基于流動注射光度法的吸光度/留存時間比自動測定過氧化物酶活性方法

李永生　鄭巍　高秀峰

摘 要 本研究給出了流動注射分光光度系統（FI-SP）測定酶活性濃度（Ec）的通用公式Ec=kΔA/Δt； Δt是在酶促反應線性響應區域內試樣塞的平均留存時間；ΔA為平均留存時間處對應的吸光度； k=nV/（εvL），V為樣品注入點到流通池入口之間的管路總容積，n為酶底物與產物的反應摩爾比，ε為產物的摩爾吸收系數，v為注入的酶液體積，L為流通池光程；FI-SP系統確定后k為常數。在此基礎上，將H2O2/過氧化物酶（POD）/愈創木酚（GA）反應體系導入FI-SP系統，建立了一種無需標準曲線的POD活性快速準確測定的新方法。此方法優化后的條件：載流磷酸鹽緩沖液濃度為0.05 mol/L（pH 5.5），進樣體積為40 μL，反應盤管長度200 cm， 1.5 mmol/L H2O2，3.5 mmol/L GA，0.4 mol/L HCl（清洗液），檢測波長470 nm，產物的摩爾吸光系數為0.0125 L（μmol ·cm）。本方法的重現性RSD<0.38%（n=11），分析速度為40樣/h，測定范圍為450～7260 U/L，檢出限為89 U/L。在優化條件及60℃下，用本方法測定了多種白蘿卜中POD活性，結果與動力學曲線法完全相同。

關鍵詞 流動注射分析；過氧化物酶；蘿卜提取液；愈創木酚；過氧化氫

1 引 言

過氧化物酶（POD， EC 1.11.1.7）是一種廣泛存在于植物和動物體內的酶，被應用在臨床檢驗[1]、環境監測[2]、有機合成[3]和食品分析[4]等領域，大多數生化試劑盒都含有POD，其最重要的指標就是酶活性。因此，POD活性的快速準確定量尤為重要。POD能催化酚類或胺類顯色試劑與H2O2的反應；常用的顯色試劑有鄰苯二胺[5]、季胺[6]、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）[7]、鄰苯三酚[8]、愈創木酚（GA）[9]、以及胺和酚類的耦合物[1，10]。這些顯色劑在POD催化下與H2O2反應生成的產物都可通過比色法進行定量，但最常用的顯色劑是低毒性、廉價的GA。早先認為H2O2/POD/GA體系的產物是愈創木酚四聚體（4-GA）[9]，但新的研究發現產物是愈創木酚二聚體（2-GA）[11～13]。我們驗證了此結果并發現該產物不穩定，會很快分解成其它物質而褪色[14]， 這導致采用手工比色法定量POD活性時得到的結果重現性很差。此外，由于該產物不穩定，難以提純，所以只能通過反應物GA的濃度間接地求得反應體系中產物2-GA的摩爾吸光系數（ε）[15]，并用此ε值去計算POD活性；但這又會由于ε差異導致得到的POD活性值產生較大的誤差。

測定POD活性方法除比色法外[16]， 還有熒光光度法[17，18]和化學發光法[19～21]等。測定POD活性的手工熒光法和化學發光法靈敏度高、線性范圍寬；但是，由于POD催化反應的產物激發波長在紫外區，所以被測樣品中存在的雜蛋白會對熒光法產生干擾；手工化學發光法的靈敏度雖高但測定結果的重現性較差。流動注射分析（Flow injection analysis， FIA）作為一種自動化分析技術，具有操作簡便、分析速度快、精度高等優點[22]，它能與各種檢測器組合用于酶活性的自動快速測定[23～25]。Holm[7]用ABTS作為供氫體，利用流動注射光度法對發酵樣品中微生物POD活性進行了測定；但此方法的不足之處是ABTS試劑的價格昂貴且穩定性也較差。本研究選擇價廉、穩定、且被廣泛應用的GA作為供氫體，基于FIA光度法建立了一種新的測定POD活性的分析流路（Flow-injection spectrophotometry for POD， FIA-SP-POD），并對蘿卜提取液中的POD含量及活性進行了測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

