核酸適配體技術在食品重金屬檢測中的應用研究進展

于寒松，隋佳辰，代佳宇，宋戰昀*，鄭 言，楊 倩，王向輝，張 健，李敏思

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春 130062；3.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

核酸適配體技術在食品重金屬檢測中的應用研究進展

于寒松1，隋佳辰1，代佳宇1，宋戰昀2，*，鄭 言1，楊 倩1，王向輝1，張 健1，李敏思3

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春 130062；3.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

近年來食品中重金屬超標對人們健康構成了威脅，所以對食品中重金屬檢測技術的開發成為了重要研究內容。雖然傳統的檢測技術對重金屬進行了高選擇性和高靈敏度的檢測，但是仍需要一種簡單、快速、有效、成本低廉的方法用于食品安全領域的快速檢測。核酸適配體為一段單鏈DNA或者RNA序列，是經體外篩選技術篩選出的能特異結合蛋白質或其他小分子物質的寡聚核苷酸片段。核酸適配體具有靶分子廣、靈敏度高、特異性強、穩定性好等特點，因而被廣泛用于食品安全檢測領域。本文綜述近年來核酸適配體技術對食品中Hg2+、As3+、Pb2+的檢測，并對核酸適體技術在食品重金屬檢測領域的應用前景進行了展望。

重金屬；核酸適配體；配體指數級富集系統進化技術；檢測

食品安全問題是21世紀重大的民生問題，它關系到人們的生活質量與衛生安全，關系到社會的和諧與穩定。隨著經濟的快速發展，現代工業化進程的加快，重金屬污染問題已經對生態環境、農業可持續發展等構成了嚴重的威脅，尤其對食品安全的影響日益加劇［1］。重金屬是指比重＞5的金屬，約有45 種，如汞、銅、鉛、鎘、鐵、鋅、錳、鈣、鉻等。從食品安全方面考慮，目前最引人關注的是汞、鎘、鉛、鉻，以及類金屬砷等有顯著生物毒性的重金屬。Hg2+是一種可以在人體內蓄積的高毒性的重金屬，并以天然態廣泛存在于自然界中，在魚類及貝類中常常以甲基汞的形式存在。Hg2+的危害主要是進入人體后，在腦組織中逐漸積累，達到一定量時就會對腦組織造成損害，進而侵害神經系統，尤其是中樞神經系統。其表現為說話不清、精神失常、運動失調，甲基汞還可侵害胎兒，使新生兒發生先天性疾病等。大型的汞中毒案例如“水俁病”事件嚴重影響人類的生命安全。因此，對Hg2+進行特異性和高靈敏度檢測具有重要意義。砷，別名“砒霜”，是危害人們身體健康最嚴重的污染物之一，廣泛存在于自然界中。砷的攝入可能通過含砷的水直接攝入人體，或者通過含砷的農作物或水產品等間接攝入人體。砷中毒分為急性和慢性兩種。急性砷中毒主要表現為胃腸炎癥狀，嚴重者可導致中樞神經系統麻痹而死亡，病人常有七竅流血的現象。慢性砷中毒癥狀除有一般的神經衰弱癥候群外，還有皮膚色素沉著、過度角質化、末梢神經炎等。其中存在的4 種價態以As3+和As5+最為常見，水體中的無機砷尤其以As3+的毒性最高，是其他砷化合物毒性的60 倍。鉛是一種毒性較強的灰白色金屬，少量的鉛就會對人體造成非常大的傷害。鉛中毒是一種蓄積性中毒，具有持久性和高度積累性。鉛中毒后往往表現為智力低下、反應遲鈍、貧血等慢性中毒癥狀。鉛對胎兒和幼兒生長發育影響最大，這些嚴重的后果使得人們對鉛的檢測十分關注。

