鴨肝乳酸脫氫酶的分離純化及部分性質研究

方 玲，孫才云，唐云明

（西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715）

鴨肝乳酸脫氫酶的分離純化及部分性質研究

方 玲，孫才云，唐云明*

（西南大學生命科學學院，淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715）

新鮮鴨肝經勻漿、磷酸鹽緩沖液抽提，乙醇和硫酸銨分級沉淀，DEAE-Sepharose離子交換層析及Superdex-200凝膠過濾層析，獲得電泳純的乳酸脫氫酶。該酶經純化后酶比活力達到668.82 U/mg，酶活回收率為25.79%，純化倍數為185.78。該酶的全分子質量約為170.93 kD，亞基分子質量為44.72 kD；最適反應溫度為45 ℃，最適pH值為7.4，在25～45 ℃及pH 5～10的范圍內穩定性較好；在45 ℃、pH 7.4條件下，測得該酶對底物還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）的Km值為3.407 μmol/L，對丙酮酸鈉的Km值為8.431 μmol/L；草酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Cu2+、Ag+對該酶的抑制作用最強，Co2+、K+對該酶有雙重作用，低濃度時有激活作用，而高濃度時具有抑制酶活性的作用。

鴨肝；乳酸脫氫酶；分離純化；性質

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH，EC1.1.1.27）又稱煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）氧化酶，廣泛存在于動植物體內，是生物體內進行糖酵解過程的重要酶之一，主要催化丙酮酸和乳酸之間的可逆轉化［1-2］。該酶在動物體內主要存在H、M、C 3 種亞基，H、M兩個亞基組成了LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5（M4）5 種同工酶，LDH-C4是由C亞基組成的四聚體，LDH同工酶在生物體內的分布具有組織特異性［2-3］，LDH1在動物心臟及腎中含量較高，LDH5在骨骼肌及肝臟中占主要優勢，肺中以LDH3、 LDH4為主，而LDH-C4主要存在于雄性成熟個體的精子及睪丸中［4］。

LDH是重要的醫學診斷用酶，現廣泛用于生產丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒，丙酮酸鹽的檢測，肝病、心肌梗死、白血病及肺梗塞的診斷，還可用作發酵奶制品、鹽漬品和飲料生產中的食品添加劑。目前已有多種來源的LDH同工酶的研究報道［5-9］，但對鴨肝中LDH分離純化的研究未見報道。我國鴨肉的年總產量約占世界總量的70%，是世界上最大的鴨肉生產和消費國［10］。鴨肝是鴨肉加工過程中總量較多的副產品，價格低廉、易取材，而且LDH在鴨肝中含量十分豐富。故本研究以來源廣泛的鴨肝為材料，從中分離純化LDH并對其部分酶學性質進行研究，旨在為LDH的更深入研究及工業化生產提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

四川麻鴨（Anas platynchos）肝臟：將購自重慶市北碚區菜市場活的四川麻鴨殺死后立即取出肝臟，于－20 ℃保存備用。

考馬斯亮藍R-250 美國Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 香港Farco公司；DEAE-Sepharose離子交換層析標準品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白質標準品、Superdex-200凝膠層析分子質量標準品 美國GE Healthcare公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺 瑞士Fluka公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

UV-2550型分光光度計、蛋白核酸定量儀 日本島津公司；MC4L冷凍干燥機 德國Uni Equip公司；Mill-Q plus超純水儀 美國Millipore公司；PHS-32W微電路pH計 上海理達儀器廠；精密電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南長沙湘儀檢測設備有限公司；AKTA Prime Plus蛋白質純化系統 美國GE公司；垂直板電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1鴨肝LDH粗酶液的制備

將新鮮的鴨肝除去結締組織和脂肪，稱取100 g，按1∶4（m/V）的比例加入預冷的0.05 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），勻漿后放于4 ℃冰箱中靜置抽提4 h，然后12 000 r/min離心40 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2乙醇及硫酸銨分級鹽析

