單增李斯特菌在生食魚片中生長模型的建立

周 晏，周國燕，*，徐 斐，曹 慧，彭少杰，王李偉，李 潔，王 穎

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市食品藥品監督所，上海 200233）

單增李斯特菌在生食魚片中生長模型的建立

周 晏1，周國燕1，*，徐 斐1，曹 慧1，彭少杰2，王李偉2，李 潔2，王 穎2

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市食品藥品監督所，上海 200233）

為研究生食魚片中單增李斯特菌的生長規律，將單增李斯特菌接種到經冷殺菌后的3 種生食魚片（三文魚片、金槍魚片、鯛魚片）中，分別置于4、8、15、25、35 ℃環境下培養，間隔適當時間取出計數。用5 種常用的一級模型（Gompertz模型、Baranyi模型、Logistic模型、Richards模型和MMF模型）對實驗數據進行擬合，通過比較相關系數R2和均方誤差（mean square error，MSE），確定最適一級模型為G ompertz模型。建立單增李斯特菌生長動力學參數（最大比生長速率μm和遲滯期λ）關于溫度、pH值和水分活度的二級平方根擴展模型，并應用相關系數R2、偏差值Bf和準確值Af進行驗證。結果表明，構建的二級模型能夠很好地描述生食魚片中單增李斯特菌的生長情況。

生食魚片；單增李斯特菌；生長模型

生食魚片是指新鮮捕撈的魚類經過清洗、整理等處理后直接切配食用的生鮮魚片制品［1］。近年來，隨著人們飲食習慣的變化和消費水平的提高，生食魚片以其美味新鮮、營養豐富、食用方便等特點，受到越來越多消費者的青睞。然而，生食魚片無需加熱烹調過程且富含適合微生物生長繁殖的各種營養物質，其質量安全問題尤其是病原菌控制問題尤顯重要。

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是四大食源性致病菌之一［2］，也是世界衛生組織（World Health Organization，WHO）列為重點監測對象的食源性致病菌之一，能引 起人畜共患的李斯特菌病［3］。單增李斯特菌除可引起急性食物中毒［4］外，還可引起人和牛羊兔等動物的腦膜炎，嬰兒及新生兒的化膿性腦膜炎或心肌炎，胎兒在子宮內感染可導致母體流產或死胎。李斯特氏菌病發病率不高，但十分嚴重，致死率（20%～30%）遠高于其他常見食源性病原菌［5-6］。孕婦、胎兒、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者感染風險較高［7］。這種菌分布廣泛、適應能力強，主要通過污染畜禽蛋奶等食物引起人類感染，已成為危害人類健康的主要元兇之一。環境適宜時，單增李斯特菌可在0～4 ℃的低溫條件下生長繁殖，鮮有其他致病菌能在此溫度下與其競爭，因此，該菌對冷藏食品 的安全 構成了嚴重威脅，致使冷藏食品容易引發李斯特菌病［8］。生 食魚 片作為最主要的冷藏食品之一，其安全性很大程度上受到單增李斯特菌的影響。

預測微生物學（predictive microbiology）是一門交叉性綜合性學科，主要對微生物的生 長動力學規律做出預測，用數學方法描述食品內微生物在不同條件下生長或失活的動態變化與外部環境因素之間的關系［9］。目前，食品工業中主要應用預測微生物學來確定食品貨架期和評估食品安全性［10］。

綜上所述，對生食魚片中單增李斯特菌的生長情況進行研究是十分必要的。目前，生食魚片中單增李斯特菌的研究還未見報道，此外，絕大多數關于單增李斯特菌生長規律的研究只考慮了影響微生物生長的最主要的因素——溫度［11-13］，而其他重要因素，如pH值、水分活度等則未被考慮。本實驗在建模過程中同時考慮了溫度、pH值和水分活度3 個重要因素，主要研究了5 種不同溫度（4 ℃冷藏、8 ℃低溫、15 ℃春秋溫度、25 ℃常溫、35 ℃高溫）條件下3 種生食魚片中單增李斯特菌的動態生長規律，利用軟件建立其生長初級模型和二級模型，為評估單增李斯特菌在生食魚片中的風險以及提高生食魚片食用安全性提供有效工具。

