5 Emulsify capacity and emulsion stability as a function of HLB value of oil phase

由圖5可知，Surfactin在不同油相中具有不同的乳化性和乳化穩定性。在所需HLB值為6～10的油相中，Surfactin表現出較弱的乳化性，在HLB值為12～16的范圍的油相內，Surfactin的乳化性逐漸增強達到最大，并維持在穩定的范圍內［16］。Surfactin的乳化穩定性表現在所需HLB值為12、14、16的油相中較強，在HLB值為14時最為穩定，由此說明Surfactin的HLB值約為14，是O/W型的乳化劑，同時說明Surfactin在所需HLB值為12～16的油相中有較強的乳化性且具有最好的乳化穩定性。

2.6乳化性和乳化穩定性的測定結果

2.6.1濁度法測定的乳化性和乳化穩定性

圖6　濁度法測得Surfactin的乳化性與乳化穩定性Fig.6 Emulsifying properties of surfactin determined by turbidimetry

濁度法通過測定乳濁液在破乳的過程中的濁度比來反映液體的乳化性能，濁度比作為時間的函數，簡單快捷、準確性較高，其測定結果如圖6所示。隨著Surfactin質量濃度的升高，乳化性增強，乳化穩定性在0.2～1.2 g/100 mL范圍內迅速上升，當Surfactin質量濃度達1.6 g/100 mL時，乳化性和乳化穩定性達到最大并趨于穩定，說明Surfactin的質量濃度≥1.6 g/100 mL時，表現出較好的乳化性和乳化穩定性。

2.6.2離心法測定的乳化性和乳化穩定性

離心法是將乳濁液快速離心，測定乳化層高度與總高度之比，適于快速測試和實驗室快速評價，進一步確定Surfactin乳化的最佳質量濃度，結果見圖7。

圖7　離心法測得Surfactin的乳化性與乳化穩定性Fig.7 Emulsifying properties of surfactin determined by centrifugation

由圖7可知，隨著Surfactin質量濃度的上升，乳化性和乳化穩定性也呈逐漸上升的趨勢，在Surfactin質量濃度為1.6 g/100 mL處達到最大并維持穩定，這與濁度法的測定結果一致［17］，進一步佐證Surfactin的最佳乳化質量濃度為1.6 g/100 mL，且此質量濃度下Surfactin具有較好的乳化穩定性［18］。

3　討 論

Surfactin具有的獨特雙親特性，雙親分子會自動形成極性基向水碳氫鏈向內的集合體形成膠束。本研究中，Surfactin質量濃度低于CMC時，若增加Surfactin的質量濃度，Surfactin將迅速聚集在水面，使水和空氣的接觸面減小，表面張力急劇下降，直到達到臨界膠束濃度后，表面張力不再降低。這是因為繼續增加Surfactin質量濃度只能使水溶液中的Surfactin分子以幾十或幾百個單體聚集成膠束，由于膠束存在于液面以下，不具有降低水表面張力的作用，故表面張力不會進一步降低［19-21］。本實驗測得Surfactin的臨界膠束濃度為9.03×10－5mol/L，這與Peypoux等［22］報道的［Ile2，4，7］ Surfactin CMC濃度為9.0×10－5mol/L相一致。

目前已經報道的產生物表面活性劑的微生物雖然較多，但其中大多數微生物產生表面活性劑的能力較弱，發酵液的表面張力主要集中在30～35 mN/m之間［23］。Surfactin的表面活性極強，可將水的表面張力由72 mN/m降到27 mN/m，C13～C15中不同碳鏈的Surfactin同系物所表現出來的這一活性也是不同的，Razafindralambo等［24］的研究表明，C15的Surfactin具有最強的表面活性，6.76×10－5mol/L的濃度即可將水的表面張力降至33.84 mN/m，而C14和C13則分別在34.45 mN/m和37.85 mN/m，這說明C鏈越長，其表面活性越強。李翌等［25］也通過對微極性以及膠束粒徑和形態的研究發現Surfactin的表面活性是隨著脂肪鏈長度的增加而增加的，并且在溶液中傾向于形成更大的聚集體。而本研究所用Surfactin大部分為C14，是C13、C14和C15的混合物，在6.09×10－5mol/L的濃度下可將水的表面張力降至31.92 mN/m，與Razafindralambo等［24］的研究結果較為吻合。在NaCl溶液中，由于Na+與Surfactin肽鏈上的-COO-相結合，使得親水基團數由2.1（-COOH）上升至19.1（-COONa），這大大加強了Surfactin的親水性，使得在該溶液表面張力表現為降低［26］。

純化的Surfactin具有較高的HLB值為14，并在所需HLB值為12～16的油相中乳化性能良好。因此，Surfactin良好的乳化性和乳化穩定性顯示了其在食品中的應用價值，尤其是Surfactin高的HLB值，使其適宜用于O/W的油水體系中［27］，例如花生、核桃等乳飲料的制作，鑒于其較好的抑菌性［28］，對食品的防腐保鮮也起到了作用，這些都將為Surfactin工業化生產和應用提供依據。

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Emulsifying Properties of Lipopeptide Biosurfactant Surfactin

DAI Chao， GUO Fangfang， LU Zhaoxin， BIE Xiaomei， ZHANG Chong， L? Fengxia*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

The activity of the lipopeptide biosurfactant surfactin was measured by Wilhelmy plate method and its emulsifying properties were investigated by turbidimetry and centrifugation. The results showed that the critical micelle concentration （CMC） of surfactin was 9.03 × 10-5mol/L， and it could reduce the surface tension of water from 73.98 mN/m to 27.48 mN/m. When sodium chloride was present at a concentration between 1 × 10-3mol/L and 1.2 × 10-2mol/L， the surface tension of surfactin solution decreased with increasing salt concentration and stabilized at 34 mN/m finally. The surface tension of surfactin after treatment at 121 ℃ for 20 min remained at 37.10 mN/m； surface activity of surfactin revealed a good stability in the pH range of 2-12. Therefore， surfactin has a strong tolerance to salt， temperature， and pH. Hydrophile-lipophile balance （HLB） value measured by turbidimetry was 14， and surfactin had good emulsifying properties for oil phase that required an HLB value between 12 and 16.

lipopeptide biosurfactant； surfactin； emulsifying properties； hydrophile lipophilic balance （HLB）

TS201.3

A

1002-6630（2015）15-0040-05

10.7506/spkx1002-6630-201515009

2014-09-18

“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2011BAD23B05）

戴超（1988—），男，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：790192009@qq.com

呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：lufengxia@163.com