安裝10 mm光程流通池的UV-1800PC型紫外/可見分光光度計（上海美譜達）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；800-1型離心機（常州普天儀器制造有限公司）；JYZ-E6型原汁機（九陽股份有限公司）；FIA-3100流動注射處理儀（北京吉天儀器有限公司）；ASB-200恒溫控制器（日本分光株式會社）；CP224S分析天平（德國賽多利斯集團）；pXJ-1C+離子活度計（成都世紀方舟科技有限公司）；SHZ-D循環水式真空泵（鄭州金育科貿有限公司）；800B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

GA （國藥集團化學試劑有限公司）、HRP（≥250 U/mg， Sigma公司）；實驗用水為超純水（電導率0.065 μS/cm）；其余試劑均為分析純。新鮮白蘿卜購于本地超市。

2.2 蘿卜粗酶液制備

稱取50 g新鮮白蘿卜，切成小塊（約1 cm3），置于榨汁機中榨汁，用真空泵將濾渣進行抽濾，合并兩次收集的濾液，然后在4000 r/min下離心10 min；最后用針式過濾器（13 mm/0.45 μm）將離心上清液進行過濾；濾液即為粗酶液， 置于冰箱4℃下保存。

2.3 測定原理

2.4 FIA系統及測定過程

FIA-SP-POD系統見圖1。測定過程為：當雙通道注入閥（V）轉至“采樣”位置時，酶試樣在P1的抽吸作用下充滿樣品定量環（SL），多余的樣品從W2排出，采用P1抽吸采樣，可縮短試樣流經途徑，達到節省試樣目的；當此閥轉至“注入”位置時，PBS緩沖液載流（C）推動SL中“酶樣品塞”進入反應盤管，與反應試劑（R1）匯合，樣品塞中的POD催化H2O2/GA反應生成2-GA，流經流通式檢測器，給出吸光度信號（A）；試樣從注入到產物出現最大吸收峰之間的留存時間為Δt；與此同時，HCl清洗液被P2吸入清洗液定量環（RL），多余的清洗液從W1排出。當此閥再轉至“采樣”位置時，PBS緩沖液載流（C）推動RL中的HCl清洗液塞，依次進入反應盤管和流通池進行自動清洗，檢測器給出基線信號（Ao），兩者之差為ΔA（A-Ao）。將此ΔA/Δt代入公式（3）可求得Ec。

3 結果與討論

3.1 FIA系統參數的優化

基于前期手工法[27]將FIA-SP-POD系統的初始條件設定如下：1.5 mmol/L GA，0.5 mmol/L H2O2，兩者等體積混合作為R1； POD樣品的注入體積60 μL；0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 5.5）作為載流；0.4 mol/L HCl作為清洗液；P1轉速20 r/min （1.73 mL/min），P2轉速20 r/min；反應盤管（Φ 0.8 mm）長度為200 cm；背壓管（Φ 0.3 mm）長度為50 cm。采用單因素優選法考察了FIA法測定POD活性時的影響因素。

3.1.1 反應盤管最適長度的考察 在FIA-SP-POD系統中，反應盤管長度影響反應進程和分析速度。因此，用白蘿卜提取液作為測試樣品，考察了RC長度（150， 200， 250， 300和350 cm）對反應產物吸光度的影響。得到的結果表明，RC長度增加，產物吸光度先增大后逐漸減小，RC長度在200 cm 時ΔA最大。其原因是：RC長度較短時反應時間短，導致反應不充分；RC太長時，反應產物的生成速率小于其在管路中被稀釋的速率，導致吸光度值緩慢下降。所以本系統的RC選定為200 cm。

3.1.2 試樣環最適體積的考察 FIA-SP-POD系統中采樣環（SL）的體積即為POD溶液的體積，系統中加入的POD量不同導致酶催化速率不同，進而影響FIA系統的靈敏度，因此，在RC為200 cm的前體下，考察了SL（30， 40， 50， 60和70 μL）對反應產物吸光度的影響。結果表明，SL增加基本上不影響產物吸光度值；