1　材料與方法

1.1菌種、材料與試劑

單增李斯特菌（ATCC 19115），購于廣東省微生物菌種保藏中心。

三文魚塊、金槍魚塊、鯛魚塊，均購自勛鮮館壹號店。

PALCAM瓊脂、PALCAM添加劑1、2，腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；NaCl、KCl、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硝酸銀、硫氰酸鉀、硫酸鐵銨（均為分析純）、冰乙酸、石油醚（30～60 ℃沸程）、濃硝酸 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

YXQ-LS-75SⅡ型滅菌器 上海博訊實業有限公司；SW-CJ-IC型凈化工作臺、SPX-250B-Ⅱ型生化培養箱 上海躍進醫療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕培養箱 上海比朗儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海圣科儀器設備有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海華連醫療器械有限公司；XW-80A型漩渦混合器 上海精科實業有限公司；FA2204B型電子天平 上海精密科學儀器有限公司；WAECO CF50型冰箱 美國電子（深圳）有限公司。

1.3方法

1.3.1理化指標的測定

pH值測定方法參考GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品pH測定》［14］。

由于樣品水分活度（aw）測定存在較大誤差，因此本實驗通過測定NaCl含量（XNaCl/%），由換算公式（1）［15］計算出aw值，NaCl含量測定方法參考GB/T 12457-2008《食品中氯化鈉的測定》［16］。

1.3.2生食魚片的制備

將生鮮魚塊無菌切割成（10.0±0.2）g、5 mm厚的薄片，用75%酒精棉球擦拭魚片表面，再將魚片兩面各紫外殺菌15 min后，裝入無菌袋內備用。

1.3.3菌種的活化

將單增李斯特菌接種于BHI培養基中于37 ℃條件下活化24 h，制得菌種原液。

1.3.4菌液制備、接種、培養及計數

調整菌種原液濃度至108CFU/mL（OD600nm= 0.15），用無菌生理鹽水（0.9 g/100 mL）將菌液按1∶10的比例稀釋至104CFU/mL。取1 mL菌液用無菌玻璃棒均勻涂抹至魚片表面，使最終濃度約為103CFU/g，室溫下放置5 min，確保細胞黏附于魚片表面。

將接種后的魚片分別置于4、8、15、25、35 ℃培養箱中，4 ℃培養12 d，每12 h取樣1 次；8 ℃培養10 d，每12 h取樣1 次；15 ℃培養5 d，每8 h取樣1 次；25 ℃培養4 d，前16 h每4 h取樣1 次，之后每8 h取樣 1 次；35 ℃培養1.5 d，前3 h每1 h取樣1 次，之后每3 h取樣1 次。取樣測定時，向無菌袋內加入90 mL無菌生理鹽水，充分揉捏2 min，取液體適當比例稀釋后計數于PALCAM平板。每一溫度、每個時間點2 個平行。

1.3.5建模方法

1.3.5.1一級模型的建立

選用5 種常用的一級模型［13，17-18］擬合不同溫度下生食魚片中單增李斯特菌的生長曲線（表1）。其中Baranyi模型應用Combase數據庫（http：//modelling.combase.cc）建立，其余4 種模型應用Curve Expert 1.4軟件建立。

表1　5 種微生物常用一級模型方程式［13，177--1188］Table 1 Equations of five common primary models［13，177--1188］

通過比較相關系數R2和均方誤差（mean square error，MSE）來分析模型的擬合效果。R2越接 近于1，MSE越小，說明模型的擬合效果越好。

1.3.5.2二級模型的建立

常用的二級模型有平方根模型及其擴展式、響應面模型等［18］，由于響應面模型的建立需要大量的數據支持，而可生食的魚類相當有限，無法滿足建立響應面模型 所需的數據量，并且建立得到的響應 面模型只在一定溫度范圍內符合微生物生長的實際情況［18］，因此，本實驗選用平方根模型擴展式建立單增李斯特菌最大比生長速率、遲滯期與溫度、pH值、水分活度的二級預測模型，應用統計分析軟件Or igin 8.0進行非線性回歸分析。二級平方根擴展模型數學描述見公式（7）、（8）。

式中：μm為最大比生長 速率/h-1；λ為遲滯期/h；Tmin為最低生長溫度；pHmin為最低生長pH值；awmin為最低生長水分活度；a、b為系數。

1.3.5.3模型驗證

通過相關系數R2判定模型的擬合性，同時應用偏差因子（bias factor，Bf）和準確因子（accuracy factor，Af）對模型預測效果進行驗證和評價。二者表達式如下［19］：

式中：n為實驗次 數。

2　結果與分析

2.1生食魚片的理化指標

表2　3 種生食魚片的pH值、NaCl含量和awTable 2 pH， NaCl contents and awof three species of fish fillets

使用SPSS軟件對3 種生食魚片的3 個理化指標分別進行了顯著性分析，表2結果顯示3 種魚片的pH值、NaCl含量和aw的差異均極顯著（P＜0.01）。

2.2一級模型的建立

將實驗數據導入Curve Expert 1.4軟件和Combase在線數據庫，使用5 種方程進行非線性回歸，結果見表3～5。

表3　三文魚片中單增李斯特菌生長模型相關系數及均方誤差Table 3 and MSE of models for Listeria monocytogenes growth insalmon slices

表4　金槍魚片中單增李斯特菌生長模型相關系數及均方誤差Tabllee 44 R2aanndd MMSSEE of models forr Listeria monocytogeenneess growth in tuna slices

表5　鯛魚片中單增李斯特菌生長模型相關系數及均方誤差Table 5 and MSE of models for Listeria monocytogenes growth in tilapia slices

由表3～5可知，5 種模型的相關系數R2都在0.97以上，表明5 種方程均能較好地描述4～35 ℃溫度范圍內單增李斯特菌在生食魚片中的生長動態。通過比較5 種模型R2和MSE可知，Gompertz模型的R2相對最接近于1，MSE相對較小，擬合性最好，其次是Logistic模型和Richards模型。由Gompertz模型擬合的不同溫度下生食魚片中單增李斯特菌的生長曲線見圖1～3。

圖1　Gompertz模型擬合的不同溫度條件下三文魚片中單增李斯特菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of Listeria monocytogenes in salmon slices at different temperatures fitted by Gompertz model

圖2　Gompertz模型擬合的不同溫度條件下金槍魚片中單增李斯特菌的生長曲線Fig.2 Growth curves of Listeria monocytogenes in tuna slices at different temperatures fitted by Gompertz model

圖3　Gompertz模型擬合的不同溫度條件下鯛魚片中單增李斯特菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of Listeria monocytogenes in tilapia slices at different temperatures f itted by Gompertz model

2.3顯著性分析

根據Gompertz模型的擬合參數計算出不同溫度條件下3 種魚片中單增李斯特菌的生長動力學參數，通過將Curve Expert 1.4軟件中Gompertz模型的表達式與Gompertz模型的經典表達式相換算，得出計算公式如下。

式中：a、b、c為表1中Gompertz模型擬合參數。擬合得到的擬合參數以及計算得到的生長動力學參數如表6所示。

利用SPSS 軟件 對溫 度、pH 值和aw對最大比生長速率 μm和遲滯期λ的影響進行了顯著性分析，結果表明，溫度對最大比生長速率和遲滯期影響極顯著（P＜0.01），pH值和aw對最大比生長速率和遲滯期影響顯著（P＜0.05）。因此，可以進一步建立顯著因素對最大比生長速率和遲滯期的回歸方程。

表6　Gompertz模型擬合參數與生食魚片中單增李斯特菌的生長參數Table 6 Fitting parameters of Gompertz model and growth parameters for for Listeria monocytogenes

2.4二級模型的建立

以溫度（T）、pH值、aw為自變量，μm、λ為因變量，用Origin 8.0軟件擬合二級平方根擴展模型（2）、（3），得到回歸方程如公式（13）、（14）所示：

2.5二級模型的驗證

以20 ℃條件下3 種生食魚片中單增李斯特菌的生長數據作模型驗證，將預測值與實測值作比較，驗證結果見表7。

表7　模型驗證結果Table 7 Validation of the models

偏差因子和準確因子是公認的最有價值的模型驗證工具，Bf和Af越接近于1，表示模型的預測效果越好［8］。本研究所得最大比生長率的Bf值為1.009 8，遲滯期的Bf值為0.957 0，均在0.90～1.05之間，說明構建的模型能夠很好地預測單增李斯特菌的生長速率及生長狀況。本實驗所得最大比生長率的Af值為1.064 8，非常接近1，遲滯期的Af值為1.145 1，也較接近1，說明模型較理想。因此，兩模型均能夠較好地預測4～35 ℃內生食魚片中單增李斯特菌的最大比生長速率和遲滯期。

3　結 論

本實驗研究了4、8、15、25、35 ℃條件下單增李斯特菌在3 種生食魚片（三文魚片、金槍魚片、鯛魚片，代表不同pH值、aw環境）中的生長規律，建立了生食魚片中單增李斯特菌的一級模型和二級模型，模型構建時，除了考慮微生物生長最主要的影響因素——溫度外，還擬合了pH值和aw這2 個重要因素。綜合分析5 種一級模型，發現Gompertz模型在不同溫度條件和食品基質下擬合度都較好，是描述生食魚片中單增李斯特菌生長動力學參數的最適模型。構建的最大比生長速率和遲滯期的二級平方根擴展模型相關系數分別為0.985 2和0.970 3，擬合度均較好。通過偏差因子和準確因子（Bfμm= 1.009 8，Afμm= 1.064 8，Bfλ= 0.957 0，Afλ= 1.145 1）驗證了本實驗所建立的二級模型能夠較 準確地預測生食魚片中單增李斯特菌的生長狀況，模型具有可靠性。因此，所建模型可作為生食魚片中單增李斯特菌安全性評價的定量依據，并可用于風險分析及相關標準的制定，進而更好地控制生食魚片加工和物流過程中單增李斯特菌的生長，保障生食魚片的安全。

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Establishment of Predictive Model for Listeria monocytogenes Growth in Raw Fish Fillets

ZHOU Yan1， ZHOU Guoyan1，*， XU Fei1， CAO Hui1， PENG Shaojie2， WANG Liwei2， LI Jie2， WANG Ying2
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093，China； 2. Shanghai Food and Drug Supervisory Institute， Shanghai 200233， China）

In order to predict the growth of Listeria monocytogenes in raw fi sh fi llets， salmon slices， tuna slices and tilapia slices were disinfected by cold sterilization， inoculated with Listeria monocytogenes， transferred for storage at 4， 8， 15， 25 and 35 ℃， and then counted at appropriate time intervals. Five common primary models （Gompertz， Baranyi， Logistic，Richards and MMF） were applied to fi t the growth curve for L isteria monocytogenes. The correlation coeffi cient （R2） and standard deviation （MSE） were compared to identify Gompertz model as the best fitting model. Extended square-root models concerning growth kinetic parameters （maximum specifi c growth rate and lag period） of Listeria monocytogenes as a function of temperature， pH， water activity （aw） and were developed. The R2， bias value （Bf） and accuracy （Af） were calcula ted to evaluate the established models. The results showed that the secondary models could describe the growth of Listeria monocytogenes in raw fi sh fi llets with satisfaction.

raw fi sh fi llets； Listeria monocytogenes； growth model

TS201.3

A

1002-6630（2015）15-0157-06

10.7506/spkx10 02-6630-201515029

2014-08-17

上海市科委重點攻關項目（11391902000；13391901400）

周晏（1990—），女，碩士，研究方向為食品預測微生物學與微生物風險評估。E-mail：925720085@qq.com

周國燕（1970—），女，副教授，博士，研究方向為食品冷凍冷藏與微生物風險評估。E-mail：346122142@qq.com