一株費氏丙酸桿菌生長特性及其代謝物抑菌作用分析

鄭麗雪，王荊楚，時慧佳，曹 雪，齊 斌*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500；3.吉林中糧生化有限公司，玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033）

一株費氏丙酸桿菌生長特性及其代謝物抑菌作用分析

鄭麗雪1，2，王荊楚2，時慧佳2，曹 雪3，齊 斌1，*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟 215500；3.吉林中糧生化有限公司，玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033）

對一株費氏丙酸桿菌 生長特性及其代謝物抑菌作用進行研究。結果表明：該菌株生長周期約為10 d，第1～3天為其對數生 長期，第4～8天為菌體生長的穩定期，第9～10天為衰亡期。在生長過程中，菌體利用糖的速率很快，還原糖在發酵1 d內幾乎被消耗殆盡，發酵液pH值在發酵 的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩定在4.6左右。在同等條件下，該 丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的 抑制作用優于對金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。對代謝產物的分析結果表明，發酵產物中抑菌物質除了丙酸之外，還存在其他物質，初步判定為細菌素。

丙酸桿菌；生長特性；抑菌物質；細菌素

近年來，關于丙酸桿菌代謝物的研究報道很多，賈彩鳳［1］、梁新樂［2］等做了丙酸桿菌代謝物作為食品防腐劑及在食品發酵工業中的應用研究，Wang Peng［3］、梁澤鑫［4］等針對丙酸桿菌產酸特性進行了研究，其他的研究工作主要集中在丙酸桿菌發酵代謝物抑菌作用的研究方面［5-12］。丙酸桿菌代謝產物中起到抑菌作用的主要物質為細菌素。細菌素是由細菌代謝產生，對同種或近源種有特異性抑制殺菌作用的蛋白質或多肽。由乳酸菌產生的多種細菌素已被分離并進行了性質分析［13-15］，其中Nisin已被多個國家批準使用。丙酸桿菌細菌素是由丙酸桿菌合成的蛋白質或多肽，已經 發現的丙酸桿菌細菌素PLG-1［16］具有廣泛的抑菌作用，能抑制革蘭氏陰性細菌、部分革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母［17］。法國羅地亞公司已經把包含食品丙酸桿菌素的天然食品防腐劑開發為產品，并在美國和歐洲市場大量銷售。國內對于丙酸桿菌細菌素的研究還處于起步階段，本實驗室也曾開展過相關的研究工作，并取得一定成效［18-19］。本實驗對一株費氏丙酸桿菌的生長特性及其代 謝物的抑菌作用進行研究，并對抑菌代謝產物性質（是否為細菌素）進行探討，以期為后續的分離、純化等方面的研究奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1菌種

費氏丙酸桿菌、酵母菌2-10515 常熟理工學院生物與食品工程學院發酵工程中心保存；金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922 中國科學院微生物研究所。

1.2儀器與設備

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；xs105du型電子天平、s20k型酸度計 瑞士梅特勒-托利多公司；LHR-250型霉菌培養箱 上海索譜儀器有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機 日本日立公司；SW-CJ-1B超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Milli-Q Advantage超純水儀 美國Millipore公司。

1.3培養基

1.3.1費氏丙酸桿菌培養基

改良PYG培養基：酪蛋白胨5.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母提取物10.0 g、牛肉提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、K2HPO42.0 g、吐溫-80 1.0 mL、刃天青1.0 mL、鹽溶液40.0 mL，蒸餾水950.0 mL，氯化血紅素溶液10.0 mL，VK1溶液0.2 mL、L-半胱氨酸0.5 g，pH 7.2。鹽溶液：CaCl2·2H2O 0.25 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g，蒸餾水1.0 L。氯化血紅素溶液：氯化血紅素50.0 mg、1 mol/L NaOH 1.0 mL，蒸餾水99.0 mL。VK1溶液：VK10.1 mL，95%乙醇20.0 mL。

1.3.2大腸桿菌培養基

營養肉湯培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3.3金黃色葡萄球菌培養基

營養肉湯培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.3.4酵母菌培養基

PDA液體培養基［20］。

1.4方法

1.4.1菌種活化

將斜面保存的費氏丙酸桿菌菌株接種于改良的PYG固體培養基上，于30 ℃厭氧罐中厭氧培養2.5 d。

將斜面保存的金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922分別接種于營養肉湯培養基中，37 ℃培養12 h。將斜面保存的酵母菌2-10515接種于PDA培養基中，30 ℃培養24 h。

