膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響

蔡夏夏，鮑 雷，王 楠，徐美虹，李 迪，武 欣，張召鋒，李 勇*

（北京大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，北京 100191）

膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響

蔡夏夏，鮑 雷，王 楠，徐美虹，李 迪，武 欣，張召鋒，李 勇*

（北京大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，北京 100191）

目的：研究膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響，并進一步探討可能的作用機制。方法：雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、酒精組、葡萄糖等熱量對照組、普通飼料組、質量分數0.04%、0.16% 5'-核苷酸干預組，連續飼養7 周，測定大鼠體質量、臟體比、血清乙醇體積分數、血清轉氨酶活力、血脂水平及總蛋白含量等相關指標；平板培養大鼠糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、腸球菌，計算大鼠糞便中各種細菌的菌落數。結果：膳食5'-核苷酸能夠增加酒精引起的大鼠體質量降低，輕度抑制血清乙醇體積分數的升高，抑制酒精引起丙氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶活力和甘油三酯水平等升高（P＜0.05），增加血清總蛋白、白蛋白及球蛋白含量（P＜0.05）；并能夠增加肝體比，減少盲體比（P＜0.05）；膳食5'-核苷酸能夠增加腸道乳酸桿菌數量，同時減少大腸桿菌及腸球菌的數量（P＜0.05）。結論：膳食5'-核苷酸能夠改善酒精引起的大鼠肝臟損傷，調節腸道菌群可能是其作用機制之一。

5'-核苷酸；酒精性肝損傷；腸道菌群；丙氨酸氨基轉移酶；酒精性脂肪性肝炎

酒精性肝損傷（alcoholic liver injury，ALD）是由于長期大量飲酒所導致的肝臟疾病，通常包括脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化，嚴重時甚至造成肝功能衰竭［1］。過量或有害的酒精攝入被認為是全球致死致殘的最重要危險因素之一，每年也導致了全球大約250萬人死亡，傷殘調整生命年高達6 940萬人年［2］。我國對全國酒精性肝病發病情況、臨床特征等進行的多中心回顧研究顯示，2000-2004年ALD患者占同期肝病患者比例逐年升高，輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化分別占11.2%、22.6%、28.8%、37.4%，ALD發病率也呈逐年上升趨勢［3］。

正常情況下，肝臟參與了腸道來源的毒素和微生物產物的解毒，其獨一無二的解剖位置、血液供給和肝臟結構使肝細胞和肝竇內皮細胞不僅暴露于腸道來源的代謝必需營養素，也暴露于腸道來源的微生物產物［4］。因此，越來越多的研究也表明，肝臟疾病包括ALD等與腸-肝軸的紊亂密切相關［5-7］。人體腸道中定居著100萬億個微生物［8］，腸道菌群的穩定對于腸-肝軸的穩定具有重要作用［9］。人群研究證實，酒精誘導的肝臟損傷患者與正常人相比腸道菌群改變，雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌數量明顯減少，短期口服補充雙歧桿菌后肝臟轉氨酶、乳酸脫氫酶活力和總膽紅素含量明顯降低［10］。動物及體外研究也證實酒精能夠誘導內毒素血癥、腸道菌群改變、肝臟脂肪變性及腸道上皮細胞屏障功能障礙［11-13］。因此，腸道菌群將是治療酒精性肝病的潛在作用靶點。

膳食核苷酸被認為是對胃腸道細胞生長、修復和分化有重要作用的非蛋白含氮化合物［14］。它能夠加速老年大鼠因食物剝奪后腸道的修復速率［15］，亦能夠改善配方食品組嬰幼兒腸道菌群的組成［16］，而且，體外研究證實，補充核苷酸能夠刺激體外雙歧桿菌的生長，具有直接的益生效應［17］。所以，本實驗通過富含5'-核苷酸的飼料喂養酒精性肝損傷大鼠，觀察膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠的影響及可能作用機制。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級雄性Wistar大鼠（動物合格證號：SCXK11-00-0004；實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2006-0025；實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2006-0008），體質量250～300 g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供，飼養地點為北京大學醫學部實驗動物科學部，動物每3 只一籠，自由飲水和攝食，飼養環境為SPF環境，節律光照，室溫（22±1）℃，相對濕度40%～50%。動物實驗通過北京大學醫學部倫理委員會審核，動物飼養管理及實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》。

對照組動物飼料為AIN-93G飼料（AIN-93G飼料組分（以下均為質量分數）：20.0%酪蛋白、13.2%糊化玉米淀粉、10.0%蔗糖、39.7%玉米淀粉、5.0%纖維素、7%豆油、3.5%礦物質混合物、0.3% L-胱氨酸、1.0%維生素混合物、0.25%酒石酸膽堿、0.001 4%叔丁基對苯二酚）、普通飼料組飼以普通大鼠維持飼料（普通大鼠維持飼料組分：玉米、面粉、大豆、魚粉、草粉、碳酸鈣、磷酸氫鈣、礦物鹽、維生素等，主要參照GB 14924.3-2010《實驗動物 配合飼料營養成分》配制），飼料合格證號SCXK（京）-2009-2008，膳食核苷酸干預組飼料以AIN-93G飼料（由北京華阜康生物科技股份有限公司提供）配方為基礎，分別添加0.04%、0.16%的混合5'-核苷酸。

混合核苷酸（5'-腺嘌呤核苷酸（adenosine 5'-monophosphate5'-AMP）、5'-胞嘧啶核苷酸（cytosine 5'-nucleotides，5'-CMP）、5'-鳥嘌呤核苷酸二鈉（guanosine 5'-monophosphate disodium，5'-GMPNa2）、5'-尿嘧啶核苷酸二鈉（uridine 5'-monophosphate disodium，5'-UMPNa2）的質量比為22.8∶26.6∶20.4∶30.2） 大連珍奧生物工程股份有限公司；無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑北京有限公司；EnzyChromTM乙醇檢測試劑盒（ECET-100） 美國Bioassay Systems公司；伊紅美藍瓊脂（HB0107）、乳酸桿菌LBS瓊脂（HB0385）、雙歧桿菌BS培養基（HB0394）、腸球菌瓊脂（HB0133） 青島海博生物技術有限公司。

1.2動物分組及處理

SPF級雄性Wistar大鼠42 只，適應性喂養2 周，隨機分為對照組、酒精組、葡萄糖等熱量組、普通飼料組及0.04%、0.16%（質量分數，下同）5'-核苷酸干預組，每組7 只，除對照組和葡萄糖等熱量組外，其余28 只大鼠以50%乙醇灌胃，乙醇初始灌胃量為2 g/（kg·d）（以體質量計，下同），后逐漸增加劑量，2 周后達到8 g/（kg·d），維持此劑量，每天1～2 次灌胃，繼續干預5 周，開始灌胃乙醇記為第1周第1天，結束時為第7周。對照組、酒精組和葡萄糖等熱量組大鼠喂養AIN-93G飼料，普通飼料組喂養國標規定配方的普通大鼠維持飼料（含一定量的核苷酸），5'-核苷酸干預組大鼠飼料是在AIN-93G飼料基礎上添加不同劑量5'-核苷酸所制成。

1.3樣本采集

于第48天收集各組大鼠新鮮糞便，置于無菌EP管中保存；干預7 周后，禁食12 h，經股動脈采血后頸椎脫臼處死全部大鼠，離心得血清，迅速留取大鼠肝臟，完整盲腸并稱質量，按公式（1）、（2）分別計算大鼠的肝體比和盲體比。

1.4相關指標測定

1.4.1一般情況觀察

實驗過程中每周觀察各組大鼠的一般情況，包括毛色、精神狀態、攝食及日常活動情況等。每周稱量一次大鼠體質量、進食量。

1.4.2血清乙醇體積分數測定

在干預第45天將酒精組、普通飼料組及0.04%、0.16% 5'-核苷酸干預組大鼠用50%乙醇灌胃后0.5、1、2、3 h不同時間點進行尾靜脈采血，每次采血量約為0.5 mL，3 000 r/min離心10 min得血清，按照EnzyChromTM乙醇檢測試劑盒說明書進行血清乙醇體積分數測定。

1.4.3血清生化指標測定

實驗結束股動脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，使用全自動生化儀檢測血清生化指標，包括血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）活力及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLB）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力。

1.4.4大鼠腸道菌群培養

按照培養基說明配制不同菌種專用培養基，取大鼠新鮮糞便0.1 g，加入10 mL無菌生理鹽水中，即為10－2g/mL質量濃度稀釋菌液。將裝有稀釋菌液的EP管置于漩渦振蕩器上充分振蕩，使其均質化后，再依次進行10 倍梯度稀釋至10－6g/mL。雙歧桿菌使用雙歧桿菌BS培養基培養，采用10－4、10－5、10－6g/mL 3 個質量濃度，點樣體積2 ?L；乳酸桿菌采用10－3、10－4、10－5g/mL 3 個質量濃度，滴種5 ?L標本液于乳酸桿菌LBS培養基上；腸桿菌、腸球菌分別使用伊紅美藍培養基和腸球菌培養基培養，均采用10－4、10－5g/mL兩個質量濃度，點樣體積5 ?L。腸桿菌、腸球菌置于37 ℃生化培養箱內倒置培養24 h。雙歧桿菌、乳桿菌置于37 ℃恒溫厭氧罐內倒置培養48 h。培養結束后，觀察計數，記錄每克糞便的菌落數，以菌落形成單位（colony forming unit，CFU）表示。按照公式（3）、（4）進行細菌計數，并取對數轉換（lg（CFU/g））進行統計分析。

1.5統計學處理

2　結果與分析

2.1膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠體質量的影響

實驗期間，酒精組大鼠出現多飲、少尿、消瘦、活動減少，精神萎靡，毛色雜亂無光澤的癥狀，5'-核苷酸干預組大鼠毛色較光澤，狀態較活躍，飲水量正常，尿量較酒精組增多，總體狀態有所緩解。

第0周至第7周各組大鼠的體質量變化如圖1所示，實驗期間對照組和葡萄糖等熱量組大鼠體質量增長明顯，酒精組體質量增長緩慢甚至下降。干預第3～7周，酒精組體質量明顯低于對照組（P＜0.05），干預第6、7周，0.04% 5'-核苷酸干預組與酒精組相比體質量明顯增加（P＜0.05）。

圖1　大鼠體質量-時間變化圖（n=7）=7Fig.1 Effect of administration for 7 weeks on body weight in rats （n = 7）

2.2膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠血清乙醇體積分數的影響

圖2　大鼠血清乙醇體積分數-時間變化圖（n=7）=7Fig.2 Plots of serum alcohol concerntration against post-administration time （n = 7）

如圖2所示，在灌胃乙醇后0.5～2 h，與酒精組和普通飼料組相比，5'-核苷酸干預組血清乙醇體積分數上升緩慢，0.16% 5'-核苷酸干預組有統計學差異（P＜0.05），0.04% 5'-核苷酸干預組2 h時血清乙醇體積分數亦明顯低于普通飼料組，但是在2 h后5'-核苷酸干預組與酒精組相比血清乙醇體積分數下降無顯著差異。

2.3膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠肝臟功能和血脂代謝相關指標的影響

表1　肝功能及血脂代謝相關指標（n =7）Table 1 Parameters related to liver function and lipid metabolism （n = 7）

如表1所示，酒精組大鼠血清A L T、T B I L、TG、LDH水平與對照組相比明顯升高（P＜0.05），TP、ALB、GLB及HDL-C水平較對照組明顯降低（P＜0.05）。普通飼料組ALT、TBIL、ALB與酒精組有同樣的趨勢。與酒精組相比，核苷酸干預能夠明顯降低ALT、TBIL、TG、LDH水平，并能夠增加TP、ALB及HDL-C水平（P＜0.05）。

2.4膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠臟體比的影響

圖3　各組大鼠臟體比（n=7）=7Fig.3 Organ weight/body weight ratios of rats in each group （n = 7）

如圖3所示，5'-核苷酸干預組大鼠肝體比較普通飼料組、葡萄糖等熱量組明顯升高（P＜0.05）；0.16% 5'-核苷酸干預組大鼠肝體比明顯高于酒精組（P＜0.05）。酒精組和普通飼料組盲體比明顯高于對照組及葡萄糖等熱量組（P＜0.05）；0.04%、0.16% 5'-核苷酸干預組盲體比較普通飼料組明顯下降（P＜0.05），其中0.04% 5'-核苷酸干預組與酒精組相比盲體比明顯下降（P＜0.05）。

2.5膳食5'-核苷酸對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群數量的影響

表2　大鼠糞便腸道菌群數量（n==77）Table 2 Gut flora in feces （n == 77）lg（CFU/g）

如表2所示，與對照組相比，酒精組大鼠糞便乳酸桿菌數量明顯減少（P＜0.05），腸球菌及大腸桿菌數量明顯增多（P＜0.05）。膳食補充不同劑量5'-核苷酸后，大鼠糞便乳酸桿菌數量較酒精組明顯增多（P＜0.05），同時腸球菌及腸桿菌數量較酒精組明顯減少（P＜0.05）。普通飼料組腸道菌群較酒精組沒有明顯改善。

