涼州熏醋釀造中高產乙偶姻醋酸菌菌株篩選及其發酵條件優化

趙洪源，贠建民，邵曉慶，齊 丹

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

涼州熏醋釀造中高產乙偶姻醋酸菌菌株篩選及其發酵條件優化

趙洪源，贠建民*，邵曉慶，齊 丹

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

四甲基吡嗪是傳統發酵食品中重要風味物質，而乙偶姻（acetoin，ACT）是其生物合成前體。本實驗從涼州熏醋醋醅中分離出了200 株產酸菌株，利用Voges-Proskauer（V-P）顯色反應法初篩得到了28 株產乙偶姻的菌株，用火焰離子化檢測器結合氣相色譜（gas chromatograph-fl ame ionization detector，GC-FID）法復篩得到了一株高產乙偶姻的菌株C92，經生理生化和16S rRNA鑒定為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。在單因素試驗基礎上使用Design-Expert設計響應面優化試驗，得到最佳發酵條件為培養溫度31.31 ℃、接種量8.27%、pH 6.55、搖床轉速209 r/min，此條件下乙偶姻產量最大，達到19.04 g/L，比原始發酵產量高35.8%，證明C92菌株是一株在食醋釀造過程中具有潛在應用價值的菌株。

涼州熏醋；巴氏醋酸桿菌；乙偶姻；響應面優化

涼州熏醋因其獨特的風味而聞名［1］，如何增加傳統發酵食醋的風味已成為近年來的研究熱點［2-3］。前期研究表明，涼州熏醋的特征性風味物質主要為揮發性的四甲基吡嗪，它與其他揮發性成分共同作用，是使涼州熏醋呈現后味厚重悠長特點的物質基礎［4］。乙偶姻（acetoin，ACT）又名3-羥基-2-丁酮，是多種微生物糖代謝的中間產物，是傳統發酵食品重要香氣成分四甲基吡嗪生物合成的前體物質［5-6］。

近年來，有關傳統發酵食品中功能性物質的來源及機理已成為本領域研究的重點，如Besson［7］、Larroche［8］等研究發現，通過添加外源的蘇氨酸和乙偶姻可以有效提高四甲基吡嗪產量，并對四甲基吡嗪經微生物代謝途徑的形成機理進行了研究且兩種物質的關聯性極大［9］。但外源添加過量乙偶姻，則會導致產物抑制現象和細胞毒性，細胞代謝平衡紊亂［10］，導致前體乙偶姻的利用率很低［7］。Zhu Bingfeng等［11］對中國白酒中四甲基吡嗪的微生物產生途徑及代謝機理進行了深入研究，驗證了中國白酒中四甲基吡嗪產生的主要途徑來源于微生物的代謝反應，并非美拉德反應，并證明了乙偶姻和氨是發酵生產四甲基吡嗪的前體物質［12］，且二者共同作用發生非酶促反應生成了四甲基吡嗪。

醋酸菌在釀醋過程中發揮著產酸的重要功能，并賦予涼州熏醋特殊的風味物質，在釀醋工業中有著極其重要的作用，而目前關于產高產乙偶姻的醋酸菌的報道較少。Xu Wei等［13］在鎮江香醋醋醅中篩選到了1 株產乙偶姻的醋酸菌，Danilo等［14］報道了一株Acetobacter hansenii產乙偶姻量達到8.93 g/L。因此，食醋釀造行業急需開發具有優良風味特性的乙偶姻生產菌株，使其能夠利用還原糖代謝產生并內源積累前體乙偶姻，進而實現高產四甲基吡嗪以提高熏醋風味的目標。因此，開發篩選高產乙偶姻的醋酸菌菌株，優化其發酵工藝，對傳統釀醋工業的現代化改造過程中風味穩定具有十分重要意義。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與培養基

分離材料為甘肅省云曉涼州熏醋傳統食醋釀造料醅。

蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂 上海生物工程技術服務有限公司；葡萄糖氧化酶試劑盒 上海執誠生物技術有限公司；2-庚酮、3-羥基-2-丁酮（均為色譜純） 美國Sigma Aldrich公司；細菌基因組提取試劑盒、普通DNA純化試劑盒 生工生物工程（上海）有限公司；葡萄糖、肌酸、NaOH、K2HPO4、NaH2PO4均為國產分析純。

