一株費氏丙酸桿菌生長特性及其代謝物抑菌作用分析

鄭麗雪，王荊楚，時慧佳，曹 雪，齊 斌*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 常熟 215500；3.吉林中糧生化有限公司，玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033）

一株費氏丙酸桿菌生長特性及其代謝物抑菌作用分析

鄭麗雪1，2，王荊楚2，時慧佳2，曹 雪3，齊 斌1，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 常熟 215500；3.吉林中糧生化有限公司，玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033）

對一株費氏丙酸桿菌 生長特性及其代謝物抑菌作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該菌株生長周期約為10 d，第1～3天為其對數(shù)生 長期，第4～8天為菌體生長的穩(wěn)定期，第9～10天為衰亡期。在生長過程中，菌體利用糖的速率很快，還原糖在發(fā)酵1 d內(nèi)幾乎被消耗殆盡，發(fā)酵液pH值在發(fā)酵 的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩(wěn)定在4.6左右。在同等條件下，該 丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的 抑制作用優(yōu)于對金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。對代謝產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)除了丙酸之外，還存在其他物質(zhì)，初步判定為細(xì)菌素。

丙酸桿菌；生長特性；抑菌物質(zhì)；細(xì)菌素

近年來，關(guān)于丙酸桿菌代謝物的研究報道很多，賈彩鳳［1］、梁新樂［2］等做了丙酸桿菌代謝物作為食品防腐劑及在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用研究，Wang Peng［3］、梁澤鑫［4］等針對丙酸桿菌產(chǎn)酸特性進(jìn)行了研究，其他的研究工作主要集中在丙酸桿菌發(fā)酵代謝物抑菌作用的研究方面［5-12］。丙酸桿菌代謝產(chǎn)物中起到抑菌作用的主要物質(zhì)為細(xì)菌素。細(xì)菌素是由細(xì)菌代謝產(chǎn)生，對同種或近源種有特異性抑制殺菌作用的蛋白質(zhì)或多肽。由乳酸菌產(chǎn)生的多種細(xì)菌素已被分離并進(jìn)行了性質(zhì)分析［13-15］，其中Nisin已被多個國家批準(zhǔn)使用。丙酸桿菌細(xì)菌素是由丙酸桿菌合成的蛋白質(zhì)或多肽，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)的丙酸桿菌細(xì)菌素PLG-1［16］具有廣泛的抑菌作用，能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌、部分革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母［17］。法國羅地亞公司已經(jīng)把包含食品丙酸桿菌素的天然食品防腐劑開發(fā)為產(chǎn)品，并在美國和歐洲市場大量銷售。國內(nèi)對于丙酸桿菌細(xì)菌素的研究還處于起步階段，本實驗室也曾開展過相關(guān)的研究工作，并取得一定成效［18-19］。本實驗對一株費氏丙酸桿菌的生長特性及其代 謝物的抑菌作用進(jìn)行研究，并對抑菌代謝產(chǎn)物性質(zhì)（是否為細(xì)菌素）進(jìn)行探討，以期為后續(xù)的分離、純化等方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種

費氏丙酸桿菌、酵母菌2-10515 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存；金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922 中國科學(xué)院微生物研究所。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；xs105du型電子天平、s20k型酸度計 瑞士梅特勒-托利多公司；LHR-250型霉菌培養(yǎng)箱 上海索譜儀器有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；SW-CJ-1B超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Milli-Q Advantage超純水儀 美國Millipore公司。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1費氏丙酸桿菌培養(yǎng)基

改良PYG培養(yǎng)基：酪蛋白胨5.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母提取物10.0 g、牛肉提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、K2HPO42.0 g、吐溫-80 1.0 mL、刃天青1.0 mL、鹽溶液40.0 mL，蒸餾水950.0 mL，氯化血紅素溶液10.0 mL，VK1溶液0.2 mL、L-半胱氨酸0.5 g，pH 7.2。鹽溶液：CaCl2·2H2O 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g，蒸餾水1.0 L。氯化血紅素溶液：氯化血紅素50.0 mg、1 mol/L NaOH 1.0 mL，蒸餾水99.0 mL。VK1溶液：VK10.1 mL，95%乙醇20.0 mL。

1.3.2大腸桿菌培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3.3金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3.4酵母菌培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基［20］。

1.4方法

1.4.1菌種活化

將斜面保存的費氏丙酸桿菌菌株接種于改良的PYG固體培養(yǎng)基上，于30 ℃厭氧罐中厭氧培養(yǎng)2.5 d。

將斜面保存的金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。將斜面保存的酵母菌2-10515接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。

1.4.2生長曲線測定

將活化好的費氏丙酸桿菌接種到改良PYG液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)10 d，每隔1 d吸取一定量的發(fā)酵液，以PYG液體培養(yǎng)基作為空白，在620 nm波長處測定發(fā)酵液光密度（OD）值，以此繪制費氏丙酸桿菌生長曲線。

1.4.3殘?zhí)呛康臏y定

每隔24 h吸取一定量的發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［10］測定上清液中殘?zhí)呛俊?/p>

1.4.4pH值測定

采用s20k型酸度計測定不同時間發(fā)酵液上清液pH值。

1.4.5費氏丙酸桿菌代謝物抑菌作用分析

1.4.5.1費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌抑制作用分析

將1 mL活化好的大腸桿菌菌液接入9 mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，然后向其中分別加入不同時間的費氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液0.5 mL，混合液于36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，以一支9 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基+1 mL指示菌液+0.5 mL費氏丙酸桿菌培養(yǎng)基管作為空白對照管，在620 nm波長處測定混合液OD值，考察不同時間的發(fā)酵液對大腸桿菌抑制作用。

1.4.5.2費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌抑制作用分析

將1 mL活化好的金黃色葡萄球菌菌液接入9 mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，以下操作方法參照1.4.5.1節(jié)進(jìn)行。考察不同天數(shù)的發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑制作用。

1.4.5.3費氏丙酸桿菌代謝物對酵母菌抑制作用分析

將1 mL活化好的酵母菌菌液接入9 mL已滅菌的PDA培養(yǎng)基中，以下操作方法參照1.4.5.1節(jié)進(jìn)行。考察不同天數(shù)的發(fā)酵液對酵母菌的抑制作用。

1.4.6抑菌活性代謝產(chǎn)物分析

分別用1 mol/L丙酸和l mol/L乙酸調(diào)節(jié)費氏丙酸桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH值至4.6（pH 4.6為費氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液的終pH值），然后各取200 ?L調(diào)酸后的培養(yǎng)基加入含有指示菌（大腸桿菌）的平板牛津杯中，以費氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液（8 d）為空白對照，36 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察抑菌情況，以此考察發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用是否因發(fā)酵產(chǎn)酸引起。

2　結(jié)果與分析

2.1生長曲線測定結(jié)果

由圖1可知，第1天菌體生長速率很快，直接進(jìn)入對數(shù)生長期，從第2～3天結(jié)束，菌體量增長緩慢，從第4～8天結(jié)束，菌體量基本穩(wěn)定，第9天菌體生長進(jìn)入衰亡期。

圖1　費氏丙酸桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Propionibacterium freudenreichii

2.2殘?zhí)呛繙y定結(jié)果

圖2　不同時間發(fā)酵液殘?zhí)呛縁ig.2 Amount of residual sugar at different fermentation times

由圖2可知，發(fā)酵液中的還原糖含量在發(fā)酵1 d內(nèi)幾乎被消耗殆盡（0.5%～0.1%），從第2～3天起，還原糖含量略有降低，之后基本不變。

2.3發(fā)酵液pH值

圖3　不同時間發(fā)酵液ppHH值Fig.3 pH at different fermentation times

如圖3所示，pH值在發(fā)酵的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩(wěn)定在4.6左右。這是由于丙酸桿菌在生長過程中產(chǎn)生丙酸、乙酸等多種有機(jī)酸，pH值穩(wěn)定在4.6是有機(jī)酸產(chǎn)生和消耗相互平衡的結(jié)果［21］。發(fā)酵液中還原糖含量及pH值的變化趨勢和馬悅培等［22］研究的薛氏丙酸桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液的還原糖含量及pH值變化趨勢相似。

2.4費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌抑制作用

如圖4所示，0 d為空白對照組，其他發(fā)酵時間的OD620nm值均小于空白對照組，這說明費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌具有抑制作用。同時，每管發(fā)酵液代謝物對大腸桿菌的抑制作用相差不大（OD620nm值相近）。

2.5費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌、酵母菌的抑制作用

圖5　不同時間費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌（A）和酵母菌（B）抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of Propionibacterium freudenreichii metabolites at different fermentation times on Staphylococcus aureus （A） and yeast （B）

費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌和酵母菌抑制作用分別如圖5A、5B所示，其中0 d為空白對照組，其他時間的OD620nm值均和空白對照組相差不大，綜合2.4節(jié)實驗結(jié)果，這說明在同等條件下，該費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑菌作用優(yōu)于對金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。

2.6抑菌活性代謝產(chǎn)物分析結(jié)果

如圖6所示，經(jīng)丙酸調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基對指示菌有抑制作用（圖中2所示，抑菌圈直徑為16 mm），但并沒有費氏丙酸桿菌發(fā)酵上清液的抑菌作用大（圖中1和3抑菌圈直徑平均值為24 mm），而經(jīng)乙酸調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基對 指示菌沒有抑制作用，這說明：1）費氏丙酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌有抑制作用；2）發(fā)酵產(chǎn)物乙酸沒有抑菌作用；3）發(fā)酵產(chǎn)物中的丙酸有抑菌作用；4）發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)除了丙酸之外，還存在其他物質(zhì)。盧楠等［5］對謝氏丙酸桿菌發(fā)酵廢液中生物抑菌物質(zhì)進(jìn)行了研究，她們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液可以抑制一些革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌，而且抑菌效果明顯優(yōu)于化學(xué)防腐劑，其主要抑菌成分為等電點在2.0附近的蛋白類物質(zhì)、丙酸銨、乙酸銨。牛愛地等［23］對一株從酸菜中分離的有抑菌活性的乳桿菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，研究表明有抑菌活性的代謝產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)，且具有良好的熱穩(wěn)定性。這些蛋白類的抑菌物質(zhì)就是細(xì)菌素。所以，本實驗費氏丙酸桿菌代謝物中丙酸以外的抑菌物質(zhì)可初步判定為細(xì)菌素，在以后的實驗中將進(jìn)一步進(jìn)行驗證。

圖6　費氏丙酸桿菌代謝物中抑菌物質(zhì)分析Fig.6 Antibacterial activity of Propionibacterium freudenreichii metabolites

3　結(jié) 論

通過對費氏丙酸桿菌基本生長特性的研究，得出該菌生長周期約為10 d，第1～3天為其對數(shù)生長期，第4～8天為菌體生長的穩(wěn)定期，第9～10天為衰亡期。在生長過程中，菌體利用糖的速率很快，還原糖在發(fā)酵1 d內(nèi)幾乎被消耗殆盡，發(fā)酵液pH值在發(fā)酵的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩(wěn)定在4.6左右。通過對費氏丙酸桿菌代謝物抑菌作用研究，得出在同等條件 下，費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑制作用優(yōu)于對金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。對代謝產(chǎn)物分析結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物中抑菌物質(zhì)除了丙酸之外，還存在其他物質(zhì)，根據(jù)文獻(xiàn)報道［5］，初步推斷出這些物質(zhì)為細(xì)菌素，進(jìn)一步的驗證實驗將繼續(xù)開展。

實驗室小發(fā)酵罐的高密度培養(yǎng)實驗是在搖瓶培養(yǎng)基礎(chǔ)上開展的，梁澤鑫等［4］研究了5 L罐產(chǎn)酸費氏丙酸桿菌發(fā)酵動力學(xué)，取得了很好的效果。王曉云等［6］研究了補加氨水對薛氏丙酸桿菌分批發(fā)酵及代謝物抑菌活性的影響，研究表明，補加氨水后有效地調(diào)節(jié)了發(fā)酵液的pH值，顯著提高了費氏丙酸桿菌代謝物的抑菌活性。Feng Xiaohai等［24］研究了7.5 L發(fā)酵罐中費氏丙酸桿菌CCTCC M207015發(fā)酵產(chǎn)丙酸的動力學(xué)。因此，高密度培養(yǎng)也將是本實驗下一步研究的重點內(nèi)容。另外，邱雯雯等［25］研究了直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑的制備，利用制得的直投式發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶，酸奶指標(biāo)達(dá)到了指標(biāo)要求。所以，今后也可以考慮制備直投式的發(fā)酵劑用于食品發(fā)酵，取得發(fā)酵、防腐一舉兩得的效果。

［1］ 賈彩鳳. 丙酸桿菌代謝物作為食品防腐劑的研究［D］. 上海： 華東師范大學(xué)， 2005.

［2］ 梁新樂， 劉愛琴， 鐘立人. 丙酸桿菌的研究進(jìn)展及其在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用［J］. 食品研究與開發(fā)， 2006， 27（6）： 170-172.

［3］ WANG Peng， JIAO Youjing， LIU Shouxin. Novel fermentation process strengthening strengthening strategy for production of propionic acid and vitamin B12by Propionibacterium freudenreichii［J］. Joural of Industrial Microbiology Biotechnology， 2014， 41： 1811-1815.

［4］ 梁澤鑫， 王菊芳. 產(chǎn)酸丙酸桿菌生長特性及5L罐發(fā)酵動力學(xué)研究［J］.激光生物學(xué)報， 2014， 23（3）： 251-256.

［5］ 盧楠， 朱文華. 謝氏丙酸桿菌發(fā)酵廢液中生物抑菌物質(zhì)的研究［J］.河北工業(yè)科技， 2012， 29（3）： 138-140.

［6］ 王曉云， 金風(fēng)杰， 計芬芬， 等. 補加氨水對薛氏丙酸桿菌分批發(fā)酵及代謝物抑菌活性的影響［J］. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（14）： 224-227.

［7］ 馮晗， 榮邵豐， 賈彩鳳， 等. 丙酸桿菌代謝物對惡臭假單胞菌抑制活性［J］. 蘭州大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版， 2008， 44（2）： 58-62.

［8］ 榮紹豐， 常忠義， 高紅亮， 等. 不同丙酸桿菌代謝物對酵母菌抑菌作用的研究［J］. 食品工業(yè)， 2009， 30（1）： 1-3.

［9］ 榮紹豐， 常忠義， 高紅亮， 等. 發(fā)酵條件對費氏丙酸桿菌代謝物抑菌活性的影響［J］. 食品工業(yè)， 2008， 29（6）： 3-5.

［10］ DANILOVA I V， BYKOVCHENKO T V， RYZHKOVA E P. A positive effect of Propionibacterium freudenreichii on the growth of Saccharomyes cerevisiae during their cocultivation［J］. Applied Biochemistry and Microbiology， 2006， 42（4）： 378-383.

［11］ HAJFARAJOLLAH H， MOKHTARANI B， NOGHABI K A. Newly antibacterial and antiadhesive lipopeptide biosurfactant secreted by a probiotic strain， Propionibacterium freudenreichii［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2014， 174（8）： 2725-2740.

［12］ YUKSEKDAG Z N， DARILMAZ D O， BEYATLI Y. Dairy propionibacterium strains with potential as biopreservatives against foodborne pathogens and their tolerance-resistance properties［J］. European Food Research & Technology， 2014， 238（1）： 17-26.

［13］ STILES M E. Biopreservation by lactic acid bacteria［J］. Antonie van Leeuwenhoek， 1996， 70： 331-345.

［14］ 田文利， 吳瓊， 呂紅線， 等. 乳酸鏈球菌素（Nisin）的研究進(jìn)展［J］. 食品工業(yè)， 2000， 21（3）： 28-30.

［15］ STEVENS K A， SHELDON B W， KLAPES N A， et al. Nisin treatment for inactivation of Salmonella species and other gramnegative bacteria［J］. Applied & Environmental Microbiology， 1991，57（12）： 3613-3615.

［16］ LEVERSEE J A， GLATZ B A. Detection of the bacteriocin propionicin PLG-1 with polyvalent anti-PLG-1 anti-serum［J］. Applied & Environmental Microbiology， 2001， 67（5）： 2235-2239.

［17］ SHOTARO T， HIROSHI K， KOICHI H. SF6gas analysis technique and its application for evaluation of internal conditions in SF6gas equipment［J］. IEEE Transactions on Power Apparatus and Systems，1981， 100（9）： 4196-4206.

［18］ 王海晶， 王玉華， 齊斌. 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)丙酸桿菌素菌株的培養(yǎng)條件［J］. 中國乳品工業(yè)， 2011， 39（2）： 13-16.

［19］ 劉靖， 王立梅， 齊斌. 丙酸桿菌高產(chǎn)菌株的誘變選育［J］. 食品工業(yè)科技， 2012， 33（9）： 187-189.

［20］ 周德慶. 微生物學(xué)實驗教程［M］. 2版. 北京： 高等教育出版社， 2006： 372.

［21］ 陳玉梅， 常忠義， 王疆元， 等. 乳酸鈉和葡萄糖對薛氏丙酸桿菌生長及代謝物抑菌活性的影響［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版，2007， 35（2）： 178-182.

［22］ 馬悅培， 高紅亮， 常忠義， 等. 不同初始pH對丙酸桿菌細(xì)菌素發(fā)酵的影響［J］. 食品工業(yè)科技， 2010， 31（5）： 215-217.

［23］ 牛愛地， 韓建春. 一株從酸菜中分離的產(chǎn)細(xì)菌素乳桿菌的鑒定及其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的研究［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2009， 40（10）： 104-108.

［24］ FENG Xiaohai， XU Hong， YAO Jun， et al. Kinetic analysis and pH-shift control strategy for propionic acid production with Propionibacterium freudenreichii CCTCC M207015［J］. Applied Biochemistry & Biotechnology， 2010， 160（2）： 343-349.

［25］ 邱雯雯， 陳存社， 高思思， 等. 直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑的制備及其保護(hù)劑的優(yōu)化［J］. 食品工業(yè)科技， 2013， 39（9）： 95-100.

Growth Characteristics and Metabolite Bacteriostatic Action of Propionibacterium freudenreichii

ZHENG Lixue1，2， WANG Jingchu2， SHI Huijia2， CAO Xue3， QI Bin1，*
（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu 215500， China；2. Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology， Changshu 215500， China；3. National Engineering Research Center of Corn Deep Processing， Jilin CO FCO Bio-chemical Co. Ltd.， Changchun 130033， China）

The growth characteristics and metabolite bacteriostasis of Propionibacterium freudenreichii were studied. The results showed： the strain's growth cycl e was approximately 10 days， involving logarithmic phase （1-3 d）， stability phase（4-8 d） and decline phase （9-10 d）. In the process of growth， sugar was consumed quickly， and almost completely depleted in the first day. The pH after 1 day of fermentation dropped to 4.6 and then remained at 4.6 during the remaining fermentation period. Under the same conditions， the bacteriostatic effect of Propionibacterium fre udenreichii metabolites on E. coli was better than those of Staphylococcus aureus and yeast. Bacteriocins were dominant metabolites with antimicrobial activity besides propionic acid.

Propionibacterium freudenreichii； growth characteristics； antimicrobial substances； bacteriocins

Q939.9

A

1002-6630（2015）15-0163-04

10.7506/spkx1002-6630-201515030

2014-10-13

江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013339）；蘇州市科技計劃項目（SYN201226；SYN201417）

鄭麗雪（1982—），女，實驗師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：lixue9418@163.com

齊斌（1965—），男，研究員，博士，研究方向為糧食油脂與植物蛋白工程。E-mail：qibin65@126.com