3　討 論

酒精對人體的生理和健康具有復雜的影響。酒精不僅僅能夠使人成癮，也是一種胎兒致畸物［18］和成人神經毒素，亦是肝臟和心血管疾病、炎癥、骨流失和骨折的致病因素。有研究顯示，酗酒者日常每天攝入的能量有50%來自酒精，所以容易導致營養不良［19］。本研究采用酒精灌胃后，大鼠體質量增長緩慢，在第7周甚至有下降趨勢，說明酒精組大鼠出現營養不良狀況，添加5'-核苷酸的飼料喂養大鼠后，大鼠體質量較酒精組明顯增加，這說明核苷酸能夠改善酒精所引起的大鼠營養不良。

人體攝入的酒精大量由小腸吸收入肝臟代謝，長期過量酒精攝入會損傷肝臟解毒功能及脂質代謝的功能。給大鼠每天飼喂含酒精的飼料后，肝臟脂肪含量進行性增多，而且在早在第2周組織學就能觀察到脂肪變性，且血清ALT活力升高，第8周即出現酒精性脂肪性肝炎，血清堿性磷酸酶活力亦明顯升高［5］。本研究結果顯示，大鼠在灌胃酒精7 周時血清ALT、LDH含量和TBIL水平明顯升高，TP、ALB、GLB水平明顯降低，提示酒精灌胃導致大鼠肝臟功能受損；而且血清TG水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低，提示酒精灌胃致使大鼠肝臟脂質代謝能力亦受損。5'-核苷酸干預組大鼠ALT、LDH活力和TBIL、TG水平較酒精組明顯降低，TP、ALB、GLB水平明顯升高，這與之前本課題組研究結果類似［20-21］。此外，與酒精組相比，5'-核苷酸干預組的肝體比也明顯升高，5'-核苷酸干預組大鼠經酒精灌胃后血乙醇體積分數上升緩慢。所以，膳食補充5'-核苷酸能夠改善酒精引起的肝臟功能損傷，調節肝臟脂質代謝，促進肝臟蛋白質的合成以及肝臟修復。

肝臟70%的血液供應來自于腸道，是防御腸道病原的第一道防線［4］。正常情況下，肝臟參與了腸道來源毒素和微生物產物的解毒，通過肝細胞和枯否細胞的形式吸收組織細胞的損傷和炎癥因子。 Kirpich等［10］的人群研究證實，飲酒者與正常對照組相比糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌均明顯減少。動物實驗證實日常酒精消耗會影響結腸黏膜微生物構成，腸道菌群失調是酒精誘導的內毒素血癥的重要機制之一［12］，而且酒精誘導的腸泄露和內毒素血癥在脂肪性肝炎之前已經發生，它們并不是由酒精性脂肪性肝炎所導致，說明酒精所致的腸泄露和內毒素血癥很可能是酒精性脂肪性肝炎發生的協同因素［5］。革蘭氏陰性菌是內毒素的主要來源，本研究糞便腸道菌群培養結果顯示，酒精組大鼠糞便中乳桿菌較對照組及等熱量組明顯降低，腸球菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌明顯增多，進一步證明了酒精組大鼠腸道菌群紊亂，革蘭氏陰性菌數量增多，雙歧桿菌及乳桿菌等有益菌減少。膳食核苷酸補充能夠增加DNA和RNA的合成，通過增加核苷酸庫，提高核苷酸的利用率，增強腸道細胞的生長和分化［15］。添加核苷酸能夠直接抑制嬰幼兒擬桿菌-卟啉單胞菌屬-普氏菌屬細菌的生長，促進雙歧桿菌生長［16］。給C57BJ/6N雄性小鼠喂食含有5%乙醇的Lieber-DeCarli液體飼料8 周，在喂養最后兩周給予鼠李糖乳桿菌能夠明顯抑制酒精誘導的內毒素血癥和肝臟脂肪變性發生，改善肝臟功能［13］。以上核苷酸促進雙歧桿菌的研究主要是針對嬰幼兒所進行的，或者更多是體外研究，動物體內研究甚少，本研究結果中，無論是酒精組還是5'-核苷酸干預組大鼠糞便中雙歧桿菌數量并沒有明顯差異，該結果可能是物種差異性所致，需要進一步實驗驗證。但是與酒精組相比，5'-核苷酸干預組乳酸桿菌數量較酒精組明顯增多，腸球菌和大腸桿菌數量明顯減少，對腸道菌群的改善作用較明顯，而且優于普通飼料組。促進腸道菌群結構的改善，進而緩解內毒素血癥所致的肝臟功能障礙可能是5'-核苷酸保護酒精性肝損傷的機制之一。

本研究發現，普通飼料組大鼠在灌胃酒精后，體質量增長緩慢甚至下降，血清乙醇體積分數明顯高于5'-核苷酸干預組，肝臟功能及血脂代謝相關指標、糞便中腸道菌群數量較酒精組亦沒有明顯改善，甚至有加重趨勢。在國內，AIN-93G大鼠飼料與符合GB 14924.3-2010的普通大鼠維持飼料均適用于維持大小鼠生長，目前并沒有相關文獻比較二者對大鼠生長的影響，二者原料不同，且AIN-93G中酪蛋白含量為20%，普通大鼠維持飼料中粗蛋白含量≥18%，其余營養成分含量接近。普通大鼠維持飼料組分為玉米、面粉、大豆、魚粉、草粉、碳酸鈣、磷酸氫鈣、礦物鹽、維生素等，原料里可能含有一定比例的核苷酸，本研究結果并沒有發現其能夠改善酒精性肝損傷及腸道菌群紊亂，該結果僅能提示普通飼料喂養并不能改善大鼠酒精性肝損傷及腸道菌群紊亂。由于普通飼料組大鼠飼喂的基礎飼料與酒精組及5'-核苷酸干預組基礎飼料雖然營養成分相近，但原料不同，故三者間并不具有可比性，該結果還需要更多的動物研究證明。

本實驗采用50%乙醇灌胃，成功誘導大鼠肝臟功能損傷，實驗結果證明膳食添加5'-核苷酸可以有效降低大鼠血清轉氨酶、乳酸脫氫酶活力和血脂水平，促進肝臟細胞再生，緩解乙醇灌胃后血清乙醇體積分數的升高，并發現5'-核苷酸可能通過增加乳酸桿菌等有益菌數量，降低腸桿菌、腸球菌等有害菌數量來改善腸道菌群構成，促進腸道恢復穩態，從而促進肝臟修復。以上結果為5'-核苷酸應用于酒精性肝損傷的臨床營養治療提供了實踐證明和理論依據，但是需要進一步在體外及人群實驗中得到證實。

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Effects of Dietary 5'-Nucleotides on Gut Microbiota in Rats with Ethanol-Induced Liver Injury

CAI Xiaxia， BAO Lei， WANG Nan， XU Meihong， LI Di， WU Xin， ZHANG Zhaofeng， LI Yong*
（Department of Nutrition and Food Hygiene， School of Public Health， Peking University， Beijing 100191， China）

Purpose： To observe the effects of dietary 5'-nucleotides on the gut microbiota of rats with alcoholic liver injury. Methods： Male Wistar rats were given either alcohol or glucose by gavage for 7 weeks. A subgroup of rats was also fed with diets including 0.04% or 0.16% 5'-nucleotides. Body weights， liver to body weight ratio， and the levels of serum alcohol concentration， transaminase activities， triglycerides and total proteins were tested. Stool cultures were performed at the 7thweek， and the colony-forming units per gram stool were determined. Results： The alanine aminotransferase，triglycerides， lactate dehydrogenase and total bilirubin were significantly elevated， and total proteins， albumin and globulin were significantly decreased in alcoholic live injury group when compared to vehicle or glucose groups. Dietary 5'-nucleotides could increase body weights and the ratio of liver weight to body weight， and decrease the levels of serum ethanol， alanine aminotransferase， triglycerides， lactate dehydrogenase and total bilirubin in rats with alcoholic live injury. Total protein， albumin and globulin were significantly increased in nucleotide groups when compared to alcoholic live injury group. Nucleotide groups had significantly increased number of benefical lactobacilli， and reduced number of pathogenic Escherichia coli and enterococci. Conclusion： Dietary 5'-nucleotides could improve ethanol-induced liver injury， and the mechanism may be associated with regulation of the gut microbiota.

5'-nucleotides； alcoholic liver injury； gut microbiota； alanine aminotransferase； alcoholic steatohepatitis

R151.2

A

1002-6630（2015）15-0212-05

10.7506/spkx1002-6630-201515039

2014-10-30

蔡夏夏（1988—），女，博士研究生，研究方向為營養與疾病。E-mail：shuiruoran8886@126.com

李勇（1958—），男，教授，博士，研究方向為營養與疾病。E-mail：liyong@bjmu.edu.cn