向粗酶液中加入體積分數30%的無水乙醇，4 ℃冰箱靜置1 h，12 000 r/min離心35 min，棄沉淀取上清液，向上清液中加入硫酸銨粉末至35%飽和度，4 ℃冰箱中靜置鹽析2 h，12 000 r/min離心35 min，棄沉淀收集上清液，再向其中加入硫酸銨粉末至60%的飽和度，4 ℃靜置鹽析2 h，6 000 r/min離心30 min，收集沉淀，沉淀用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）溶解，4 ℃透析24 h即為初酶液。

1.3.3DEAE-Sepharose離子交換層析

用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）平衡好離子交換層析柱后，取初酶液10 mL上柱，用0～0.5 mol/L的NaCl溶液（含0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4））進行線性梯度洗脫，流速0.65 mL/min，每管收集6.5 mL；測定各管LDH活力和蛋白質含量，收集活性較高的各管酶液，于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.4Superdex-200凝膠過濾層析

用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）平衡Superdex-200凝膠過濾層析柱后，取1.3.3節收集的活力較高的LDH酶液4 mL上柱，用0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集3 mL；測定各管LDH活力和蛋白質含量；收集活性較高的酶液，4 ℃超純水透析脫鹽24 h，冷凍干燥后于－20 ℃冰箱保存備用。

1.3.5鴨肝LDH活力的測定

參照文獻［11-12］的方法測定LDH活力：LDH在催化丙酮酸鹽轉化為乳酸鹽的同時，將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）氧化為NAD，使得體系在340 nm波長處的吸光度不斷減小。酶活力單位（U）定義為：在25 ℃、pH 7.4條件下，每分鐘氧化分解1 μmol NADH所需的酶量為一個酶活力單位。反應體系：0.05 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）2.8 mL、6.6 mmol/L NADH 0.1 mL、30 mmol/L丙酮酸鈉0.1 mL、酶液0.1 mL，25 ℃水浴5 min。連續測定反應體系在340 nm波長處吸光度的變化，根據下式計算酶活力。

酶活力/U=5.145×ΔA340nm×稀釋倍數

式中：ΔA340nm為每分鐘吸光度的變化值。

1.3.6鴨肝LDH純度鑒定與分子質量測定［13］

鴨肝LDH的純度鑒定采用SDS-PAGE（12%分離膠和5%濃縮膠），上樣量10 μL。采用SDS-PAGE測定鴨肝LDH的亞基分子質量，Superdex-200凝膠過濾層析測定該酶的全分子質量。

1.3.7蛋白質含量的測定

用Bradford染料法與紫外分光光度法進行蛋白質含量的測定［13］。

1.3.8鴨肝LDH酶學性質測定

1.3.8.1鴨肝LDH的最適反應溫度和熱穩定性測定

在pH 7.4條件下，測定LDH在不同反應溫度（25～65 ℃）下的酶活力（每組實驗重復3 次取平均值，以下實驗重復次數相同），以酶活力最高值為100%，計算相對酶活力，以研究LDH的最適反應溫度。

將LDH酶液分別置于不同溫度（25～75 ℃）下保溫不同時間（0～60 min）后，在pH 7.4、25 ℃條件下測定LDH活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，計算相對酶活力，以研究LDH的熱穩定性。

1.3.8.2鴨肝LDH的最適反應pH值和pH值穩定性測定

配制不同pH值（3.0～10.0）的緩沖液，在25 ℃條件下，測定LDH在不同pH值反應體系中酶活力，以酶活力最高值為100%，計算相對酶活力，以研究LDH的最適反應pH值。

將酶液與不同pH值（4.0～10.0）的緩沖液等體積混合，4 ℃放置1.3 h后，測定LDH活力，以酶活力最高值為100%，計算其在不同pH值條件下的相對酶活力，研究LDH的pH值穩定性。

1.3.8.3鴨肝LDH米氏常數（Km）的測定

鴨肝LDH Km的測定采用雙倒數法（Lineweaver-Burk法）［14］，在最適條件下（45 ℃、pH 7.4），分別測定LDH對不同濃度（0.5～2.5 mmol/L）NADH和不同濃度（5～25 mmol/L）丙酮酸鈉兩種底物的Km值。

1.3.8.4不同化合物對鴨肝LDH活性的影響

將LDH酶液分別與等體積不同濃度的草酸、尿素、抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS混合后，在4 ℃冰箱中作用30 min后測定其酶活力，以不加化合物時的酶活力為100%，計算LDH的相對酶活力。

1.3.8.5不同有機溶劑對鴨肝LDH活性的影響

分別將酶液與等體積不同體積分數的異丙醇、甲醇、氯仿、乙醇混合，在4 ℃條件下作用30 min后測定酶活力，以不加有機物時的酶活力為100%，計算LDH的相對酶活力。

1.3.8.6部分金屬離子對鴨肝LDH活性的影響

將不同金屬離子（Zn2+、K+、Pb2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Li+、Ag+、Cd2+、Cu2+、Ba2+）配成100 mmol/L母液，用時稀釋成所需要的濃度即可，將酶液分別與等體積不同濃度的各種金屬離子溶液混合，在4 ℃條件下作用30 min后測定酶活力，以不加金屬離子時的酶活力為100%，計算LDH的相對酶活力。

2　結果與分析

2.1鴨肝LDH的分離純化結果

圖1　鴨肝LDH的DEAE-Sepharose離子交換層析結果Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of LDH from duck liver

圖2　鴨肝LDH的Superdex-200凝膠過濾層析結果Fig.2 Superdex-200 chromatography of LDH from duck liver

如圖1所示，鴨肝LDH初酶液經DEAE-Sepharose離子交換層析后，酶活力較高的峰主要集中在第14～19管，收集酶活力較高管的酶液，直接用于Superdex-200凝膠過濾層析，洗脫圖譜如圖2所示，酶活力較高的峰主要集中在第28～34管，收集高酶活力管的酶液，用雙蒸水透析后冷凍干燥，通過SDS-PAGE，顯示為單一條帶（圖3），說明該酶經純化后達到了電泳純。該酶的整個分離純化結果如表1所示，最終得到鴨肝LDH的酶活回收率為25.79%，純化倍數為185.78，酶比活力為668.82 U/mg。

圖3　鴨肝LDH的SDS-PAGEE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of puri?ed LDH from duck liver

表1　鴨肝LDH的分離純化結果Table 1 Summary of isolation and purification of LDH from duck liver

2.2鴨肝LDH的分子質量

純化后的LDH經SDS-PAGE顯示為單一條帶（圖3），鴨肝LDH的亞基分子質量為44.72 kD；經Superdex-200凝膠過濾層析測得全酶分子質量為170.93 kD （圖4），由此可以推斷該酶由4 個相同的亞基組成。

圖4　Superdex-200凝膠過濾層析測得的鴨肝LDH分子質量Fig.4 Estimation of molecular weight of LDH by Superdex-200 gel filtration chromatography

2.3鴨肝LDH酶學性質

2.3.1鴨肝LDH的最適反應溫度和熱穩定性

圖5　溫度對鴨肝LDH活力的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of LDH from duck liver

圖6　鴨肝LDH的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of LDH from duck liver

如圖5所示，該酶最適反應溫度為45 ℃。如圖6所示，在25～45 ℃范圍內，鴨肝LDH熱穩定性較好，而高于此溫度時酶活力迅速下降，在65 ℃時保溫15 min，相對酶活力僅剩余16%左右，在75 ℃時保溫15 min相對酶活力幾乎完全喪失。

2.3.2鴨肝LDH的最適反應pH值和pH值穩定性

如圖7所示，該酶的最適反應pH值為7.4。如圖8所示，該酶在pH 4.0時酶活力損失較多，當pH值在5.0～10.0范圍內時具有較好的穩定性，4 ℃放置1.3 h相對酶活力還保持在69%以上，由此說明該酶在pH＜5.0時酶活力較不穩定，但具有較強的耐堿性，在堿性條件下酶的三維空間結構較穩定。

圖7　pH值對鴨肝LDH活性的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of LDH from duck liver

圖8　鴨肝LDH的pH值穩定性Fig.8 pH Stability of LDH from duck liver

2.3.3鴨肝LDH的米氏常數（Km）

圖9　雙倒數法測定鴨肝LDH的米氏常數Fig.9 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of LDH

如圖9所示，以NADH為底物，求得鴨肝LDH的Km值為3.407 μmol/L（圖9a），對丙酮酸鈉的Km值為8.431 μmol/L（圖9b），表明鴨肝LDH對底物NADH的親和力遠大于對丙酮酸鈉的親和力。

2.3.4不同有機溶劑對鴨肝LDH活性的影響

如圖10所示，氯仿、甲醇、異丙醇、乙醇4 種有機溶劑對鴨肝LDH均有較強抑的制作用，且隨著有機溶劑體積分數的增大，抑制作用增強，當有機溶劑體積分數在50%時，鴨肝LDH的相對酶活力損失了近60%，當異丙醇體積分數為60%時，鴨肝LDH活力完全喪失。

圖10　甲醇、氯仿、乙醇、異丙醇對鴨肝LDH活力的影響Fig.10 Effects of methanol， isopropyl alcohol， ethanol and chloroform on the activity of LDH from duck liver

2.3.5不同化合物對鴨肝LDH活性的影響

圖11　不同化合物對鴨肝LDH活力的影響Fig.11 Effects of various compounds on the activity of LDH from duck liver

如圖11所示，SDS對鴨肝LDH的抑制作用非常強，當其濃度為5 mmol/L時，鴨肝LDH活力就已完全喪失，可能是因為SDS為陰離子變性劑，能夠使酶分子中的疏水鍵和氫鍵斷裂，使酶的三維空間結構發生改變，從而使酶活力降低甚至喪失。而尿素對該酶有激活作用，且隨著濃度的不斷增大，激活作用越來越小。ASA對鴨肝LDH活力的抑制作用最小，當ASA濃度為30 mmol/L時，該的相對酶活力仍保持在60%以上。草酸和EDTA對該酶都有較強的抑制作用。

2.3.6不同金屬離子對鴨肝LDH活性的影響

圖12　不同金屬離子對鴨肝LDH活力的影響Fig.12 Effects of different metal ions on the activity of LDH from duck liver

如圖12所示，Cu2+、Ag+對鴨肝LDH的抑制作用最強，當二者濃度為10 mmol/L時，鴨肝LDH活力幾乎完全喪失；Co2+、K+對鴨肝LDH有雙重作用，低濃度對該酶有激活作用，高濃度對該酶有抑制作用；Li+、Mg2+、Ca2+對鴨肝LDH的抑制作用較小，當三者濃度為50 mmol/L時，該酶的相對酶活力仍保持在69%以上；Pb2+、Cd2+、Ba2+、Zn2+對該酶均具有一定的抑制作用。

3　討 論

本實驗以鴨肝為材料，從鴨肝中分離純化得到了電泳純的LDH，與從其他材料純化得到的LDH相比，鴨肝LDH有以下特點：1）鴨肝來源較廣、價格較低廉、取材方便；2）經實驗中DEAE-Sepharose離子交換層析收集到的酶液酶活力較高，不需冷凍干燥便可上凝膠過濾層析柱進行更進一步的純化，減少了透析及冷凍干燥過程中酶活力的損失，也節約了實驗所需的時間，同時得到了鴨肝LDH的均一組分。通過本實驗得到的LDH酶比活力、純化倍數，酶活回收率都較高。

鴨肝LDH的最適反應溫度為45 ℃，低于羊心肌（50 ℃）［15］的最適反應溫度，鴨肝LDH在45 ℃保溫60 min相對酶活力仍保持在68%以上，而高于此溫度酶活力迅速下降，在60 ℃保溫60 min鴨肝LDH的活力為0，在75 ℃保溫15 min酶活力就完全喪失。可能是因為高溫促使酶蛋白質分子內基團間相互作用，從而破壞了酶分子的三維空間結構，使酶的催化功能減弱甚至喪失［16］。鴨肝LDH的pH值耐受范圍較廣，在pH 5.0～10.0范圍內具有較好的穩定性，該酶的最適反應pH值為7.4，與豬肌肉（pH 7.5）［17］幾乎一致，高于藏系綿羊肌肉（pH 5.8）［18］和低于羊心肌（pH 7.8）［15］來源的LDH，說明不同來源、不同組織中的LDH同工酶對環境pH值的適應性具有一定差異性。

本實驗結果表明：鴨肝LDH亞基分子質量為44.72 kD，高于大熊貓（36 kD）［19］、牦牛（36 kD）［20］、牛蛙（35.3、37.6 kD）［11］、藏系綿羊（34 kD）［18］來源的LDH亞基分子質量；該酶對底物NADH的Km值為3.407 μmol/L，對丙酮酸鈉的Km值為8.431 μmol/L，與藏系綿羊肌肉（0.022、0.444 μmol/L）［18］、牦牛肌肉（0.097、1.897 μmol/L）［20］、牛蛙骨骼肌（0.028、1.242 μmol/L）［11］的Km相比有較大差異，說明不同材料、不同組織來源的LDH同工酶對底物的親和力不同，可能是因為生物體為了能更好地適應環境，滿足生長代謝需求，產生以多種同工酶形式存在的LDH，這是生物體基因不斷進化并選擇性表達的結果［21］。

Ag+、Cu2+對鴨肝LDH的抑制作用最強；Co2+、K+對鴨肝LDH有雙重作用，低濃度表現為激活作用，高濃度表現為抑制作用，可能是因為金屬離子的濃度影響了該酶自身的帶電情況，在低濃度時，Co2+、K+可能對LDH的帶電量影響較弱，酶分子的三維空間結構沒有發生明顯變化，并能促進反應形成酶蛋白-金屬離子-底物三元配合物的穩定過渡態，從而降低反應所需的活化能，使酶促反應速率加快［22］，因而對酶具有激活作用；但當Co2+、K+濃度增大時，大量Co2+、K+的聚集改變了酶分子本身的帶電情況，影響了酶蛋白質的空間構型，從而逐漸抑制該酶的活性；Li+、Mg2+、Ca2+對該鴨肝LDH的抑制作用較小，當濃度為50 mmol/L時，該酶的相對酶活力仍保持在69%以上；Pb2+、Cd2+、Ba2+、Zn2+對鴨肝LDH均具有一定的抑制作用。

通過將鴨肝LDH與不同材料來源、不同組織中分離純化出的LDH同工酶的一些性質進行比較，結果表明LDH同工酶在酶學性質上存在著一定的差異性，可能是因為存在于不同器官的同工酶隨器官代謝環境的變化而不斷變化，各種同工酶適應于不同細胞或組織在代謝上的不同需要，對生物體的代謝起到不同的調節作用，不同組織器官中的LDH同工酶的類型可能與動物自身的生態習性、行為及器官的功能、組織的能量代謝有關，這也是生物體在自然選擇過程中基因選擇性表達的結果［23］。

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Isolation， Purification and Partial Characterization of Lactate Dehydrogenase from Duck Liver

FANG Ling， SUN Caiyun， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development， Ministry of Education， School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Electrophoresis-purity lactate dehydrogenase （LDH） from duck liver was obtained through the procedures of homogenization， buffer solution extraction， ethanol precipitation， ammonium sulfate fractionation， DEAE-Sepharose ion exchange chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography. An activity recovery of 25.79% was obtained. The specifi c activity of the purifi ed enzyme was 668.82 U/mg with a purifi cation fold of 185.78. The total molecular mass of the LDH was 170.93 kD consisting of a 44.72 kD subunit. The optimum temperature and pH for the LDH was 45 ℃and 7.4， respectively. It was stable in the ranges of pH 5-10 and 25-45 ℃. Its Kmwas 3.407 μmol/L towards NADH and 8.431 μmol/L towards sodium pyruvate. The enzyme activity was be strongly inhibited by SDS， oxalic acid， Cu2+and Ag+，but could be enhanced by low concentration of Co2+and K+.

duck liver； lactate dehydrogenase； isolation and purification； characterization

Q946.5

A

1002-6630（2015）15-0151-06

10.7506/spkx1002-6630-201515028

2014-08-11

重慶市科委重點攻關項目（CSTC2011AB1027）

方玲（1988—），女，碩士研究生，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：xuemeifl@163.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn