鯉魚中腐敗希瓦氏菌生長模型的建立和驗證

周 康，楊兆錁，劉書亮，韓新鋒

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

鯉魚中腐敗希瓦氏菌生長模型的建立和驗證

周 康，楊兆錁，劉書亮，韓新鋒

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

利用市售鯉魚中分離鑒定得到的腐敗希瓦氏菌進行了生長動力學模型的建立。通過預測微生物學的方法比較Logistic、Gompertz和Baranyi模型的生物學特性和應用特性，對3 種模型所得參數進而構建了二級模型并分別進行了內部和外部驗證。結果表明：Logistic、Gompertz和Baranyi模型在內部驗證中的r2分別為0.982 4、0.983 6和0.988 4，偏差因子（bias factor，Bf）分別為0.985 0、0.995 0和0.970 0；而外部驗證Bf值分別為0.804、1.177和0.826。Baranyi模型在對微生物生長的預測性上不僅準確，而且能夠更加有效地進行食品安全預警，在實際的農產品和食品領域具有很好的實用價值。

生長動力學模型；內部驗證；外部驗證；腐敗希瓦氏菌

腐敗希瓦氏菌是水產品中最常見的一類腐敗菌，在低溫中可以存活并生長，不僅能導致食品腐敗，還能引起人類患病［1］，嚴重地影響著水產業及其農副業的生產和銷售［2］。因此，如何保證水產品及其農副產品的質量，防止食物中毒就顯得尤為重要。一般而言，采用預測微生物學的方法對食品和農產品中的微生物進行預測是現在國內外公認的可行方法之一［3］。

在國內的預測微生物學研究中，多采用Logistic［4］和Gompertz模型［5］，而采用Baranyi模型進行研究的報道還相對較少［6］，而在國外已有大量文獻在使用該模型［7-9］，尤其是全球最大的開源微生物預測數據庫Combase中也全部都采用Baranyi模型進行擬合回歸［10］。因而對這一模型進行深入和全面的研究，了解其生物學意義和數學特性對于實際中應用預測模型進行安全預警是十分必要的。

本實驗比較了Logisitc、Gompertz和Baranyi模型，通過內部驗證和外部驗證發現Baranyi模型具有更好的預測效果和生物學性能，能夠為食品和農業中微生物引起的危害起到良好的預警效果。

1　材料與方法

1.1菌種與培養基

腐敗希瓦氏菌分離自市售鯉魚，經生理生化鑒定及分子鑒定為腐敗希瓦氏菌，四川農業大學食品學院實驗室保藏。經30 ℃活化3 次后用于生長動力學實驗。

選用胰蛋白胨大豆肉湯（tryptose soya broth，TSB）培養基和胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養基分別作為微生物生長和計數培養基。

1.2方法

將活化好的菌株按10 倍梯度稀釋后，以約為103CFU/mL的接種量接種于TSB中培養，選擇適當時間取樣測定其生長動力學曲線。每次實驗取3 個稀釋梯度，每個稀釋梯度3 個平行。實驗所選溫度為：4、10、20、30 ℃和37 ℃。

1.3模型的建立

1.3.1一級模型的建立

分別采用Logistic模型（公式（1））、修正Gompertz模型（公式（2））［11］和Baranyi模型（公式（3））［12］對數據進行擬合和比較。采用Microsoft Excel軟件中的規劃求解以最小二乘法的原理進行擬合。

式中：x（t）為微生物在時間t時的數量（lg（CFU/mL））；A為隨時間無限減小時漸進對數值；B為相對最大生長速率/h－1；C為隨時間無限增加時菌的增量（lg（CFU/mL））；D為達到相對最大生長速率所需要的時間/h。

其中

式中：y（t）為微生物在時間t時的自然對數值（ln（CFU/mL））；y0為微生物的初始濃度（ln（CFU/mL））；ymax為微生物的最大濃度（ln（CFU/mL））；μmax為最大生長速率/h－1；v為底物限值參數；h0為初始生理狀態參數α0的對數形式，

1.3.2二級模型的建立

采用Ratkowsky模型（公式（4））對一級模型所獲得的最大生長速率（μmax）進行二級模型的建立。采用Microsoft Excel中的規劃求解進行二級模型的建立。

將一級模型求得的μmax和對應的溫度變量代入上式中，擬合出模型參數

1.3.3模型的驗證

驗證采用內部驗證和外部驗證同時進行。本實驗從Combase數據庫中選擇了基本符合本實驗條件的32 組數據進行外部驗證，其中25 組是從培養基中獲得的數據，7 組是從食品中獲得的數據。選擇外源數據進行驗證，不僅能說明本實驗所建模型的準確程度，還能體現模型的安全性，說明其在實際中進行預測的潛在價值。

通過判定系數r2、均方誤差（mean square error，MSE）、偏差因子（bias factor，Bf）和準確因子（accuracy factor，Af）來驗證模型，公式如下［15-16］：

2　結果與分析

2.1一級模型的建立

腐敗希瓦氏菌在4 ℃依然可以緩慢的生長，其生長速率根據Logistic、Gompertz和Baranyi模型求得分別為0.051、0.035、0.042 h－1。在37 ℃時根據Baranyi模型求得的生長速率為0.337 h－1，較30 ℃條件下0.446 h－1緩慢，這也與腐敗希瓦氏菌的一般生長情況近似。各一級模型與觀測數據擬合情況如圖1所示，其判定系數r2均高于0.96，可知3 種一級模型均可很好地對數據進行擬合回歸。

圖1　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下生長曲線及各一級模型擬合曲線Fig.1 Growth curves and predictive model of Shewanella putrefacens at different temperatures

2.2二級模型的建立

使用最大生長速率、延滯期和最大生長量等參數進行二級模型建立的研究已經有很多了，本實驗重點在于以內部驗證和外部驗證方法，來比較3 種一級模型的預測性能和生物學特性，因而僅選擇其中最大生長速率進行二級模型的建立，其模型參數如表1所示。

表1　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下的二級模型參數Table 1 Parameters of the secondary models

由表1可知，采用Baranyi模型獲得的最大生長速率略高于Logistic和Gompertz模型獲得的最大生長速率。因此在二級模型的建立時，其Tmin和Tmax都略高于另外兩種模型。此外，在二級模型的整體預測中（圖2），Baranyi模型也較Logistic和Gompertz模型所預測的最大生長速率快一些，而Gompertz模型則將最大生長速率預測得較慢。

圖2　溫度對不同一級模型所獲得的最大生長速率的影響Fig.2 Effect of temperature on the maximum growth rate estimated from different primary models

2.3模型的驗證

2.3.1內部驗證

模型驗證比較了3 種一級模型的數學和生物學特性。內部驗證通過本實驗所得數據與所建立的預測模型進行比較，確定和比較各一級模型的準確性和安全性；外部比較是以其他研究者已經發表的數據與本實驗所建立的預測模型進行比較，從而確定本研究所得各一級模型的實用性和安全性。驗證僅就最大生長速率進行討論，不涉及其他一級模型中的參數。

表2　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下二級模型的內部驗證Table 2 Internal validation of the secondary models

由表2可知，r2（0＜r2＜1）越大說明建立的模型與實際測量越接近；MSE（MSE＞0）越小，說明建立的模型與實際測量越接近，但是由于Baranyi模型采用自然對數對數據進行處理，因此其MSE值較Logistic模型和Gompertz模型要高（ln10）2。

Bf是描述觀測值所處位置為預測值所構成曲線的上方、下方還是正好在曲線上的參數，同時該值還能度量觀測值與預測值之間存在差距的大小，即該模型結構性誤差的多少。當該值小于1時，即平均預測值大于平均觀測值，說明該模型安全。

Af描述了各觀測值所得到的點與預測值構成的曲線之間的平均距離。Af越大說明模型平均準確性越低，當該值為1時說明觀測與預測完全吻合，當該值為2時說明預測與觀測之差大致為2 h－1［15-16］。

在內部驗證中，基于Baranyi模型建立的二級模型具有有更大的r2，其MSE和Af綜合起來也優于另外兩種模型。此外，由于Bf是預測模型是否安全的重要判斷依據［17］，因此，在可接受的范圍內，較大的μ預測可以更早地預警某種微生物快速生長所引起的食品危害，達到保證食品安全的目的，因此根據Bf公式可知該值越小其模型越具有預警的效果［18］。

一般認為Bf值在0.90～1.05的范圍之內，該模型能夠很好地預測微生物生長速率和生長狀況；Bf值在0.70～0.90或者1.06～1.15范圍之內，則該模型是可以被接受的；如果Bf值大于1.15或者小于0.70，則說明該模型是失敗的［16］。也有研究者認為，在水產品貨架期的預測中，Bf介于0.75～1.25之間也可認為模型是可靠、實用的［19-20］。

2.3.2外部驗證

對二級模型的外部驗證可以通過其他實驗數據來進行，以驗證本研究獲得模型的安全性，進而知道該模型在生產和監控應用中是否能夠具有很好的實用性，也可在一定程度上體現模型的準確性。

圖3　腐敗希瓦氏菌在不同溫度條件下二級模型的外部驗證Fig.3 External validation of the secondary models

由圖3可知，在以Baranyi模型為基礎的二級模型中，散點多分布于對角線上側，說明基于該模型建立的二級模型所得到的預測值較觀測值普遍要大。而Gompertz模型所得散點多分布于對角線下端，說明其預測的μmax較小。基于Logistic、Gompertz和Baranyi模型建立的二級模型在外部驗證時，其Bf值分別為0.804、1.177、0.826。說明在安全性上，Logistic和Baranyi模型優于Gompertz模型，而在準確性上，Baranyi模型優于Logistic模型。

3　結 論

本實驗針對鯉魚中的腐敗希瓦氏菌采用Logistic、Gompertz和Baranyi模型獲得了在不同溫度下的μmax，并對μmax進行了二級模型的建立。在本實驗的一級模型建立中，3 種模型都可較好地擬合了微生物生長。但是在二級模型的驗證中，Baranyi模型的性能要優于其他兩種模型，這也與近年來對于Baranyi模型的研究結果相一致［21-22］。本實驗通過內部驗證和外部驗證對3 種一級模型進行比較，在內部驗證中，Baranyi模型具有更好的安全性和準確性，在外部驗證中Baranyi模型也具有更好的安全性和實用性。

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Modeling and Validation of the Growth of Shewanella putrefaciens from Cyprinus carpio

ZHOU Kang， YANG Zhaoke， LIU Shuliang， HAN Xinfeng
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an 625014， China）

A strain isolated from marketed common carp （Cyprinus carpio）， identified as Shewanella putrefacens by biological and molecular identification methods， was used in the growth modeling study. The obtained data were fitted with three different primary models including Logistic， Gompertz and Banrayi models and the fitted models were validated with coefficients of determination （r2） of 0.982 4， 0.983 6 and 0.988 4， as well as bias factor （Bf） of 0.985 0， 0.995 0 and 0.970 0 in the internal validation and 0.804， 1.177 and 0.826 in the external validation， respectively. The results showed that the Baranyi model not only had a goodness-of-fit， but also could provide effective early warnings of microbial food safety risks. Therefore， the Baranyi model has a great potential for application in agricultural products and foods.

growth kinetic model； internal validation； external validation； Shewanella putrefacens

TS254

A

1002-6630（2015）15-0147-04

10.7506/spkx1002-6630-201515027

2014-09-09

四川省教育廳科研項目（13ZA0265）

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：kang_zhou@163.com