1.4.2生長曲線測定

將活化好的費氏丙酸桿菌接種到改良PYG液體培養基中，30 ℃厭氧培養10 d，每隔1 d吸取一定量的發酵液，以PYG液體培養基作為空白，在620 nm波長處測定發酵液光密度（OD）值，以此繪制費氏丙酸桿菌生長曲線。

1.4.3殘糖含量的測定

每隔24 h吸取一定量的發酵液，8 000 r/min離心5 min，采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法［10］測定上清液中殘糖含量。

1.4.4pH值測定

采用s20k型酸度計測定不同時間發酵液上清液pH值。

1.4.5費氏丙酸桿菌代謝物抑菌作用分析

1.4.5.1費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌抑制作用分析

將1 mL活化好的大腸桿菌菌液接入9 mL已滅菌的營養肉湯培養基中，然后向其中分別加入不同時間的費氏丙酸桿菌發酵上清液0.5 mL，混合液于36 ℃條件下培養24 h，以一支9 mL營養肉湯培養基+1 mL指示菌液+0.5 mL費氏丙酸桿菌培養基管作為空白對照管，在620 nm波長處測定混合液OD值，考察不同時間的發酵液對大腸桿菌抑制作用。

1.4.5.2費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌抑制作用分析

將1 mL活化好的金黃色葡萄球菌菌液接入9 mL已滅菌的營養肉湯培養基中，以下操作方法參照1.4.5.1節進行。考察不同天數的發酵液對金黃色葡萄球菌的抑制作用。

1.4.5.3費氏丙酸桿菌代謝物對酵母菌抑制作用分析

將1 mL活化好的酵母菌菌液接入9 mL已滅菌的PDA培養基中，以下操作方法參照1.4.5.1節進行。考察不同天數的發酵液對酵母菌的抑制作用。

1.4.6抑菌活性代謝產物分析

分別用1 mol/L丙酸和l mol/L乙酸調節費氏丙酸桿菌液體發酵培養基pH值至4.6（pH 4.6為費氏丙酸桿菌發酵上清液的終pH值），然后各取200 ?L調酸后的培養基加入含有指示菌（大腸桿菌）的平板牛津杯中，以費氏丙酸桿菌發酵上清液（8 d）為空白對照，36 ℃條件下培養24 h，觀察抑菌情況，以此考察發酵產物抑菌作用是否因發酵產酸引起。

2　結果與分析

2.1生長曲線測定結果

由圖1可知，第1天菌體生長速率很快，直接進入對數生長期，從第2～3天結束，菌體量增長緩慢，從第4～8天結束，菌體量基本穩定，第9天菌體生長進入衰亡期。

圖1　費氏丙酸桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of Propionibacterium freudenreichii

2.2殘糖含量測定結果

圖2　不同時間發酵液殘糖含量Fig.2 Amount of residual sugar at different fermentation times

由圖2可知，發酵液中的還原糖含量在發酵1 d內幾乎被消耗殆盡（0.5%～0.1%），從第2～3天起，還原糖含量略有降低，之后基本不變。

2.3發酵液pH值

圖3　不同時間發酵液ppHH值Fig.3 pH at different fermentation times

如圖3所示，pH值在發酵的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩定在4.6左右。這是由于丙酸桿菌在生長過程中產生丙酸、乙酸等多種有機酸，pH值穩定在4.6是有機酸產生和消耗相互平衡的結果［21］。發酵液中還原糖含量及pH值的變化趨勢和馬悅培等［22］研究的薛氏丙酸桿菌發酵過程中發酵液的還原糖含量及pH值變化趨勢相似。

2.4費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌抑制作用

如圖4所示，0 d為空白對照組，其他發酵時間的OD620nm值均小于空白對照組，這說明費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌具有抑制作用。同時，每管發酵液代謝物對大腸桿菌的抑制作用相差不大（OD620nm值相近）。

2.5費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌、酵母菌的抑制作用

圖5　不同時間費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌（A）和酵母菌（B）抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of Propionibacterium freudenreichii metabolites at different fermentation times on Staphylococcus aureus （A） and yeast （B）

費氏丙酸桿菌代謝物對金黃色葡萄球菌和酵母菌抑制作用分別如圖5A、5B所示，其中0 d為空白對照組，其他時間的OD620nm值均和空白對照組相差不大，綜合2.4節實驗結果，這說明在同等條件下，該費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑菌作用優于對金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。

2.6抑菌活性代謝產物分析結果

如圖6所示，經丙酸調節pH值的發酵培養基對指示菌有抑制作用（圖中2所示，抑菌圈直徑為16 mm），但并沒有費氏丙酸桿菌發酵上清液的抑菌作用大（圖中1和3抑菌圈直徑平均值為24 mm），而經乙酸調節pH值的發酵培養基對 指示菌沒有抑制作用，這說明：1）費氏丙酸桿菌發酵產物對大腸桿菌有抑制作用；2）發酵產物乙酸沒有抑菌作用；3）發酵產物中的丙酸有抑菌作用；4）發酵產物中的抑菌物質除了丙酸之外，還存在其他物質。盧楠等［5］對謝氏丙酸桿菌發酵廢液中生物抑菌物質進行了研究，她們發現發酵液可以抑制一些革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌，而且抑菌效果明顯優于化學防腐劑，其主要抑菌成分為等電點在2.0附近的蛋白類物質、丙酸銨、乙酸銨。牛愛地等［23］對一株從酸菜中分離的有抑菌活性的乳桿菌的代謝產物進行了研究，研究表明有抑菌活性的代謝產物是一種蛋白質，且具有良好的熱穩定性。這些蛋白類的抑菌物質就是細菌素。所以，本實驗費氏丙酸桿菌代謝物中丙酸以外的抑菌物質可初步判定為細菌素，在以后的實驗中將進一步進行驗證。

圖6　費氏丙酸桿菌代謝物中抑菌物質分析Fig.6 Antibacterial activity of Propionibacterium freudenreichii metabolites

3　結 論

通過對費氏丙酸桿菌基本生長特性的研究，得出該菌生長周期約為10 d，第1～3天為其對數生長期，第4～8天為菌體生長的穩定期，第9～10天為衰亡期。在生長過程中，菌體利用糖的速率很快，還原糖在發酵1 d內幾乎被消耗殆盡，發酵液pH值在發酵的第1天下降到4.6左右，此后一直到第10天，pH值基本穩定在4.6左右。通過對費氏丙酸桿菌代謝物抑菌作用研究，得出在同等條件 下，費氏丙酸桿菌代謝物對大腸桿菌的抑制作用優于對金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑制作用。對代謝產物分析結果表明，發酵產物中抑菌物質除了丙酸之外，還存在其他物質，根據文獻報道［5］，初步推斷出這些物質為細菌素，進一步的驗證實驗將繼續開展。

實驗室小發酵罐的高密度培養實驗是在搖瓶培養基礎上開展的，梁澤鑫等［4］研究了5 L罐產酸費氏丙酸桿菌發酵動力學，取得了很好的效果。王曉云等［6］研究了補加氨水對薛氏丙酸桿菌分批發酵及代謝物抑菌活性的影響，研究表明，補加氨水后有效地調節了發酵液的pH值，顯著提高了費氏丙酸桿菌代謝物的抑菌活性。Feng Xiaohai等［24］研究了7.5 L發酵罐中費氏丙酸桿菌CCTCC M207015發酵產丙酸的動力學。因此，高密度培養也將是本實驗下一步研究的重點內容。另外，邱雯雯等［25］研究了直投式費氏丙酸桿菌發酵劑的制備，利用制得的直投式發酵劑發酵酸奶，酸奶指標達到了指標要求。所以，今后也可以考慮制備直投式的發酵劑用于食品發酵，取得發酵、防腐一舉兩得的效果。

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Growth Characteristics and Metabolite Bacteriostatic Action of Propionibacterium freudenreichii

ZHENG Lixue1，2， WANG Jingchu2， SHI Huijia2， CAO Xue3， QI Bin1，*
（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu 215500， China；2. Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology， Changshu 215500， China；3. National Engineering Research Center of Corn Deep Processing， Jilin CO FCO Bio-chemical Co. Ltd.， Changchun 130033， China）

The growth characteristics and metabolite bacteriostasis of Propionibacterium freudenreichii were studied. The results showed： the strain's growth cycl e was approximately 10 days， involving logarithmic phase （1-3 d）， stability phase（4-8 d） and decline phase （9-10 d）. In the process of growth， sugar was consumed quickly， and almost completely depleted in the first day. The pH after 1 day of fermentation dropped to 4.6 and then remained at 4.6 during the remaining fermentation period. Under the same conditions， the bacteriostatic effect of Propionibacterium fre udenreichii metabolites on E. coli was better than those of Staphylococcus aureus and yeast. Bacteriocins were dominant metabolites with antimicrobial activity besides propionic acid.

Propionibacterium freudenreichii； growth characteristics； antimicrobial substances； bacteriocins

Q939.9

A

1002-6630（2015）15-0163-04

10.7506/spkx1002-6630-201515030

2014-10-13

江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013339）；蘇州市科技計劃項目（SYN201226；SYN201417）

鄭麗雪（1982—），女，實驗師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：lixue9418@163.com

齊斌（1965—），男，研究員，博士，研究方向為糧食油脂與植物蛋白工程。E-mail：qibin65@126.com