醋酸菌分離培養基：葡萄糖10.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、瓊脂20.0 g/L、碳酸鈣20.0 g/L，121 ℃濕熱滅菌30 min，待其冷卻為50 ℃后加入3%～5%無水乙醇，分裝于無菌培養皿中，制成碳酸鈣平板分離培養基。

Voges-Proskauer（V-P）培養基（質量分數）：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%，pH值調至7.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。

種子培養基（質量分數）：葡萄糖2.0%、蛋白胨0.5%、酵母膏1.2%、NaCl 0.05%、MgSO40.15%、MnSO40.02%、KH2PO40.1%、（NH4）2SO40.1%，調pH值至7.0，于121 ℃濕熱滅菌20 min。

發酵培養基（質量分數）：葡萄糖8.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏2%、NaCl 0.05%、MgSO40.15%、MnSO40.02%、KH2PO40.1%、（NH4）2SO40.5%，調pH值至7.0，于 121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2儀器與設備

pHS-3C酸度計 上海綠宇精密儀器制造有限公司；HG303-4A電熱恒溫培養箱 北京市光明醫療儀器廠；CS101-1A型電熱鼓風干燥箱 重慶銀河試驗儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器上海三申醫療器械有限公司；CP214電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；GC 6890N氣相色譜儀、DB-WAX色譜柱 美國Agilent Scientific公司；頂空固相微萃取裝置、DVB/CAR/PDMS萃取器 美國Surpelco公司。

1.3方法

1.3.1高產乙偶姻醋酸菌菌株的篩選

1.3.1.1醋酸菌菌株的分離篩選

分離篩選流程：樣品采集→取樣→梯度稀釋→傾注法培養→單菌落分離→醋酸菌定性實驗→菌種鑒定→保藏。

稱取10 g醋醅樣品于已滅菌的裝有90 mL無菌生理鹽水的500 mL三角瓶中， 30 ℃恒溫振蕩 30 min，即為10-1稀釋菌懸液。取1.0 mL 10-1菌懸液于盛有9 mL無菌水的試管中，依次用無菌水稀釋，獲得最終稀釋倍數為10-2～10-7的培養液。選取3 個合適的稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL菌懸液于滅菌培養皿中，每個稀釋度做2 個平行，然后將45 ℃左右的培養基注入平皿中，待瓊脂培養基凝固后，倒置于30 ℃恒溫培養箱中培養96 h［15］。

1.3.1.2高產乙偶姻菌株的篩選［16］

將以從涼州熏醋醋醅中篩選的醋酸菌株接種于裝有50 mL V-P培養基的250 mL搖瓶中，30 ℃條件下150 r/min培養48 h。將發酵液8 000 r/min離心10 min，取上清液加入改良O'Meara試劑，振蕩1～2 min，37 ℃條件下反應60 min，觀察顏色變化，紅色為V-P反應陽性，在最大吸收波長處測定其光密度值，根據光密度值比較初篩菌株的乙偶姻產量。以培養基滅菌后不接種30 ℃培養48 h的樣品為對照。選取初篩乙偶姻產量最高的5 株菌株以氣相色譜法（gas chromatograph，GC）進行復篩，得到產乙偶姻量最高的醋酸菌菌株。

1.3.2篩出菌株的鑒定［17］

1.3.2.1生理生化鑒定

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》［18］，對該產酸菌株進行革蘭氏染色、芽孢有無、接觸酶反應、氧化酶反應、運動性、葡萄糖發酵、乙醇氧化、乙酸氧化、淀粉水解、甘油生酮實驗，產葡萄糖酸、產5-酮基葡糖酸鹽、GYC產水溶性色素、生二酮葡萄糖酸鹽、產γ-吡喃酮實驗等生理生化鑒定。

1.3.2.216S rRNA序列分析測定

將提取的基因組DNA委托生工生物工程（上海）有限公司進行16S rRNA基因擴增序列測序。測序結果提交GenBank數據庫，將得到的16S rRNA序列通過BLAST程序提交，在NCBI在線數據庫中進行同源序列檢索［19］。將目標菌株和應用BLAST檢索到的與之同源性較高菌株的16S rRNA利用GenBank基因序列作最大同源性比較分析。

1.3.3高產乙偶姻菌株發酵條件優化

1.3.3.1單因素試驗優化發酵條件

以初始發酵培養基為基礎發酵培養基，在轉速為150 r/min的條件下，分別對培養溫度、pH值、裝液量和接種量（體積分數）進行單因素試驗（培養溫度分別控制在26、28、30、32、34 ℃；培養基初始pH值分別控制在5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；搖床轉速分別為90、120、150、180、210 r/min；接種量分別控制在3%、5%、7%、9%、11%），發酵時間為48 h，取樣離心，取上清液－20 ℃條件下保存待測。

1.3.3.2響應面優化發酵條件

在單因素條件優化結果的基礎上使用Design-Expert對條件因素進行響應面設計，以得到對菌株發酵產乙偶姻有顯著影響的因素的最佳組合［20-21］。

1.3.4檢測方法

1.3.4.1初篩產乙偶姻的菌株［22］

初篩采用V-P顯色配合分光光度計法，將菌株接種于V-P培養基中，在150 r/min條件下，于30 ℃環境中培養48 h，取上清液1 mL，加入1.0 mL改良O'Meara（含0.3%肌酸、0.5%蛋白胨的40% NaOH水溶液）試劑。搖晃2 min，37 ℃條件下反應60 min后觀察其顏色變化，反應液呈紅色表明有乙偶姻生成。將反應液取出后，搖勻，并測定出反應液在516 nm處具有最大吸收波長。根據516 nm波長處光密 度值的大小判斷各菌株代謝葡萄糖生成乙偶姻的能力。

1.3.4.2火焰離子化檢測器結合氣相色譜（gas chromatograph fl ame ionization detector，GC-FID）復篩高產乙偶姻的菌株

分別配制10、20、40、80、160、320、640 mg/L的乙偶姻標準溶液。分別取5 mL上述溶液，進樣GC 6890N氣相色譜儀測定。發酵液經離心，取上清液稀釋適當倍數，以2-庚酮為內標物，二氯甲烷為萃取劑，進行萃取后通過GC分析定量。氣相色譜條件：色譜柱為DB-Wax（15 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口與檢測器溫度均為250 ℃，載氣為氮氣，流速為2 mL/min，升溫程序：80 ℃恒溫2 min，再以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃。

以乙偶姻與內標物響應值之比為縱坐標，乙偶姻質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為y=0.006 0x－0.017 2（R2=0.999 2）。

2　結果與分析

2.1菌株篩選結果

2.1.1產酸菌株的篩選結果

通過CaCO3透明圈共從涼州熏醋醋醅中篩選出200 株微生物，將每株菌株進行純化并保存在斜面中以供使用。

2.1.2V-P反應初篩結果

經V-P反應得到結果呈陽性的醋酸菌菌株28 株，如表1所示，在516 nm波長處測量其光密度值，選取其中OD516nm最大的菌株C92為初篩菌株。

表1　菌株V-P反應初篩結果Table 1 V-P reaction screening of strains

2.1.3GC-FID復篩高產乙偶姻菌株結果

將初篩菌株接種于裝有50 mL YPG培養基的250 mL搖瓶中，30 ℃培養48 h。將發酵液8 000 r/min離心10 min，用GC-FID法檢測上清液中乙偶姻的含量。以培養基滅菌后不接種30 ℃培養48 h的樣品為對照，結果如表2所示，其中C92菌株發酵產乙偶姻的量達到14.02 g/L，高于其他菌株。

表2　GC-FID復篩高產ACT菌株結果Table 2 GC-FID screening of ACT-producing strains

2.2菌株鑒定

2.2.1菌株的生理生化鑒定結果

表3　篩出菌株生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strain

由表3可知，C92菌株是一株無芽孢、革蘭氏陰性、GYC水溶圈陽性的短桿狀細菌，通過對比，發現該菌株與Acetobacter pasteurianus特性十分相符。

2.2.2菌株的16S rRNA鑒定結果

對篩出的C92菌株進行16S rRNA基因序列分析鑒定［23］，取其基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行電泳檢測，結果如圖1所示。

圖1　C92菌株的16S rRNA基因序列電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR amplified products of 16S rRNA sequence from strain C92

C92菌株基因組DNA經通用引物擴增和瓊脂糖凝膠電泳，在約1 500 bp的位置出現了清晰的條帶。將純化后的PCR產物切膠回收委托生工生物工程（上海）有限公司進行16S rRNA測序，結果顯示該條帶大小為1 412 bp（GenBank登錄號AY883035），提交NCBI數據庫進行BLAST序列比對，與巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）同源性為99.2%，結合菌落形態和生理生化特征鑒定，確定C92為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.3產乙偶姻發酵條件的優化

2.3.1單因素試驗優化發酵條件

圖2　菌株發酵產ACT的單因素試驗結果Fig.2 Effects of culture conditions on the yield of ACT

由圖2A可知，發酵培養基初始pH值為7.0時，C92菌株產ACT的能力最強，表明穩定的發酵培養基初始pH值有利于C92菌株生長及生成相應的酶，過高或過低的pH值會使得C92菌株代謝異常［24］。由圖2B可知，隨著搖床轉速增大，C92菌株發酵產ACT的量隨之增大，在180 r/min達到最大值15.37 g/L，這一結果表明，C92菌株發酵產ACT的量與氧氣的供應成正相關，巴氏醋酸桿菌發酵生成ACT為好氧發酵［16］。由圖2C可知，當培養溫度從26 ℃增加到32 ℃時，ACT產量隨之增加，并且在32 ℃時的產量大約是26 ℃產量的2 倍。然而，當培養溫度增加到34 ℃時，ACT產量出現下降，這可能是由于細胞調節與代謝異常造成的，隨著溫度的升高，菌體代謝產生ACT的關鍵酶活性亦隨之提高，但當溫度超過32 ℃后，菌體及代謝酶受高溫抑制，使ACT產量降低［25］。由圖2D可知，ACT的產量隨菌株接種量的增大而增加，從3%（9.05 g/L）到7%（14.02 g/L）依次增加，然后保持在穩定的水平不變（9%和11%）。

2.3.2菌株產乙偶姻的響應面設計優化結果

2.3.2.1二次響應面回歸模型的建立與分析［26］

根據單因素試驗結果，得到菌株在培養溫度32 ℃、培養基初始pH 7.0、接種量7%、搖床轉速180 r/min時，乙偶姻具有最大產量。采用Design-Expert 8.0軟件，選用中心復合模型，對發酵條件做四因素三水平共30 個試驗點（5 個中心點）的響應面分析試驗，設計方案及結果如表4所示。

經回歸擬合后，得到以發酵液中乙偶姻產量為響應值的回歸方程為Y=－404.169 4+20.734 2A－1.494 7B+ 15.119 4C+0.496 4D+0.076 5AB+0.645 3AC+ 1.806 3×10－3AD－0.147 3BC－3.304 2×10－3BD－0.016 7CD－0.341 7A2－0.306 2B2－1.414 7C2－7.891 0×10－4D2。

表4　響應面試驗設計方案及結果Table 4 Design and results for response surface analysis

用Design Expert 8.0軟件對數據進行多元回歸分析，其方差分析結果見表5。從表中可以看出，該模型在α=0.01的水平上高度顯著，說明模型的預測值和實際值非常吻合，模型成立。各因素中一次項A、B、C、D，交互項AC、BC及二次項A2、B2、C2、D2對乙偶姻產量的影響極顯著（P＜0.01）；交互項 BD 對乙偶姻產量影響顯著（P＜0.05）；而AB、AD、CD的影響不顯著。同時回歸方程相關系數 R2=0.983 1，模型F=62.33，說明響應值的變化有98.31%來源于所選變量，即培養溫度、接種量、培養基初始pH值、搖床轉速4 個因素的變化是造成ACT產量不同的主要原因。回歸方程失擬項P＞0.05，F=1.39，說明未知因素對試驗結果干擾很小。因此，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以用其確定最佳發酵條件。

根據表5中各因素對于菌株生產ACT產量影響的F值，可以看出搖床轉速對菌株發酵產ACT影響最大，培養溫度與培養基初始pH值次之，接種量影響最小。搖床轉速影響到培養基中的溶氧情況，對微生物的生長繁殖及代謝產物的生產都有很重要的影響。

表5　回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance （ANOVA） for response surface model

2.3.2.2各因子交互作用對乙偶姻產量影響的分析

響應面法的圖形是特定的響應值（Y）與對應的因素A、B、C、D構成的一個三維空間在二維平面上的曲面圖，每個響應面對其中兩個因素進行分析，另外兩個因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對響應值的影響，從試驗所得的響應面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用，并通過等高線圖得最優條件下各試驗因子的取值。對培養溫度（A）、接種量（B）、培養基初始pH值（C）、搖床轉速（D）4 個因素的兩兩交互作用分析，做出相應的響應曲面圖。由培養溫度與培養基初始pH值的響應面圖（圖3a）可知，響應曲面坡度陡峭并且等高線扁而十分密集，說明C92菌株發酵產ACT受到培養溫度與培養基初始pH值兩因素間交互作用的影響趨勢較明顯，而由培養基初始pH值與接種量的響應面圖（圖3b）以及搖床轉速與接種量的響應面圖（圖3c）可知，響應曲面坡度陡峭度降低，等高線密集，說明C92菌株發酵產ACT受該兩因素間交互作用的影響，但趨勢度降低。該結果與表5的方差分析結果一致。由圖3d可知，實際值與預測值的擬合度較高，實驗結果真實可靠。

圖3　響應面分析因素間交互作用對ACT產量的影響（a～cc）及實際值與預測值的擬合性（dd）Fig.3 Response surface analysis of the effect of interactions among independent variables on ACT yield （a-c） and fitting of actual and predicted values （d）

2.3.2.3最優實驗條件產量及驗證

通過對回歸模型進行方差分析，得 到C92菌株的最佳發酵產ACT條件為：培養溫度31.31 ℃、接種量8.27%、培養基初始pH 6.55、搖床轉速209 r/min，乙偶姻產量理論值為18.97 g/L。在此條件下，重復3 次實驗，得到乙偶姻實際產量為19.04 g/L。與理論預測值相比，其相對誤差約為0.36%。而且重復性也很好，說明優化結果可靠。因此，該模型設計合理且結果有效，得到的最佳發酵培養條件可靠，可以為實際生產提供有效的指導。

3　結 論

本實驗從涼州熏醋醋醅中分離獲得200 株產酸微生物，通過V-P顯色反應篩選出28 株可以產生乙偶姻的菌株，使用GC-FID定量檢測各菌株產乙偶姻的能力，并對高產菌株進行生理生化及16S rRNA鑒定，確認得到的該高產乙偶姻的菌株為巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）。

在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert 8.0軟件設計響應面實驗優化A. pasteurianus發酵產乙偶姻的條件。通過方差分析可知，實驗中4 個因素對產物產量均有顯著影響，A. pasteurianus發酵產乙偶姻的最佳工藝條件為：培養溫度31.31 ℃、接種量8.27%、培養基初始pH 6.55、搖床轉速209 r/min，此條件下乙偶姻產量最大，達到19.04 g/L，比原始發酵產量高35.8%。因此，本實驗分離篩選出的C92菌株具有提高涼州熏醋發酵風味的潛在價值，在食醋生產過程中應用前景廣闊。

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Isolation of Acetic Acid Bacterium with High Acetoin-Producing Ability from Aerobic Solid-Fermentation Culture of Liangzhou Fumigated Vinegar and Optimization of Its Fermentation Conditions

ZHAO Hongyuan， YUN Jianmin*， SHAO Xiaoqing， QI Dan
（College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

Acetoin （ACT） is the precursor of tetramethylpyrazine， a popular food flavor found in different traditional fermented foods. In our present study， we isolated approximately 200 pure cultures by forming transparent zone on GYC agar medium， and obtained 28 ACT-producing strains from these isolates by Voges-Prosk auer （V-P ） colorimetric assay and gas chromatograph with fl ame ionization detector （GC-FID）. Based on ACT level， C92 strain with the highest yield was selected for further analysis. It was identifi ed as Acetobacter pasteurianus by physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence similarity. We examined ACT level of C92 strain under different conditions and found that the optimal culture conditions that provided maximum ACT yield of 19.04 g/L were 31.31 ℃， pH 6.55， shaking at 209 r/min，48 h and inoculum size of 8.27%， representing a 35.8% increase compared to that before optimization. Therefore， C92 has a promising potential in the production of vinegar.

Liangzhou fumigated vinegar； Acetobacter pasteurianus； acetoin； response surface optimization

TS264.2

A

1002-6630（2015）15-0098-07

10.7506/spkx1002-6630-201515019

2014-11-19

國家自然科學基金地區科學基金項目（31360405）

趙洪源（1987—），男，碩士，研究方向為食品微生物發酵。E-mail：31593229@163.com

贠建民（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物發酵與發酵工程。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn