海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402增殖的抑制作用及其機制

姜艷霞，紀朋艷，朱文赫，張 巍，徐俊杰，李 妍，雷鈞濤

（1.吉林醫藥學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院藥劑學教研室，吉林 吉林 132013）

海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402增殖的抑制作用及其機制

姜艷霞1，紀朋艷1，朱文赫1，張 巍1，徐俊杰1，李 妍1，雷鈞濤2

（1.吉林醫藥學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫藥學院藥劑學教研室，吉林 吉林 132013）

目的：探討不同質量濃度的海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402增殖的抑制作用。方法：分別以質量濃度為5、10、20、30 mg/mL的海帶多糖處理Bel-7402細胞，48 h后觀察海帶多糖對細胞增殖的抑制情況，Annexin V-FITC試劑盒檢測細胞凋亡狀況，酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測Caspase-3活性，Western blotting法檢測細胞內Caspase-3和甲胎球蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）表達量。結果：海帶多糖對Bel-7402細胞的增殖有明顯抑制作用，最佳抑制劑量為30 mg/mL；隨著海帶多糖質量濃度的升高，細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），海帶多糖處理組Bel-7402細胞內的Caspase-3表達水平同正常對照組細胞相比呈上升趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.05）；AFP蛋白表達水平呈下降趨勢。結論：海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402增殖具有抑制作用，其機制可能是激活Caspase-3，引起細胞凋亡和AFP蛋白表達水平下降所致。

海帶多糖；細胞凋亡；甲胎球蛋白；Caspase-3

全世界每年新發病的肝癌患者約有60萬，居惡性腫瘤的第五位。肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤，初期癥狀并不明顯，晚期主要表現為肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等癥狀。臨床上一般采取西醫的手術、放化療與中藥結合療法，但晚期患者因癌細胞擴散而治愈率較低，臨床上通過檢測甲胎球蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）輔助診斷肝癌及判斷治療效果［1-4］，尋找一種低毒有效的抗肝癌藥物已成為當前治療肝癌的一個重要研究內容。

海帶是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物，屬海藻類植物，是一種營養價值很高的蔬菜，具有一定的藥用價值；海帶熱量低，含有藻膠酸、昆布素、半乳聚糖等多糖類，以及谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸等氨基酸，還含有VB1、VB2、VC、煙酰胺、胡蘿卜素等維生素以及碘、鉀、鈣等無機鹽［5-8］。海帶具有降血脂、降血糖、調節免疫功能、抗凝血、抗腫瘤、排鉛解毒和抗氧化等多種生物功能［9-12］。海帶多糖是海帶的主要藥理成分，宋劍秋等［13］研究發現海帶多糖對S180肉瘤小鼠的抑瘤率達86.5%，Menshova等［14］研究顯示海帶多糖對黑色素瘤細胞SK-MEL-28和結腸癌細胞DLD-1有抑制作用，Ji Chengfeng等［15］研究顯示海帶多糖對人結腸癌細胞LoVo有抑制作用，但目前還未見海帶多糖抗肝癌的研究，本實驗以人肝癌細胞Bel-7402為對象，觀測不同質量濃度海帶多糖對肝癌細胞增殖抑制率的影響，初步探討海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402的作用機制，為海帶多糖的深入應用研究提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

Bel-7402 細胞 中國醫學科學院腫瘤細胞庫；海帶多糖（純度95%） 陜西慈緣生物技術有限公司。

RPMI-1640培養基 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 天津灝洋生物制品科技有限責任公司；AFP抗體、Caspase-3抗體 北京中杉金橋生物技術有限公司；RIPA蛋白質裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 碧云天生物技術研究所；蛋白質分子質量Marker 美國Lithuania公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）天津永大化學試劑開發中心；胰酶 美國Amresco公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司；DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一儀器廠；MCO-18AIC CO2培養箱 日本Sanyo公司；BZ01倒置顯微鏡 德國萊卡顯微鏡公司；DL-CJ-IN醫用型潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；FAM1104N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；Z36HK低溫離心機 英國Hermle公司。