其原因可能是H2O2與GA反應已達到平衡，再增加SL僅僅是酶過量而沒有增加反應產物的生成量。考慮到方法靈敏度及節省試樣的因素，選定SL為40 μL。

3.1.3 FIA系統基線漂移的消除 研究發現，在FIA-SP-POD系統中H2O2與GA反應所生成的褐色2-GA，容易吸附在流通池中，導致FIA系統的基線漂移。所以，為了減小由于2-GA導致的基線漂移，在FIA系統導入清洗液。即在FIA流路中設計了一個異步注入閥，利用此閥將清洗液在“酶試樣塞”之后注入FIA系統（60 μL），以達到對FIA系統自動清洗，減小基線漂移的效果。

為了考察此效果，在FIA系統中分別用HCl和NaOH作為清洗液，蘿卜提取液作為測試樣品，得到了圖2中的兩條實測曲線。隨著清洗液濃度（HCl和NaOH）增加，基線漂移值減小；在相同濃度下，HCl的清洗效果（基線漂移值）優于NaOH。所以，最后選取0.4 mol/L HCl溶液作為清洗劑。

3.2 反應體系影響因素的考察

3.2.1 POD最適溫度 溫度是影響POD活性的因素之一。低溫使酶活性不能完全顯現，高溫又會使酶蛋白變性，喪失活性。將FIA-SP-POD系統的RC置于恒溫控制器內，先用熱電偶對RC出口液的溫度進行校正，然后用白蘿卜提取液作為測試樣品，在不同溫度下（25℃～70℃）考察了溫度與白蘿卜POD活性的相關性。結果見圖3a。在60℃時， 酶催化反應產物的ΔA最大（此時FIA系統的平均留存時間Δt都相同，所以ΔA與反應速率ΔA/Δt及Ec成正比關系），當溫度大于60℃時， ΔA開始降低，即高溫導致POD失活，POD的催化活力下降。由此可知白蘿卜POD最適溫度為60℃，此結果與文獻＼[28＼]一致。

3.2.2 POD最適pH值 酸度對酶活性的影響，不是酸、堿對酶分子解離狀態的影響，而是對酶活性中心或相關基團解離狀態的影響。因此本實驗用白蘿卜提取液作為測試樣品，考察了磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L）的酸度（pH 3.0～9.0）對反應體系中POD活性的影響。除溫度控制在60℃外，其它條件同上。由圖3b所示的結果可知，當pH 在3～5.5范圍時，pH 增加，ΔA增大，即POD催化生成的產物增多；在pH 5.5～9.0范圍時，pH 增加，ΔA反而降低，即POD催化生成的產物減少；在pH 5.5時產物最多即POD活性最強。由此可知蘿卜中所含的POD的最適pH 為5.5。

3.2.3 H2O2濃度的考察 在上述優選條件下，考察反應體系中H2O2濃度（0～2.0 mmol/L）對POD催化反應的影響。得到的結果見圖3c。可以看出：在給定的Δt值下，H2O2濃度增加，產物ΔA逐漸增大，當此濃度大于1.5 mmol/L時，產物ΔA不再變化，即POD催化產物的生成速率趨于穩定。因此， 將H2O2濃度設定為1.5 mmol/L。在此基礎上，以H2O2為底物作Lineweaver-Burk雙倒數圖，根據雙倒數圖的截距，計算得到以H2O2為底物的米氏常數（Km）為0.21 mmol/L，酶促反應最大速度（Vmax）為1.155 mmol/（L·min）。

3.2.4 GA濃度的考察 在上述優選條件下，也考察了GA濃度（0～4.0 mmol/L）對POD酶催化反應的影響。得到的結果見圖3d。在給定的Δt值下，曲線的變化趨勢與H2O2底物相似，即隨著GA/POD/H2O2反應體系中GA濃度增大，ΔA先迅速增大后不再變化；當濃度大于3.5 mmol/L時，反應速率（ΔA/Δt）趨于穩定。故本系統選定GA濃度為3.5 mmol/L。同樣以GA為底物作Lineweaver-Burk雙倒數圖，再根據此圖計算出以GA為底物的Km′和Vmax′值分別為0.20 mmol/L和0.539 mmol L1·min1。結果表明：白蘿卜POD與GA之間的親和力與H2O2相差不大。

