海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖的抑制作用及其機(jī)制

姜艷霞，紀(jì)朋艷，朱文赫，張 巍，徐俊杰，李 妍，雷鈞濤

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖的抑制作用及其機(jī)制

姜艷霞1，紀(jì)朋艷1，朱文赫1，張 巍1，徐俊杰1，李 妍1，雷鈞濤2

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

目的：探討不同質(zhì)量濃度的海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖的抑制作用。方法：分別以質(zhì)量濃度為5、10、20、30 mg/mL的海帶多糖處理Bel-7402細(xì)胞，48 h后觀察海帶多糖對(duì)細(xì)胞增殖的抑制情況，Annexin V-FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況，酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)Caspase-3活性，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和甲胎球蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）表達(dá)量。結(jié)果：海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，最佳抑制劑量為30 mg/mL；隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），海帶多糖處理組Bel-7402細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3表達(dá)水平同正常對(duì)照組細(xì)胞相比呈上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AFP蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。結(jié)論：海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能是激活Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡和AFP蛋白表達(dá)水平下降所致。

海帶多糖；細(xì)胞凋亡；甲胎球蛋白；Caspase-3

全世界每年新發(fā)病的肝癌患者約有60萬，居惡性腫瘤的第五位。肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，初期癥狀并不明顯，晚期主要表現(xiàn)為肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等癥狀。臨床上一般采取西醫(yī)的手術(shù)、放化療與中藥結(jié)合療法，但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率較低，臨床上通過檢測(cè)甲胎球蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）輔助診斷肝癌及判斷治療效果［1-4］，尋找一種低毒有效的抗肝癌藥物已成為當(dāng)前治療肝癌的一個(gè)重要研究內(nèi)容。

海帶是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物，屬海藻類植物，是一種營養(yǎng)價(jià)值很高的蔬菜，具有一定的藥用價(jià)值；海帶熱量低，含有藻膠酸、昆布素、半乳聚糖等多糖類，以及谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸等氨基酸，還含有VB1、VB2、VC、煙酰胺、胡蘿卜素等維生素以及碘、鉀、鈣等無機(jī)鹽［5-8］。海帶具有降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫功能、抗凝血、抗腫瘤、排鉛解毒和抗氧化等多種生物功能［9-12］。海帶多糖是海帶的主要藥理成分，宋劍秋等［13］研究發(fā)現(xiàn)海帶多糖對(duì)S180肉瘤小鼠的抑瘤率達(dá)86.5%，Menshova等［14］研究顯示海帶多糖對(duì)黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-28和結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1有抑制作用，Ji Chengfeng等［15］研究顯示海帶多糖對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo有抑制作用，但目前還未見海帶多糖抗肝癌的研究，本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞Bel-7402為對(duì)象，觀測(cè)不同質(zhì)量濃度海帶多糖對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制率的影響，初步探討海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402的作用機(jī)制，為海帶多糖的深入應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Bel-7402 細(xì)胞 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫；海帶多糖（純度95%） 陜西慈緣生物技術(shù)有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；AFP抗體、Caspase-3抗體 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白質(zhì)裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker 美國Lithuania公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；胰酶 美國Amresco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Model 680酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一儀器廠；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；BZ01倒置顯微鏡 德國萊卡顯微鏡公司；DL-CJ-IN醫(yī)用型潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；FAM1104N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Z36HK低溫離心機(jī) 英國Hermle公司。

1.3方法

1.3.1Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將人肝癌細(xì)胞系Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周更換培養(yǎng)液2 次，待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期，以0.25%胰酶（含有乙二胺四乙酸）消化傳代。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為5 組：正常對(duì)照組（C組）、海帶多糖各劑量組（5、10、20、30 mg/mL）。

1.3.2MTT法檢測(cè)海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞的增殖抑制率［16-17］

取對(duì)數(shù)生長期的Bel-7402細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，加入海帶多糖使其終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30 mg/mL，以不加海帶多糖的Bel-7402細(xì)胞為對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔再加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測(cè)各孔吸光度A490nm，按照下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.3Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率［18-20］

將正常對(duì)照組及海帶多糖各劑量組細(xì)胞用胰酶消化后收集于離心管，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，按照Ebioscience Annexin VFIFC凋亡試劑盒說明書方法，將細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合劑中，加入Annexin V-FITC 5 μL，室溫閉光孵育1 5 m i n，離心棄去上清液，細(xì)胞重懸于200 μL結(jié)合劑中，加入10 μL PI，于Nucleo-Counter NC-3000細(xì)胞分析儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.3.4Caspase-3活性測(cè)定［21-22］

將正常對(duì)照組及海帶多糖各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液收集于離心管，2 500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定Caspase-3活性。將海帶多糖各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液和包被液按1∶1（V/V）比例加入到96 孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4 ℃過夜；正常對(duì)照組為100%包被液，以下操作各組相同：吸出孔中液體后加入封閉液，200 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；PBST洗板3 次；加入1∶200（V/V）稀釋的一抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h后棄去一抗，PBST洗板3 次；加入1∶1 000（V/V）稀釋的二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h后棄去二抗，PBST洗板3 次；加顯色劑100 μL/孔，室溫避光孵育3～5 min，當(dāng)有顏色變化時(shí)，加入終止液50 μL/孔，以對(duì)照管調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測(cè)定吸光度。

1.3.5Western boltting法檢測(cè)Bel-7402細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和AFP蛋白的表達(dá)量

以胰酶消化正常對(duì)照組及海帶多糖各劑量組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min離心收集細(xì)胞，以PBS洗2 次，用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清液。經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，取等量樣品以12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，兔抗人Caspase-3和鼠抗人AFP抗體（1∶1 000，V/V）孵育過夜，再以相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行處理結(jié)果，以目標(biāo)蛋白質(zhì)與β-actin灰度的比值表示蛋白質(zhì)的表達(dá)水平（相對(duì)表達(dá)量）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，組間比較采用LSD法或Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖的影響

圖1　不同質(zhì)量濃度海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of laminarin at various concentrations on the proliferation of Bel-7402 cells

如圖1所示，隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖的抑制作用顯著增加，且呈劑量依賴關(guān)系，其中30 mg/mL的海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖的抑制作用最明顯，抑制率達(dá)到了63.36%，與正常對(duì)照組（C組）相比，差異極顯著（P＜0.01）。

2.2海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2　Bel-7402細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（400×）Fig.2 Morphological change of Bel-7402 cells （40×）

如圖2所示，正常對(duì)照組（圖2a）Bel-7402細(xì)胞生長狀態(tài)良好，輪廓清晰，貼壁生長，細(xì)胞之間排列緊密；經(jīng)海帶多糖作用后（圖2b～2d），Bel-7402細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，體積縮小，細(xì)胞固縮變形，隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，30 mg/mL海帶多糖處理的Bel-7402細(xì)胞固縮變形最明顯。

2.3海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響

表1　海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 Effect of laminarin on the apoptosis rate of hepatoma carcinoma Bel-7402 cells

如表1所示，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)海帶多糖10、20、30 mg/mL劑量組的Bel-7402細(xì)胞凋亡率分別為（5.93±0.80）%、（12.50±1.02）%和（29.51±0.93）%，而正常對(duì)照組的Bel-7402細(xì)胞凋亡率僅為（3.20±0.41）%。與正常對(duì)照組相比，海帶多糖各劑量組的Bel-7402細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

2.4海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞Caspase-3活性的影響

表2　海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞Caspase-3活性的影響Table 2 Effect of laminarin on the activity of Caspase-3 in hepatoma carcinoma Bel-7402 cells

如表2所示，Bel-7402細(xì)胞經(jīng)過海帶多糖處理后，細(xì)胞發(fā)生凋亡，Caspase-3活性明顯升高。正常對(duì)照組、海帶多糖10、20、30 mg/mL劑量組的Caspase-3活性（A490nm）分別為0.510 3±0.104 5、0.635 3±0.126 4、0.680 3±0.144 8、0.706 3±0.130 5。與正常對(duì)照組相比，海帶多糖各劑量組的Caspase-3活性顯著提高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.5Bel-7402細(xì)胞內(nèi)AFP和Caspase-3的表達(dá)水平

用不同質(zhì)量濃度海帶多糖處理Bel-7402細(xì)胞后，觀察海帶多糖質(zhì)量濃度的增加對(duì)細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)的影響。如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，海帶多糖20、30 mg/mL劑量組Bel-7402細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)量顯著上升，AFP表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。通過Caspase-3/β-actin及AFP/β-actin比較（圖3b），變化趨勢(shì)更明顯，表明經(jīng)海帶多糖處理后Bel-7402細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