1.3方法

1.3.1Bel-7402細胞培養及分組

將人肝癌細胞系Bel-7402細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養。每周更換培養液2 次，待細胞長至對數生長期，以0.25%胰酶（含有乙二胺四乙酸）消化傳代。

后續實驗分為5 組：正常對照組（C組）、海帶多糖各劑量組（5、10、20、30 mg/mL）。

1.3.2MTT法檢測海帶多糖對Bel-7402細胞的增殖抑制率［16-17］

取對數生長期的Bel-7402細胞按5×103個/孔的密度接種于96 孔板，每組設6 個復孔。培養24 h后，加入海帶多糖使其終質量濃度分別為5、10、20、30 mg/mL，以不加海帶多糖的Bel-7402細胞為對照組。培養48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸棄孔內液體，每孔再加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度A490nm，按照下式計算細胞增殖抑制率。

1.3.3Annexin V-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色法檢測細胞凋亡率［18-20］

將正常對照組及海帶多糖各劑量組細胞用胰酶消化后收集于離心管，細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，按照Ebioscience Annexin VFIFC凋亡試劑盒說明書方法，將細胞重懸于100 μL結合劑中，加入Annexin V-FITC 5 μL，室溫閉光孵育1 5 m i n，離心棄去上清液，細胞重懸于200 μL結合劑中，加入10 μL PI，于Nucleo-Counter NC-3000細胞分析儀測定細胞凋亡率。

1.3.4Caspase-3活性測定［21-22］

將正常對照組及海帶多糖各劑量組細胞培養液收集于離心管，2 500 r/min離心10 min，取上清液測定Caspase-3活性。將海帶多糖各劑量組細胞培養液和包被液按1∶1（V/V）比例加入到96 孔酶標板中，100 μL/孔，4 ℃過夜；正常對照組為100%包被液，以下操作各組相同：吸出孔中液體后加入封閉液，200 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；PBST洗板3 次；加入1∶200（V/V）稀釋的一抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h后棄去一抗，PBST洗板3 次；加入1∶1 000（V/V）稀釋的二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h后棄去二抗，PBST洗板3 次；加顯色劑100 μL/孔，室溫避光孵育3～5 min，當有顏色變化時，加入終止液50 μL/孔，以對照管調零，用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度。

1.3.5Western boltting法檢測Bel-7402細胞內Caspase-3和AFP蛋白的表達量

以胰酶消化正常對照組及海帶多糖各劑量組細胞，1 000 r/min離心5 min離心收集細胞，以PBS洗2 次，用RIPA細胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清液。經BCA法進行蛋白質定量分析，取等量樣品以12% SDS-PAGE進行電泳。電泳后將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，兔抗人Caspase-3和鼠抗人AFP抗體（1∶1 000，V/V）孵育過夜，再以相應的辣根過氧化酶標記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL發光液顯影，凝膠成像系統進行處理結果，以目標蛋白質與β-actin灰度的比值表示蛋白質的表達水平（相對表達量）。

1.4統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件分析數據，結果以±s表示，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗，組間比較采用LSD法或Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異具有顯著性。

2　結果與分析

2.1海帶多糖對Bel-7402細胞增殖的影響

圖1　不同質量濃度海帶多糖對Bel-7402細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of laminarin at various concentrations on the proliferation of Bel-7402 cells

如圖1所示，隨著海帶多糖質量濃度的增加，其對Bel-7402細胞增殖的抑制作用顯著增加，且呈劑量依賴關系，其中30 mg/mL的海帶多糖對Bel-7402細胞增殖的抑制作用最明顯，抑制率達到了63.36%，與正常對照組（C組）相比，差異極顯著（P＜0.01）。

2.2海帶多糖對Bel-7402細胞形態的影響

圖2　Bel-7402細胞形態學變化（400×）Fig.2 Morphological change of Bel-7402 cells （40×）

如圖2所示，正常對照組（圖2a）Bel-7402細胞生長狀態良好，輪廓清晰，貼壁生長，細胞之間排列緊密；經海帶多糖作用后（圖2b～2d），Bel-7402細胞生長受到抑制，細胞數量明顯減少，體積縮小，細胞固縮變形，隨著海帶多糖質量濃度的增加，細胞形態發生明顯變化，30 mg/mL海帶多糖處理的Bel-7402細胞固縮變形最明顯。

2.3海帶多糖對Bel-7402細胞凋亡的影響

表1　海帶多糖對Bel-7402細胞凋亡率的影響Table 1 Effect of laminarin on the apoptosis rate of hepatoma carcinoma Bel-7402 cells

如表1所示，經流式細胞儀檢測海帶多糖10、20、30 mg/mL劑量組的Bel-7402細胞凋亡率分別為（5.93±0.80）%、（12.50±1.02）%和（29.51±0.93）%，而正常對照組的Bel-7402細胞凋亡率僅為（3.20±0.41）%。與正常對照組相比，海帶多糖各劑量組的Bel-7402細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

2.4海帶多糖對Bel-7402細胞Caspase-3活性的影響

表2　海帶多糖對Bel-7402細胞Caspase-3活性的影響Table 2 Effect of laminarin on the activity of Caspase-3 in hepatoma carcinoma Bel-7402 cells

如表2所示，Bel-7402細胞經過海帶多糖處理后，細胞發生凋亡，Caspase-3活性明顯升高。正常對照組、海帶多糖10、20、30 mg/mL劑量組的Caspase-3活性（A490nm）分別為0.510 3±0.104 5、0.635 3±0.126 4、0.680 3±0.144 8、0.706 3±0.130 5。與正常對照組相比，海帶多糖各劑量組的Caspase-3活性顯著提高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.5Bel-7402細胞內AFP和Caspase-3的表達水平

用不同質量濃度海帶多糖處理Bel-7402細胞后，觀察海帶多糖質量濃度的增加對細胞內的蛋白表達的影響。如圖3所示，與正常對照組相比，海帶多糖20、30 mg/mL劑量組Bel-7402細胞內Caspase-3表達量顯著上升，AFP表達量顯著下降（P＜0.05）。通過Caspase-3/β-actin及AFP/β-actin比較（圖3b），變化趨勢更明顯，表明經海帶多糖處理后Bel-7402細胞發生了凋亡。

圖3　經不同質量濃度海帶多糖處理后Bel-7402細胞內Caspase-3和AAFFPP的Western blotting結果（a）和灰度值（bb）Fig.3 Effect of laminarin on electrophoresis （a） and gray value （b） of Caspase-3 and AFP in Bel-7402 cells

3　討 論

本實驗結果顯示，海帶多糖對Bel-7402細胞增殖具有明顯的抑制作用，且隨著海帶多糖質量濃度的增加，對細胞增殖的抑制作用顯著增加，且呈劑量依賴性，30 mg/mL海帶多糖對Bel-7402細胞的48 h抑制率達到了63.36%。倒置顯微鏡下觀察，海帶多糖各劑量組細胞數量明顯減少，細胞體積縮小，皺縮變形，說明海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402增殖具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主進行的程序性死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，當細胞凋亡時，細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸翻轉到細胞膜的外側，通過Annexin V-FITC/PI流式雙染色法可檢測到翻轉的磷脂酰絲氨酸［23］，通過兩種不同熒光標記確定細胞是否凋亡，在本實驗中，海帶多糖處理后的Bel-7402細胞發生凋亡，隨著海帶多糖質量濃度的增加，凋亡比例顯著提高。Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的關鍵酶和執行者［24］，本研究分別通過ELISA法和Western blotting法檢測海帶多糖作用后Bel-7402細胞中Caspase-3表達的變化，結果顯示海帶多糖作用后，細胞分泌Caspase-3的水平比正常對照組明顯升高，為了進一步研究海帶多糖對Bel-7402細胞凋亡的作用機制，通過Western blotting檢測Bel-7402細胞內AFP的變化，結果表明，海帶多糖作用于Bel-7402細胞后，細胞內AFP表達量與正常對照組相比顯著降低。AFP可以用作肝癌追蹤觀察的重要指標［25-26］，手術切除或化療后血清AFP水平明顯下降，表示手術或化療成功，肝癌無轉移；過一段時間后若AFP水平重新升高，說明腫瘤可能復發，AFP水平對肝癌的診斷和治療具有十分重要的意義。本實驗結果表明，海帶多糖導致Bel-7402細胞凋亡的機制可能與AFP水平的降低有關。綜上所述，海帶多糖對人肝癌細胞Bel-7402增殖具有抑制作用，其機制可能與誘導Caspase-3表達量升高從而引發細胞凋亡和降低細胞內AFP水平有關，但其具體作用機制還需要進一步深入研究。

［1］ 盛家和， 曹偉娟， 焦揚. AFP， 鐵蛋白， CEA， CA199的聯合檢測對原發性肝癌的診斷［J］. 中國衛生檢驗雜志， 2009（10）： 2339-2341.

［2］ 賈保昌， 羅小玲， 梁嶸， 等. 聯合檢測血清GP73和AFP對原發性肝癌診斷價值的探討［J］. 中華腫瘤防治雜志， 2012， 19（11）： 832-835.

［3］ 李鵬， 翟云， 劉暉， 等. 血清AFP， GPC3， VEGF， IGF-Ⅱ單獨及聯合檢測對原發性肝細胞癌的診斷價值［J］. 世界華人消化雜志， 2010，18（25）： 2702-2706.

［4］ 聶榮慧， 劉元元. 腫瘤標志物AFP， CA125， CA199和CEA檢測在肝炎， 肝硬化患者診斷和治療中的應用［J］. 吉林大學學報： 醫學版，2012， 38（1）： 119-122.

［5］ 劉艷如， 李治. 海帶的深加工及營養成分分析［J］. 食品工業科技，1998， 19（2）： 54.

［6］ 王利群， 董英. 海帶的營養保健功能及其開發前景［J］. 包裝與食品機械， 1999， 17（1）： 28-31.

［7］ 金嫘， 王宏. 海帶的營養與保健［J］. 中國食物與營養， 2001（1）： 41-42.［8］ 曹小華. 海帶的營養作用及其在水產動物生產中的應用［J］. 廣東飼料， 2014（2）： 39-41.

［9］ 劉軍， 羅瓊， 閻俊， 等. 海帶多糖對慢性局部電離輻射致大鼠睪丸細胞損傷的干預效應研究［J］. 營養學報， 2011， 33（1）： 61-65.

［10］ 孫文忠， 魏媛媛， 曾曼麗， 等. 海帶多糖對人鼻咽癌HONE1細胞裸鼠移植瘤的抑制及凋亡相關基因的調控［J］. 實用醫學雜志， 2013，29（4）： 535-537.

［11］ 姜文， 王亞男， 于竹芹， 等. 海帶多糖對在2型糖尿病小鼠血糖水平的影響［J］. 臨床醫學工程， 2012， 19（9）： 1465-1466.

［12］ 丁國玉， 黃連光， 安斌， 等. 海帶多糖降血脂， 血糖研究［J］. 保健醫學研究與實踐， 2010 （4）： 10-11.

［13］ 宋劍秋， 徐譽泰， 張華坤， 等. 海帶硫酸多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的免疫調節作用［J］. 中國免疫學雜志， 2000， 16（2）： 70.

［14］ MENSHOVA R V， ERMAKOVA S P， ANASTYUK S D， et al. Structure， enzymatic transformation and anticancer activity of branched high molecular weight laminaran from brown alga Eisenia bicyclis［J］. Carbohydrate Polymers， 2014， 99： 101-109.

［15］ JI Chenfeng， JI Yubin， MENG Deyou. Sulfated modification and anti-tumor activity of laminarin［J］. Experimental and Therapeutic Medicine， 2013， 6（5）： 1259-1264.

［16］ 司徒鎮強， 吳軍正. 細胞培養［M］. 北京： 世界圖書出版公司， 2007： 138.［17］ 章靜波. 組織和細胞培養技術［M］. 2版. 北京： 人民衛生出版社，2011： 106.

［18］ 姜艷霞， 蘆曉靜， 徐俊杰， 等. 越橘花色苷對宮頸癌Hela細胞凋亡及抗氧化能力的影響［J］. 上海中醫藥雜志， 2011， 45（9）： 62-65.

［19］ 龐雪芹， 陳衛昌， 李銳， 等. CD40配體激活抑制胃癌細胞生長機制的實驗研究［J］. 蘇州大學學報： 醫學版， 2006， 26（3）： 354-357.

［20］ 鄭弘， 畢勇毅， 王群， 等. 阿魏酸鈉對ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡及p53蛋白表達的影響［J］. 現代預防醫學， 2010， 37（21）： 4110-4113.

［21］ 齊玲， 溫娜， 楊淑艷， 等. 順鉑對膠質瘤神經球的凋亡誘導作用及其機制［J］. 吉林大學學報： 醫學版， 2013（6）： 1108-1111.

［22］ 朱文赫， 張巍， 李妍， 等. 微波輻射對人胰腺癌JF305細胞增殖的抑制作用及其機制［J］. 衛生研究， 2013， 42（6）： 1008-1011.

［23］ 吳建勇， 趙德璋. 流式細胞儀檢測細胞凋亡的幾種方法的比較［J］.重慶醫科大學學報， 2010， 35（9）： 1386-1389.

［24］ CURTIN J F， DONOVAN M， COTTER T G. Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis［J］. Journal of Immunological Methods， 2002， 265（1）： 49-72.

［25］ CARR B I， GUERRA V， GIANNINI E G， et al. Low alpha-fetoprotein HCC and the role of GGTP［J］. The International Journal of Biological Markers， 2013， 29（4）： e395-e402. doi： 10.5301/jbm.5000092.

［26］ CRISSIEN A M， FRENETTE C. Current management of hepatocellular carcinoma［J］. Gastroenterology & Hepatology， 2014，10（3）： 153-161.

Inhibitory Effect and Mechanism of Laminarin on Proliferation of Human Hepatoma Carcinoma Bel-7402 Cells

JIANG Yanxia1， JI Pengyan1， ZHU Wenhe1， ZHANG Wei1， XU Junjie1， LI Yan1， LEI Juntao2
（1. Department of Biochemistry and Molecular Biology， Jilin Medical University， Jilin 132013， China；2. Department of Pharmacy， Jilin Medical University， Jilin 132013， China）

Objective： To examine the inhibitory effect of different concentrations of laminarin on proliferation of human hepatoma carcinoma Bel-7402 cells. Methods： Bel-7402 cells were cultured with different concentrations of laminarin for 48 h. The inhibitory effect of laminarin on the proliferation of Bel-7402 cells was evaluated by MTT （methyl thiazolyl tetrazolium） assay. Cell apoptosis was detected using Annexin V-FITC Kit. The activity of Caspase-3 was examined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression of Caspase-3 and alpha-fetoprotein （AFP） was detected by Western blotting. Results： Laminarin inhibited the proliferation of Bel-7402 cells in a concentration-dependent manner with an optimal concentration of 30 mg/mL. The increased concentration of laminarin could accelerate the apoptosis rate of cells （P ＜ 0. 05）. Caspase-3 activity significantly increased in the treatment groups when compared with the control group（P ＜ 0.05）. The expression of Caspase-3 increased significantly and AFP expression decreased significantly in the treatment groups. Conclusion： Laminarin can inhibit the proliferation of Bel-7402 cells， and the mechanism may be associated with cell apoptosis caused by the activation of Caspase-3， and reduced expression of AFP.

laminarin； cell apoptosis； alpha-fetoprotein （AFP）； Caspase-3

R735.7

A

1002-6630（2015）15-0179-04

10.7506/spkx1002-6630-201515033

2014-09-08

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（吉教科合字2013-350）；吉林省科技發展計劃項目（20140101142JC）

姜艷霞（1969—），女，副教授，碩士，主要從事天然藥物成分抗腫瘤研究。E-mail：jiangyx123@163.com