3.3 干擾離子對POD活性測定影響

金屬離子可能與POD形成絡合物進而影響POD活性，本實驗考察了4種鹽溶液（FeCl3， CuSO4， ZnSO4， CoSO4）對POD活性測定的影響。實驗時，白蘿卜POD作為測試樣品，在0～0.8 mmol/L范圍內改變FIA-SP-POD系統載流中的金屬離子濃度，得到的結果見圖4。從圖4a可知，隨著Fe3+， Cu2+， Zn2+， Co2+濃度的增加，在給定的Δt值下，相關的ΔA都有增大的趨勢，即Fe3+， Cu2+， Zn2+， Co2+對POD均有一定程度的激活作用；POD激活順序為Fe3+ > Cu2+ > Zn2+ > Co2+。所以，在提取白蘿卜POD時，要避免接觸這些金屬離子，防止發生酶促褐變。

此外，在載流中分別添加檸檬酸（0～20 mmol/L）、抗壞血酸（0～0.2 mmol/L）和L-半胱氨酸（0～2.0 mmol/L），考察了這些有機酸類對POD活性的影響。從得到的圖4b～d 3條曲線可以看出：添加的有機酸濃度增大，在給定的Δt值下吸光度都逐漸降低。這表明這3種有機酸對POD活性有明顯的抑制作用，其抑制作用順序為抗壞血酸>L-半胱氨酸>檸檬酸。由于L-半胱氨酸和檸檬酸都與POD活性中心的Fe3+發生螯合反應，使酶活性中心失去催化功能，因而抑制了POD的活性或減弱了POD與底物的親和力。

3.4 摩爾吸收系數測定

常規比色法測定POD活性時，是利用H2O2/POD/GA體系反應產物在470 nm處的ΔA值，帶入公式（2）計算得到。但本研究發現：ε值是準確定量POD酶活性的最關鍵因素；當所用儀器（波長分辨率、靈敏度）及方法的測試條件（溫度、pH 及溶劑）不同時得到的ε不同。所以，計算POD活性時不能直接將文獻或商家給出的ε值代入公式（2）進行計算，須在選定條件下用所選儀器進行測定。

因此，本實驗對準確測定ε2-GA方法進行了研究。由于2-GA不穩定、無法提純，不能通過直接測定其吸光度值得到ε2-GA值，只能利用GA濃度間接求出2-GA的濃度（2H2O+2GA（POD）2-GA+4H2O）。理論上，當H2O2/POD/GA體系中POD過量， 且H2O2濃度遠大于GA時，可認為GA完全轉化為2-GA。所以， 對所需的POD活性濃度、H2O2/GA濃度比進行了考察。

3.4.1 GA完全轉化為產物所需的HRP活性濃度 用商品化的HRP作為測試樣品，分別取20 μL的50， 100， 250， 500， 1000和2500 U/L HRP，加入0.5 mmol/L H2O2+1.5 mmol/L GA混合液中[26]測定2-GA的吸光度，結果見圖5a。當HRP濃度小于1.0 kU/L時，2-GA的吸光度隨HRP活性濃度增加而增大，當HRP濃度大于1.0 kU/L時，2-GA的吸光度不再變化，即此時HRP活性濃度能使GA完全轉化為產物。

3.4.2 GA完全轉化為產物所需的H2O2的濃度 選定HRP為1.0 kU/L、GA濃度為0.2 mmol/L，使其與不同濃度的H2O2（0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和2.0 mmol/L）按1+1混合，測定其產物2-GA的吸光度，結果見圖5b，產物吸光度隨H2O2濃度增加呈線性增加趨勢，當H2O2濃度大于GA濃度的5倍時，產物吸光度不再隨H2O2濃度而變化。由此得出結論：當HRP為1.0 kU/L、H2O2/GA濃度比大于5時，GA能完全轉化為產物2-GA。因此，此時可根據已知的GA濃度換算出反應系統中的2-GA濃度，再將其帶入朗伯-比爾定律，就求得ε2-GA。在室溫（～20℃）下，用手工比色和5點平均數據得到的ε2-GA值為0.0122±0.0031 L/（μmol·cm）。