圖3　經(jīng)不同質(zhì)量濃度海帶多糖處理后Bel-7402細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和AAFFPP的Western blotting結(jié)果（a）和灰度值（bb）Fig.3 Effect of laminarin on electrophoresis （a） and gray value （b） of Caspase-3 and AFP in Bel-7402 cells

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的增加，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用顯著增加，且呈劑量依賴性，30 mg/mL海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞的48 h抑制率達(dá)到了63.36%。倒置顯微鏡下觀察，海帶多糖各劑量組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體積縮小，皺縮變形，說明海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主進(jìn)行的程序性死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外側(cè)，通過Annexin V-FITC/PI流式雙染色法可檢測(cè)到翻轉(zhuǎn)的磷脂酰絲氨酸［23］，通過兩種不同熒光標(biāo)記確定細(xì)胞是否凋亡，在本實(shí)驗(yàn)中，海帶多糖處理后的Bel-7402細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨著海帶多糖質(zhì)量濃度的增加，凋亡比例顯著提高。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者［24］，本研究分別通過ELISA法和Western blotting法檢測(cè)海帶多糖作用后Bel-7402細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)的變化，結(jié)果顯示海帶多糖作用后，細(xì)胞分泌Caspase-3的水平比正常對(duì)照組明顯升高，為了進(jìn)一步研究海帶多糖對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，通過Western blotting檢測(cè)Bel-7402細(xì)胞內(nèi)AFP的變化，結(jié)果表明，海帶多糖作用于Bel-7402細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)AFP表達(dá)量與正常對(duì)照組相比顯著降低。AFP可以用作肝癌追蹤觀察的重要指標(biāo)［25-26］，手術(shù)切除或化療后血清AFP水平明顯下降，表示手術(shù)或化療成功，肝癌無轉(zhuǎn)移；過一段時(shí)間后若AFP水平重新升高，說明腫瘤可能復(fù)發(fā)，AFP水平對(duì)肝癌的診斷和治療具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海帶多糖導(dǎo)致Bel-7402細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與AFP水平的降低有關(guān)。綜上所述，海帶多糖對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)量升高從而引發(fā)細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞內(nèi)AFP水平有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。

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Inhibitory Effect and Mechanism of Laminarin on Proliferation of Human Hepatoma Carcinoma Bel-7402 Cells

JIANG Yanxia1， JI Pengyan1， ZHU Wenhe1， ZHANG Wei1， XU Junjie1， LI Yan1， LEI Juntao2
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology， Jilin Medical University， Jilin 132013， China；2. Department of Pharmacy， Jilin Medical University， Jilin 132013， China）

Objective： To examine the inhibitory effect of different concentrations of laminarin on proliferation of human hepatoma carcinoma Bel-7402 cells. Methods： Bel-7402 cells were cultured with different concentrations of laminarin for 48 h. The inhibitory effect of laminarin on the proliferation of Bel-7402 cells was evaluated by MTT （methyl thiazolyl tetrazolium） assay. Cell apoptosis was detected using Annexin V-FITC Kit. The activity of Caspase-3 was examined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression of Caspase-3 and alpha-fetoprotein （AFP） was detected by Western blotting. Results： Laminarin inhibited the proliferation of Bel-7402 cells in a concentration-dependent manner with an optimal concentration of 30 mg/mL. The increased concentration of laminarin could accelerate the apoptosis rate of cells （P ＜ 0. 05）. Caspase-3 activity significantly increased in the treatment groups when compared with the control group（P ＜ 0.05）. The expression of Caspase-3 increased significantly and AFP expression decreased significantly in the treatment groups. Conclusion： Laminarin can inhibit the proliferation of Bel-7402 cells， and the mechanism may be associated with cell apoptosis caused by the activation of Caspase-3， and reduced expression of AFP.

laminarin； cell apoptosis； alpha-fetoprotein （AFP）； Caspase-3

R735.7

A

1002-6630（2015）15-0179-04

10.7506/spkx1002-6630-201515033

2014-09-08

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字2013-350）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140101142JC）

姜艷霞（1969—），女，副教授，碩士，主要從事天然藥物成分抗腫瘤研究。E-mail：jiangyx123@163.com