2型糖尿病視網(wǎng)膜病變與DNA氧化損傷的關(guān)系

葛維明 卞茸文 陳吉海 陳慧梅 杜宏

2型糖尿病視網(wǎng)膜病變與DNA氧化損傷的關(guān)系

葛維明 卞茸文 陳吉海 陳慧梅 杜宏

目的 了解2型糖尿病合并糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）患者中機(jī)體DNA氧化損傷水平。 方法 選擇87例2型糖尿病患者，采用眼底檢查方式明確是否患有視網(wǎng)膜病變，然后將其分為糖尿病DR組和無DR組，DR組31例，其中男11例，女20例，平均（67.68±6.61）歲，無DR組56例，其中男24例，女32例，平均（65.91±3.91）歲，同時(shí)選擇65例正常體檢者為對(duì)照組。測(cè)定血清單核細(xì)胞DNA氧化損傷指標(biāo)8羥基脫氧鳥嘌呤（8-OHdG）水平，比較3組之間血清8-OHdG水平。 結(jié)果 糖尿病組較對(duì)照組血8-OHdG水平升高，2組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［（3.23±1.86）ng/ml比（0.72±0.93）ng/ml，t=9.972，P＜0.001］，DR組較無DR組血8-OHdG水平升高，2組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=2.441，P=0.017）。Speaman相關(guān)性分析顯示，患者視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度與血清8-OHdG水平呈正相關(guān)。 結(jié)論 2型糖尿病患者機(jī)體DNA氧化損傷指標(biāo)8-OHdG水平增高，合并DR的患者，8-OHdG水平增高更明顯，而且與DR的病變程度呈正相關(guān)，DNA氧化損傷可能不僅參與糖尿病發(fā)病，還與糖尿病的微血管并發(fā)癥的發(fā)病有關(guān)。

2型糖尿病；糖尿病視網(wǎng)膜病變；8羥基脫氧鳥嘌呤；氧化損傷

目前研究認(rèn)為2型糖尿病與機(jī)體DNA氧化損傷密切相關(guān)，DNA的氧化損傷在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病中亦起著重要的作用，而 8-羥基脫氧鳥嘌呤（8-OHdG）是DNA氧化損傷敏感的生物指標(biāo)，與機(jī)體氧化應(yīng)激水平呈正相關(guān)［1］。目前糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）與DNA損傷水平的研究較少，為了明確DR與氧化應(yīng)激的關(guān)系，本研究對(duì)比了糖尿病合并DR組、糖尿病無DR組以及正常對(duì)照組血清8-OHdG的水平，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2013年1～6月江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院內(nèi)分泌科87例2型糖尿病患者為糖尿病組，其中男43例，女44例；年齡60～80歲，平均（68.58±8.07）歲；病程2～12年，平均糖尿病病程（108.12±84.36）月。同時(shí)將糖尿病組又分為DR組（31例）和無DR組（56例）。并納入65例健康體檢者為正常對(duì)照組，男35例，女30例，年齡60～80歲，平均（69.17±7.09）歲。入選對(duì)象均簽署知情同意書。DR診斷采用眼底檢查方式明確，分期參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)眼科學(xué)分會(huì)眼底病學(xué)組制訂的國內(nèi)DR分期標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行6級(jí)分期［2］。

1.2 患者入選標(biāo)準(zhǔn) （1）年齡＞60歲、不吸煙的2型糖尿病患者；（2）DR為眼底檢查方法明確提示有DR1期及1期以上改變；（3）高血壓患者入選前平臥位血壓＜180/110 mmHg。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）吸煙；（2）長期使用維生素C、維生素E等抗氧化劑；（3）長期使用降血脂類藥物；（4）長期使用其他影響機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的藥物；（5）長期使用非甾體類抗炎藥、激素或免疫抑制劑治療；（6）嚴(yán)重肝功能障礙（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶高于正常上限2倍）；（7）經(jīng)尿檢、腎臟穿刺活檢等排除其他尿蛋白升高疾病（急、慢性腎小球腎炎等）；（8）合并有冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、腦血管疾病等大血管并發(fā)癥患者。本研究得到江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA：對(duì)于符合條件的2型糖尿病患者抽取5～10 ml空腹靜脈血，使用鹽析法提取DNA。

1.3.2 DNA濃度的計(jì)算和純化：DNA在TE緩沖液［100 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0］中溶解至20～50μg/ml；分別于230 nm、260 nm、280 nm 3個(gè)波長檢測(cè)吸光度，并計(jì)算DNA的濃度（在波長為 260 nm條件下，1.0對(duì)應(yīng)于50μg/ml DNA），了解DNA的純度［參考：（260 nm的吸光度）/（280 nm的吸光度）=1.8/1.85；（260 nm的吸光度）/（230 nm的吸光度）=2.2/2.25］。

1.3.3 DNA的酶消化：溶解200μg DNA至135μl水中；加入15μl乙酸鈉（200 mmol/L，pH 4.8）、6 U的核酸酶P1（15μl，1mg/ml）至DNA溶解液中，氬氣環(huán)境下37℃下孵育30 min。然后加入1 mol/L Tris-HCl緩沖液（15μl，pH 7.4）及2 U堿性磷酸酶（7μl，200 U/0.7 ml，pH 7.4），繼續(xù)在氬氣環(huán)境下37℃下孵育30 min。水解產(chǎn)物過純化柱，以去除酶及其他大分子，14 000 r/min離心10 min。收集離心的液體，取50μl DNA消化產(chǎn)物用于ELISA試劑盒檢測(cè)。

1.3.4 ELISA試劑盒檢測(cè)：使用 ELISA試劑盒（IMKOGNW 050915E，Catalog No.KOG200S/E）檢測(cè)提取的DNA中8-OHdG的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組之間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，非參數(shù)檢驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Speaman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組基線資料 3組間年齡、性別、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)糖尿病合并DR組與無DR組間糖化血紅蛋白（HbA1c）、病程差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組間DNA濃度和純度差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組間具有可比性，見表1。

表1 3組基線資料比較

表1 3組基線資料比較

項(xiàng)目 糖尿病組DR組（n=31） 無DR組（n=56）正常對(duì)照組（n=65） F P HbA1c（%） 7.98±2.69 7.63±1.69 — 1.985 0.138 TC（mmol/L） 5.26±2.54 4.80±1.26 5.02±1.13 0.956 0.418 LDL-C（mmol/L） 3.60±2.35 2.97±0.88 3.12±1.34 1.467 0.192 DNA濃度（μg/ml） 28.76±2.65 27.66±3.65 28.43±2.79 0.289 0.885 DNA純度（A260 nm/A280 nm） 1.84±0.26 1.82±0.17 1.83±0.35 0.133 0.957

2.2 血清8-OHdG水平 正常對(duì)照組血8-OHdG水平為（0.72±0.93）ng/ml，糖尿病組血8-OHdG水平為（3.23±1.86）ng/ml，2組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t= 9.972，P＜0.01）。糖尿病DR組血清8-OHdG水平較無DR組顯著升高［（3.86±2.03）ng/ml比（2.87± 1.67）ng/ml］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.441，P= 0.017）。

2.3 DR嚴(yán)重程度與血清8-OHdG水平的相關(guān)關(guān)系按照DR 6級(jí)分期（1～6期）將DR組患者進(jìn)行分期，并將患者視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度與血清8-OHdG水平進(jìn)行相關(guān)性分析。Speaman相關(guān)性分析顯示，DR分期與血清8-OHdG水平呈顯著正相關(guān)（r=0.436，P＜0.01）。DR分型及分期：Ⅰ期：視網(wǎng)膜有微動(dòng)脈瘤或并有小出血點(diǎn)；Ⅱ期：視網(wǎng)膜有黃白“硬性滲出”或并有出血斑，見圖1；Ⅲ期：視網(wǎng)膜有白色“軟性滲出”或并有出血斑。此3期統(tǒng)稱為單純型DR。眼底表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微血管瘤，視網(wǎng)膜出血斑，見圖2。Ⅳ期：視網(wǎng)膜有新生血管和（或）玻璃體出血；Ⅴ期：視網(wǎng)膜有新生血管和纖維增殖，Ⅵ期：視網(wǎng)膜有新生血管和纖維增殖并發(fā)現(xiàn)網(wǎng)膜脫離，后3期統(tǒng)稱為增殖型DR，指病變至少有部分向內(nèi)延伸超過內(nèi)界膜，表現(xiàn)為新生血管、纖維性增殖和牽引性視網(wǎng)膜脫離。

圖1 DRⅡ期伴出血點(diǎn)、微血管瘤和硬性滲出線

圖2 DRⅢ期伴視網(wǎng)膜出血斑

2.4 受試者工作特征曲線（ROC）分析 將血清8-OhdG水平和DR進(jìn)行ROC分析，希望能得到對(duì)DR有診斷價(jià)值的血清8-OhdG水平的切點(diǎn)。ROC分析提示曲線下面積為0.738，提示具有較好的準(zhǔn)確性。約登指數(shù)［敏感度-（1-特異度）］最大值為0.542，對(duì)應(yīng)8-OhdG水平為1.17 ng/m l，其敏感度為100%，特異度為45.8%。

3 討論

3.1 氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病微血管并發(fā)癥的重要發(fā)病機(jī)制之一［3-4］。在糖尿病患者中，DNA的斷裂、嘧啶環(huán)的氧化及嘌呤位點(diǎn)的改變均較正常對(duì)照組明顯升高，而這些改變和氧化應(yīng)激有著重要聯(lián)系［5］。在高糖環(huán)境中，一方面，體內(nèi)抗氧化酶表達(dá)受到抑制［6］；另一方面，由線粒體電子傳遞鏈生成的電力學(xué)梯度及感光細(xì)胞等產(chǎn)生的活性氧（ROS）和超氧自由基增多［7-8］；過多的ROS可以直接介導(dǎo)DNA的損傷［9］，同時(shí)還可激活與糖尿病微血管病變有關(guān)的己糖胺途徑、多元醇通路等，并可使氧化性更強(qiáng)的過氧化硝酸鹽合成增加，從而使硝化酪氨酸水平增高，造成DNA的損傷和組織細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)了糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［10］。

3.2 8-OHdG是DNA中鳥嘌呤氧化損傷的特異產(chǎn)物。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，DNA鏈上的堿基鳥嘌呤C-8位受羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊發(fā)生羥化，而羥化的鳥苷酸可被機(jī)體特異性DNA修復(fù)酶剪切，形成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物8-OHdG，該物質(zhì)因此也被認(rèn)為是內(nèi)源性氧自由基引起DNA損傷的標(biāo)志［11］。

3.3 本研究探討了糖尿病組與正常對(duì)照組間、糖尿病DR組與糖尿病無DR組間血液單核細(xì)胞DNA提取液中8-OHdG水平的差異。結(jié)果顯示，糖尿病組與正常對(duì)照組相比，血8-OHdG顯著升高，證實(shí)糖尿病患者機(jī)體DNA氧化損傷較正常對(duì)照組明顯增多。此外，糖尿病合并DR組與糖尿病無DR組相比，血8-OHdG水平亦明顯升高，提示在糖尿病患者中，其氧化應(yīng)激水平也不盡相同。在合并慢性并發(fā)癥階段，其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平較非糖尿病并發(fā)癥階段顯著升高。此外Speaman相關(guān)性分析顯示，DR分期與血清8-OHdG水平呈顯著正相關(guān)。上述結(jié)果提示，氧化應(yīng)激不僅參與了糖尿病及DR的發(fā)病，同時(shí)也可能在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。

3.4 對(duì)于DR而言，8-OhdG水平有一定的提示和參考價(jià)值，但尚不能作為一個(gè)較好的診斷指標(biāo)，本研究對(duì)DR與血清8-OhdG水平進(jìn)行ROC曲線分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然曲線下面積＞0.7，具有較好的診斷價(jià)值，但通過計(jì)算約登指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，隨訪切點(diǎn)的敏感性較高，但特異度較低，此結(jié)果也需待我們以后擴(kuò)大試驗(yàn)樣本后進(jìn)一步論證。而且在進(jìn)行血糖及血脂等方面比較時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，雖然各組間血糖及血脂無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但DR組血糖及血脂均較無DR組略有升高，提示這種氧化應(yīng)激水平的增加可能與血糖及血脂的升高有一定關(guān)系，但由于研究樣本的限制，2組間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，希望在以后的工作中，繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，增加上述假設(shè)的證據(jù)。

3.5 本研究證實(shí)DNA氧化損傷在糖尿病DR組病人中較正常對(duì)照組及糖尿病無DR組明顯升高，為抗氧化治療在臨床的應(yīng)用提供了依據(jù)。與以往以尿液作樣本相比，本試驗(yàn)所采用的靜脈抽血提取樣本的方式更為方便；并且，本試驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)方法，較目前的高效液相色譜法電化學(xué)檢測(cè)法特異度、靈敏度更高。這些既利于現(xiàn)場(chǎng)及大型人群分析，同時(shí)也能排除尿液中多種代謝產(chǎn)物及雜質(zhì)對(duì)結(jié)果的干擾。

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Relationship between diabetic retinopathy and oxidative damage to DNA

GEWei-ming.Department ofCarde Health Care；BIAN Rong-wen，CHEN Ji-hai.Department ofEndocrinology，Jiangsu Province Geriatric Hospital，Nanjing 210024，China；CHEN Hui-mei.Medical College of Nanjing University，Nanjing 210093，China；DU Hong.Department of Endocrinology，Nanjing General Hospital ofNanjing Military Command，PLA，Nanjing 210002，China

Objective To investigate the level of DNA oxidative damage in the patients with diabetic retinopathy （DR）. M ethods Eighty-seven patientswith type 2 diabetesmellitus（T2DM）were enrolled in this study.According to the results of fundus photo detection，the patients were divided into DR group（31 cases，11 males and 20 females，mean age 61.68±11.61 years）and non-DR group（56 cases，24males and 32 females，mean age 60.91±13.91 years）.Sixty-five normal healthy were enrolled as control group.The level of serum 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine（8-OHdG）was detected and compared between three groups. Results The level of8-OHdG of the patientswith T2DM was higher than thatof the normal healthy（3.23±1.86 ng/ml vs.0.72±0.93 ng/ml，t=9.972，P＜0.001）.The level of 8-OHdG of DR group was higher than thatof non-DR group（t=2.441，P=0.017）.Spearman analysis showed that the level of8-OHdGwas correlated with the severe degree of DR. Conclusions Oxidative damage of DNA is significantly higher in the patientswith T2DM，especially in the patients with DR.It suggests that oxidative damage of DNA might participate in the development of T2DM and themicrovascular disease，which provides reference for the anti-oxidative therapy for T2DM with DR.

type 2 diabetesmellitus；diabetic retinopathy；8-hydroxy-2′-deoxyguanosine；oxidative damage

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.09.007

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（71373132）；江蘇省科技廳自然研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目（BK2010089）；江蘇省科技廳自然科學(xué)基金（BK2012882）；江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院院級(jí)課題（L200902）

210024 江蘇省南京市，江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院干部保健科（葛維明）；內(nèi)分泌科（卞茸文，陳吉海）；210093 江蘇省南京市，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院（陳慧梅）；210002 江蘇省南京市，中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科（杜宏）

杜宏，Email：duhong5@tom.com

2014-12-14）