3.4.3 產物摩爾吸收系數的平均值 為了得到FIA法測定白蘿卜POD的ε2-GA，用稀釋一倍后的白蘿卜粗酶液作為樣品（Ec>1.0 kU/L），FIA系統中載流為PBS緩沖液（pH 5.5），R1（H2O2/GA）按1+1混合、且濃度比大于5 （H2O2/GA： 1.5/0.01， 1.5/0.04， 1.5/0.08， 1.5/0.12， 1.5/0.16， 1.5/0.20和1.5/0.24 mmol/L），在60℃下測定了FIA-SP-POD系統中H2O2/POD/GA反應體系形成的產物吸光度，并將換算出的2-GA濃度（1.25， 5， 10， 15， 20， 25和30 μmol/L，c2-GA= 1000×（cGA/4）/2）與其吸光度值進行數學回歸，最后得到相關的線性方程：ΔA=0.0125c2-GA+0.050 （r=0.9995）；此斜率值0.0125 L （μmol cm）1即為本系統的ε2-GA平均值。

3.5 蘿卜POD活性測定

考察了POD的線性響應范圍和精密度以及檢出限。在優選條件下，一系列HRP標液作為樣品，用FIA-SP-POD系統檢出它們在Δt下的ΔA值，然后代入公式3，求出對應的POD活性值。結果表明：在給定的Δt（0.53 min）下，在450～7260 U/L范圍內HRP活性濃度與ΔA值呈現良好的線性相關（ΔA=0.00013Ec+ 0.0012，r=0.9985）。隨后，分別用500 U/L、2500 U/L HRP標液進行11次測定，得到兩組標液的RSD分別為0.62%（c=501±3 U/L）、0.31%（c=2530±8 U/L）；此結果表明本方法測定POD活性濃度的精度很好；用 500 U/L HRP為樣品，計算得到本方法的檢出限為7.0 U/L （cL=3SD/K， SD=0.000326， K=0.00013）。

用pH 5.5磷酸鹽緩沖液將蘿卜提取液按10%， 15%， 20%， 25%， 30%和35%比例稀釋成6個樣品（Ec10～Ec35），分別注入FIA-SP-POD系統，在給定的Δt下，檢測其催化產物的ΔA（0.067， 0.105， 0.135， 0.170， 0.193， 0.220），得到了一條蘿卜提取液與ΔA呈良好線性關系的相關曲線（ΔA=0.638c+0.004， r=0.9965）， 表明本方法基于平均留存時間（Δt）處的ΔA能快速準確地定量POD活性濃度。

另外，模擬手工酶動力學曲線法在本系統上采用流動注射停留法，對上述稀釋的蘿卜POD活性進行了測定。操作過程是：注入酶樣品32s后停泵（在響應峰的最大值之后停泵），連續記錄H2O2/POD/GA體系在后30s期間內的催化反應動力學曲線（ΔA vs Δt），根據此區間曲線的斜率，求得POD活性濃度。得到的數據表明，停留法的結果（Ec10：777±3 U/L，Ec15：1211±13 U/L，Ec20：1470±14 U/L，Ec25：1760±30 U/L， Ec30：2075±20 U/L，Ec35：2268±23 U/L）與上述FIA-SP-POD系統的結果（Ec10：706±8 U/L，Ec15：1105±6 U/L，Ec20：1425±22 U/L，Ec25：1802±6 U/L，Ec30：2034±27 U/L，Ec35：2323±32 U/L）是一致的。

選取4種蘿卜的提取液作為酶樣品，用FIA-SP-POD系統測定其產物的吸光度，然后代入公式3，得到POD活性值。得到結果為：紅皮蘿卜（14673 U/L）>青蘿卜（14365 U/L）>圓蘿卜（13076 U/L）>白蘿卜（8309 U/L）。為了考察本方法的可靠性，用HRP標準進行了加標回收率實驗（表1）。考慮到HRP自然失活的影響，每次加標實驗前先對HRP活性進行了校正。本方法的回收率在95.2%～107.1%之間，結果滿意。

4 結 論

本研究基于H2O2/POD/GA反應體系，利用流動注射吸光度/留存時間比值法，建立了一種無需標準曲線的POD活性快速準確測定新方法，分析速度可達40樣/h。用本方法測定POD活性，不但減少了手工操作帶來的誤差，而且具有準確度高、重現性好、分析速度快、自動化程度高的優點。

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