1　傳統重金屬檢測方法

目前，食品檢測中傳統的重金屬檢測方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光度法、電感耦合等離子體原子發射光譜、流動注射原子吸收和電感耦合等離子體質譜等［2］。這些傳統的重金屬檢測方法雖然應用比較成熟、靈敏度較高，但同時存在許多局限性，如：儀器價格昂貴、耗時長、樣品處理復雜、攜帶不方便、無法連續監測及現場測定，需要專業人員進行操作等，難以滿足簡便、快速、實時檢測重金屬的實際需要［3］。表1列舉了幾種對重金屬離子Hg2+、As3+、Pb2+的常見傳統檢測方法。近些年雖發展了一些快速檢測重金屬的方法，如：酶分析法、試紙法、免疫分析法等快速檢測方法，但與傳統的檢測方法相比，大部分快速檢測方法只能對被檢物定性或半定量檢測，靈敏度和準確性低于傳統檢測方法［4］。因此，尋求一種簡單、快速、靈敏的重金屬離子檢測技術，仍然是人們不斷追求的目標。

表1　傳統重金屬檢測方法Table 1 Traditional detection methods for heavy metals

2　核酸適配體重金屬檢測方法

1990年，Ellington［17］和Tuerk［18］等用配體指數級富集系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術分別篩選出能與T4 DNA聚合酶和有機染料特異性結合的隨機寡核苷酸，并由Ellington和Szostak命名為核酸適配體（aptamer）［19］，經過20 年的研究，它已發展成為一類廣受關注的新型識別分子。由于核酸適配體的高親和性與高特異性，被喻為“化學抗體”。目前分子生物檢測技術通常采用抗原與抗體相互作用的機理模式，但是源于蛋白受體的性質和蛋白受體的合成，在多組分檢測和非常復雜的樣品分析中限制了抗體檢測技術的廣泛應用。與之相比，核酸適配體檢測方法不僅靈敏度高、檢測性強，而且可以對樣品進行實時快速檢測，目前已經成為分子生物學、臨床診斷、醫學研究、環境監測、快速檢疫等許多領域中的研究熱點。因此，核酸適配體檢測技術成為快速檢測重金屬的一種新的手段。核酸適配體是一類新的具有高選擇性的功能識別分子，它是通過SELEX技術體外篩選出來的能特異結合特定靶分子的寡聚核苷酸片段，具有合成容易、靶分子廣、特異性高、親和力強、靈敏度高、檢測成本低廉、耗時短、準確性高、易于現場檢測、安全可靠等優點，與食品傳統檢測方法相比非常適用于食品安全的快速檢測，在食品安全檢測中有著良好的應用前景。表2列舉了幾種對重金屬Hg2+、As3+、Pb2+利用核酸適配體技術檢測的方法。隨著近年來現代分子生物學技術的快速發展與SELEX技術的不斷創新，核酸適配體已經得到了較為廣泛的發展，且已經廣泛地應用到各項研究領域中，并發揮著重要的作用。目前，研究者們已經對重金屬Hg2+、As3+、Pb2+等篩選出相關適配體，并對此進行了進一步的研究檢驗。本文主要針對食品安全分析中核酸適配體技術對重金屬離子Hg2+、As3+、Pb2+檢測方面的最新研究進展進行綜述，并對其在食品中重金屬檢測的研究前景進行展望。

表2　核酸適配體重金屬檢測方法Table 2 Aptamers detection methods for heavy metals

續表2

3　核酸適配體技術在食品重金屬檢測中的應用

核酸適配體具有諸多獨特的優點吸引了眾多領域的研究者。利用核酸適配體作為高選擇性識別元件，研究者們在食品安全領域已經建立了許多檢測重金屬的方法。作為受體分子，由于核酸適配體針對分析物是均等合成的產生過程，使它們可以廣泛應用于多樣化的目標分析物陣列中。下面主要以Hg2+、As3+和Pb2+為例，針對核酸適配體技術在食品中重金屬檢測的最新應用研究進展做如下綜述。

3.1在Hg2+檢測中的應用

隨著人們對Hg2+的高度重視和不斷研究，以及SELEX篩選技術的不斷發展。目前，已經篩選出了與Hg2+具有高特異性、高親合性結合的核酸適配體，并展現了良好的應用前景。Liu Chiwei等［19］根據富含胸腺嘧啶（T）的ssDNA可與Hg2+特異性結合形成發卡結構這一特點，構建了Hg2+的傳感器。此傳感器基于一種DNA-AuNPs作探針，通過T-Hg2+-T結構的改變形成DNA-Hg2+的復合物從而改變ssDNA的狀態，AuNPs發生聚集、顏色發生改變，進而實現對Hg2+進行檢測。當Hg2+濃度為0.5～5.0 μmol/L時，對Hg2+的檢出限為250 nmol/L。與之相比，Li Di等［32］根據同樣的原理，并在此基礎上對其進行優化，構建的傳感器具有更高的靈敏度，對Hg2+的檢出限為1 nmol/L。Xue Xuejia等［33］報道了一種用ssDNA修飾AuNPs，利用比色法檢測Hg2+的傳感器。在室溫條件下將Hg2+加入到到含有寡核苷酸-AuNPs探針的水溶液中，其中寡核苷酸與多個胸腺嘧啶（T-T）錯配導致AuNPs聚集，進而根據顏色變化檢測Hg2+。Lee等［34］根據AuNPs的分散度容易受到環境的影響，進而產生顏色轉變的原理，實現對Hg2+的檢測。當溶液中存在ssDNA時，ssDNA會吸附在AuNPs表面阻止AuNPs的聚集。當Hg2+存在時，Hg2+與DNA-AuNPs探針形成T-Hg2+-T的配位絡合物，提高了雜交的DNA-AuNPs探針的解鏈溫度，引起了AuNPs的聚集，溶液由紅變藍。該方法具有很高的靈敏度和選擇性，可通過比色快速讀出。

Wang Hao等［20］基于Hg2+誘導富含胸腺嘧啶且用FAM標記的ssDNA的構象變化，ssDNA和dsDNA與AuNPs之間的靜電親和力的差異，再結合AuNPs建立的熒光機制Hg2+傳感器。其基本原理是：當Hg2+不存在時，ssDNA通過靜電力吸附AuNPs表面，阻止其在高鹽濃度下的聚集。AuNPs對熒光染料有熒光淬滅作用，從而ssDNA中的熒光被淬滅。當加入Hg2+時，Hg2+與ssDNA中的堿基（T）特異結合，從而使ssDNA變成dsDNA。因dsDNA與AuNPs結合力較弱，因而可以從AuNPs表面脫落下來，熒光得到恢復。該系統表現出的Hg2+動態響應范圍為9.6×10－8～6.4×10－6mol/L，此FAM-DNA-AuNPs傳感器對Hg2+檢出限為0.4 nmol/L。Ono等［21］根據“熒光基團和淬滅基團彼此的距離小于一定范圍后，會發生熒光能量轉移，熒光物質被淬滅”這一原理，建立了利用核酸適配體檢測Hg2+的熒光傳感器，其中把熒光基團和淬滅基團分別修飾到核酸適配體（富含胸腺嘧啶）的3'端和5'端。根據熒光強度和Hg2+濃度的變化實現了對Hg2+的檢測，檢測限到40 nmol/L。Jiang Zhiliang等［35］用ssDNA修飾10 nm的AuNPs，以獲得核酸適配體修飾納米金共振散射光譜探針（AuNPs-ssDNA），用于檢測Hg2+。在NaCl存在條件下，Hg2+與AuNPs-ssDNA相互作用T-Hg2+-T錯配形成非常穩定的雙鏈和釋放納米顆粒聚集到大納米金簇，引起共振散射強度在540 nm波長處呈線性增強。根據以上原理，可以通過核酸適配體修飾納米金共振散射法實現對Hg2+的快速檢測，檢出限為0.7 nmol/L。吳繼魁等［22］利用胸腺嘧啶與Hg2+的高親合作用和電化學溶出技術相結合設計了一種具有高選擇性的Hg2+生物傳感器。將一段巰基（-SH）修飾的多胸腺嘧啶寡核苷酸（5'-SH-T15-3'）核酸序列（核酸適配體）通過Au-S鍵作用，組裝到金電極表面。然后用疏基乙醇封閉電極表面即得到多胸腺嘧啶寡核苷酸（polythymine oligonucleotide，PTO）/Au電極。利用電極上核酸適配體中的堿基T與Hg2+特異性結合，從而把Hg2+富集到電極表面，經緩沖液洗滌后，在10 mmol/L氯酸鈉（pH 7.2，1 mol/L NaClO4）溶液中將Hg2+電化學還原成Hg，然后利用陽極溶出伏安掃描測定汞的氧化電流信號。以此實現對Hg2+的檢測，檢測限達60 pmol/L。Liu Chiwei等［36］利用凝血酶結合核酸適配體作探針，供體的5'和3'末端分別用熒光素和淬滅劑做標記。核酸適配體與鉛和汞分別形成G-四分體結構和發卡結構，通過熒光團和淬滅劑之間的熒光共振能量轉移導致該熒光強度減小，從而實現了對鉛和汞的同時測定。據了解，這是一個以單一的核酸適配體為基礎的傳感器，可以同時檢測Hg2+和Pb2+的第一實例。Chung等［37］研發了一種表面增強拉曼光譜微滴傳感器。此方法基于微流體傳感器，利用表面增強拉曼散射光譜迅速且高靈敏度微量分析溶液中Hg2+。核酸適配體-改性的納米顆粒作為高功能的感測探針，Hg2+和核酸適配體-改性的納米粒子之間所有反應的過程是在一專門設計的微滴信道中進行。小水滴，包括樣品試劑被油相彼此分離并連續地沿著通道流入。此兩相液-液分割流動系統由于包封液滴內的局部試劑防止聚合膠體吸附到通道壁上，結果減少了停留時間分布。通過此方法實現了對Hg2+的檢測，檢測限可達10 pmol/L。

3.2在As3+檢測中的應用

近年來核酸適配體在分析化學領域中備受研究者們的關注，并被認為是一種重要的重金屬檢測工具，目前已經針對As3+篩選出了相應的核酸適配體，但以核酸適配體技術檢測砷的文獻是罕見的。Kim等［23］篩選出一種核酸適配體，通過構型轉換形成特定的二級結構用于綁定地下水中As3+和As5+，結合常數分別可達7 nmol/L和5 nmol/L。其中核酸適配體是由砷核酸適配體親和柱（把砷固定在親和性-凝膠樹脂上創建的親和柱）在體外篩選得到的。核酸適配體ARS-1到ARS-8通過表面等離子共振的定量分析，揭示了ARS-3核酸適配體具有最高的親和力，ARS-3與質量濃度范圍為28.1～739.2 mg/L的As3+溶液溫育5 min之后可完全除去溶液中的As3+。Wu Yuangen等［24］通過核酸適配體和AuNPs作用，利用比色法實現對As3+的快速檢測。As3+與砷核酸適配體相互作用特異性結合，形成一個As3+-核酸適配體復合物，而帶有正電荷的聚二烯基丙二甲基氯化銨會導致帶負電荷的AuNPs的聚集，并導致明顯的顏色變化，這使得比色法檢測As3+具有較高的選擇性，檢測限為70 nmol/L。

2013年王法澤［25］基于氯化血紅素催化3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB），根據顯色比色法的原理檢測As3+。當溶液中不含As3+時，核酸適配體通過堆積作用可以抑制氯化血紅素的催化活性，對底物TMB的催化能力減弱，溶液呈現藍色。當溶液中含有As3+時，As3+可以與ssDNA特異性結合形成復合結構，這種復合結構會阻礙氯化血紅素與ssDNA的堆積作用，因此氯化血紅素催化活性得到恢復并逐漸增強，進一步氧化TMB，溶液由藍色逐漸變為黃色，以此建立了核酸適配體比色法檢測As3+。Wu Yuangen等［26-27］基于一種共振瑞利散射（resonance Rayleigh scattering，RRS）光譜法建立的一個核酸適配體生物傳感器，用于As3+的檢測。在As3+檢測之前，首先在結晶紫溶液中通過控制砷結合核酸適配體濃度，出現具有不同大小的納米顆粒，經光子相關光譜法和掃描探針顯微鏡證實此結果。As3+的引入確實改變納米粒子的大小，且引起了310 nm波長處的散射強度很大的變化。因此利用適當大小的納米顆粒作為目標識別元件，結合RRS光譜測定分析，一種有效的As3+檢測生物傳感器被開發出來。此生物傳感器的動態范圍為0.1～200 μg/L，檢測限低至2.7 nmol/L。

3.3在Pb2+檢測中的應用

近年來，基于核酸適配體技術的迅速發展，核酸適配體技術對Pb2+檢測方法的研究也引起人們極大的興趣。目前，核酸適配體已經同許多技術和方法相結合以擴展分析范圍或提高分析效果，如：比色法、熒光法、電化學法、共振散射光譜等方法。Liu Juewen等［28］基于脫氧核酶指導AuNPs的聚集設計了一種高靈敏度和高選擇性比色法檢測Pb2+的生物傳感器，這個概念可以成熟的應用到設計核酸酶/納米傳感器。其中，關鍵的步驟是體外篩選，可以顯著擴大納米材料的應用范圍。此法比色法生物傳感器簡單準確，靈敏度高達0.1 μmol/L。Wang Zidong等［38］利用DNA核酶調節未經修飾AuNPs的聚集度，采用dsDNA對某些二價金屬離子具有催化活性，從而設計了比色法檢測Pb2+的生物傳感器，此類傳感器主要由AuNPs和核酸適配體組成。當體系中不存在Pb2+時，隨著高濃度NaCl的加入使AuNPs溶液顏色由紅變藍。當體系中引入Pb2+時，使已聚集的AuNPs重新分散，顏色由藍變回紅，以此建立比色法實現對Pb2+的檢測。Wei Hui等［29］報道了一個用無標記17E脫氧核酶傳感器對Pb2+檢測的方法，此方法簡單且靈敏度高。實驗中使用未修飾的AuNPs，展開的ssDNA可以吸附在檸檬酸鹽上從而保護AuNPs，而dsDNA不能。通過此方法，在Pb2+存在條件下，由脫氧核酶的底物裂解可以通過AuNPs的顏色變化進行監測，從而實現對Pb2+檢測。此方法可以在20 min內實現對Pb2+的檢測，檢測限為500 nmol/L。

凌紹明等［30］利用核酸適配體修飾納米金作探針，利用共振散射光譜法快速檢測痕量Pb2+。在pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中和30 mmol/L NaCl存在下，核酸適配體-AuNPs穩定而不聚集，其散射信號較弱。Pb2+與該探針中的核酸適配體形成非常穩定的G-四分體結構，并釋放出AuNPs。在NaCl作用下，AuNPs聚集形成較大的微粒，在552 nm波長處的共振散射峰增強。Pb2+濃度越高，AuNPs微粒聚集體越多，共振散射峰強度越大，據此建立了核酸適配體納米金共振散射光譜法，實現了對Pb2+的靈敏檢測，檢出限為0.03 nmol/L Pb2+。莫志宏等［31］首先根據巰基能與金形成Au-S鍵原理，利用納米探針和G-四聯體比色法簡便快速檢測Pb2+。他們選用的寡核苷酸3'端含有4 個連續的鳥嘌呤，用于與Pb2+形成G-四聯體結構，同時在核酸的5'端修飾巰基，可以將核酸修飾在AuNPs表面，這樣既可以提高AuNPs性能，又增強其抗干擾能力。當溶液中添加Pb2+之后，修飾在AuNPs探針上的G寡核苷酸就會與Pb2+結合，形成穩定的G-四聯體結構，從而導致AuNPs探針凝聚變色，使溶液從紅色變成藍紫色，繼而建立了利用比色法來檢測Pb2+。這種方法展現了良好的選擇性，獲得了3.4 nmol/L的檢測限。

4　結 語

在食品安全領域中，傳統重金屬檢測方法雖然展現出了靈敏度高、準確性好等諸多優點，但其同時存在許多不足，主要有以下4 點：第一，前處理耗時費力；第二，儀器設備較大、較笨重，不利于現場實時快速檢測；第三，操作較困難，需專業技術人員培訓；第四，成本較高。核酸適配體作為一種特異性強、穩定性好和靶分子廣的分子識別探針，廣泛備受研究者們的關注。與傳統重金屬檢測方法相比較，主要有以下幾點優勢：第一，靶分子廣、無免疫原性；第二，操作簡單、耗時短；第三，檢測成本低廉；第四，體積小，易于現場快速檢測；第五，精確識別、易體外合成與修飾；第六，被喻為“第四代化學抗體”，特異性高和親和力強，可替代單克隆抗體等。由于核酸適配體的諸多優勢，在各檢測領域具有很強的發展潛質，同時非常適合于食品應急事件中的快速檢測。目前，雖然篩選出核酸適配體的重金屬離子只局限于Hg2+、Pb2+、As3+等少數幾個，但已實現核酸適配體對其簡單、快速的檢測。

核酸適配體技術在食品安全領域也面臨著一些問題與挑戰。例如：食品中有毒有害物質繁多，除了重金屬以外還有許多有害因子，這會大大影響核酸適配體對重金屬檢測的簡便性和靈敏性。如何簡單化食品中的前處理問題，也是核酸適配體技術對食品中重金屬檢測所要面臨的重大難題。本文主要對核酸適配體技術在食品中重金屬檢測的應用研究進展進行了綜述。從上述文獻的調研情況來看，雖然核酸適配體技術近幾年取得了矚目的成果，但對于目前來講，核酸適配體技術的發展還處于初級階段，還有許多有待于開發和研究的內容。今后應在以下兩點做進一步的深入研究：第一，核酸適配體的篩選過程比較繁瑣，且重復性高，費時費力。因此，如何簡單、快速、高效篩選獲得需要的核酸適配體是我們研究的熱點，也是我們需要面臨的一項巨大挑戰。第二，多數研究的核酸適配體只是針對一個目標靶進行檢測，如何一次性對多個分析物進行同時高效、快速、準確的檢測也是我們未來需要面對的一個重大挑戰。總之，在食品安全領域中核酸適配體技術對于重金屬的檢測還有待于進一步的研究與深化。隨著科技的不斷發展與完善，必將有更多的技術和方法與核酸適配體相結合，核酸適配體技術也會越來越完善。相信不久的將來，核酸適配體必將在食品檢測領域發揮越來越重要的作用。

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Advances in the Application of Aptamers to Detect Heavy Metals in Foods

YU Hansong1， SUI Jiachen1， DAI Jiayu1， SONG Zhanyun2，*， ZHENG Yan1， YANG Qian1， WANG Xianghui1， ZHANG Jian1， LI Minsi3
（1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Changchun 130062， China；3. College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

In recent years， excessive heavy metals in foods pose a threat to human health， so the development of techniques to detect heavy metals in foods has become an important research task. Although traditional techniques for heavy metal detection have high selectivity and high sensitivity， a simple， fast， effective and inexpensive method for rapid detection of food safety is still highly desired. Aptamers （aptamer） is a piece of single-stranded DNA or RNA sequence or oligonucleotide fragments obtained by in vitro selection （SELEX， systematic evolution of ligands by exponential enrichment）， which is specifically bound to protein or smaller molecules. As a target molecule with high sensitivity， high specificity and good stability， in recent years， it has been widely used in the fi eld of food safety detection. This article reviews the progress made in recent years in applying aptamer technology for the detection of heavy metals such as Hg2+， As3+and Pb2+in foods and future prospects are discussed.

heavy metal； aptamer； systematic evolution of ligands by exponential enrichment； detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）15-0228-06

10.7506/spkx1002-6630-201515042

2014-10-15

國家自然科學基金青年科學基金項目（31001065）

于寒松（1979—），男，副教授，博士，研究方向為豆制品加工。E-mail：yuhansong@jluhp.edu.cn

宋戰昀（1976—），男，獸醫師，博士，研究方向為核酸適配體。E-mail：zhanyun-song@163.com