調心安神針法調節室性心律失常模型兔心肌細胞Cx43表達的免疫組化研究

王銳，郭麗，李永春，崔華峰，管琳

（1.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250011；2.山東中醫藥大學，濟南 250011）

·動物實驗·

調心安神針法調節室性心律失常模型兔心肌細胞Cx43表達的免疫組化研究

王銳1，郭麗1，李永春2，崔華峰1，管琳1

（1.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250011；2.山東中醫藥大學，濟南 250011）

目的 研究調心安神針法對于室性心律失常模型兔心肌細胞縫隙連接蛋白 43（connexin43，Cx43）的影響。方法采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型。40只新西蘭兔隨機分為對照組、模型組、針刺組、藥物組，針刺組施以調心安神針刺法（取靈臺、神道及雙側內關、百會），藥物組給予鹽酸普羅帕酮片（心律平）灌胃。實驗完畢后取兔左心室，通過免疫組織化學染色技術及計算機圖像處理系統對Cx43的表達進行對比分析。結果 模型組Cx43的表達較對照組顯著降低（P＜0.01），針刺組及藥物組Cx43的表達均較模型組增加（P＜0.05），二者之間無明顯差異（P＞0.05）。結論 調節心肌細胞Cx43的表達可能是該針法治療心律失常的靶點之一。

針刺；調心安神針法；心律失常，室性；縫隙連接蛋白43；免疫組織化學法

室性心律失常是臨床常見的心臟疾病，嚴重影響患者的生活質量，甚者危及生命。有研究發現，室性心律失常是年齡超過 35歲成人的幾個心源性猝死的危險因素之一［1-3］。近年來的研究表明，縫隙連接蛋白43（Cx43）在室性心律失常發生中具有重要作用［4-6］。筆者基于多年臨床經驗，由靈臺、神道、內關、百會穴組成調心安神方，并施行特定的手法操作，治療早搏取得了滿意的療效［7］。我們采用兔耳緣靜脈注射氯化鋇的方法制作室性心律失常模型，觀察調心安神針法對其心肌細胞Cx43的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

新西蘭兔40只，體重1.5～2.0 kg，雌雄各半，由山東省農科院提供，合格證號為 SCXK（魯）20090013。一抗為兔抗 Cx43，購自北京博奧森生物技術有限公司，批號為990387W。二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號為 101964。DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，批號為12171A08。

1.2 分組與建模

40只新西蘭兔按照隨機數字表法分為4組，即對照組、模型組、針刺組、藥物組，每組10只。用10%水合氯醛按 5 mL/kg腹腔注射麻醉（藥物組給藥 1 h后），仰位固定于固定臺上。將針形電極插入四肢遠端皮下，選擇標準Ⅱ導聯，待心電圖穩定后沿耳緣靜脈注射20%氯化鋇10 mL/kg造成室性心律失常模型。藥物組予鹽酸普羅帕酮40 mg/kg灌胃，其余各組不予處理。

1.3 針刺方法

參照中國針灸學會《動物針灸穴位圖譜》，針刺組于造模后即刻給予針刺內關、百會、靈臺、神道。靈臺、神道穴位于背部胸椎6-7及5-6棘突間，向上斜刺5 mm，用震顫法快速小幅度行針1 min后起針；百會穴位于第7腰椎與第1薦椎棘突間，向后平刺5 mm；內關穴位于前臂下1/6折點處內側，橈、尺骨間隙中，雙側內關分別直刺5 mm，行針1 min后接電針治療儀，選疏密波，刺激強度以家兔上肢出現輕微顫動為度。各組均觀察體表心電變化，留針至恢復正常心律后停止記錄，拔出針形電極，立即處死動物，取左心室。

1.4 觀察指標

1.4.1 心電圖時相性觀察

采用十二導電生理記錄儀記錄心電變化，以心律失常消失300 s以上為恢復正常心律。

1.4.2 心肌細胞Cx43免疫組化檢測

將心臟組織置于40 g/L中性甲醛液中固定，經石蠟包埋后，連續切片3張，切片厚4 μm，其中1張用于HE染色以觀察組織的大致形態，另2張用于免疫組織化學染色。采用SP法，操作步驟按試劑盒說明書進行。在OLYMPUS光學顯微鏡下10×40倍放大拍照，每張切片隨機觀察5個視野，Leica Qwin3軟件分析系統分析陽性表達面積。

1.5 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件，數據以均數±標準差表示，組間均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 室性心律失常持續時間比較

結果表明，模型組、針刺組及藥物組造模后均出現室性心律失常，以室性早搏為主，其次為室速。模型組心律失常持續時間為（36.4±21.5）min，針刺組心律失常持續時間為（17.1±9.8）min，藥物組心律失常持續時間為（12.6±6.2）min，3組持續時間比較，模型組最長，針刺組次之，藥物組最短。針刺組、藥物組與模型組比較均有顯著差異（P＜0.05），針刺組與藥物組之間無差異（P＞0.05）。

2.2 各組心肌組織HE染色

對照組心肌組織結構正常，無異常形態學改變。模型組心肌組織中可見部分心肌纖維腫脹，核明顯變大，少數心肌細胞胞漿嗜伊紅染色增強，心肌細胞之間可見連接疏松，心肌間質血管外膜增厚、水腫，累及部分中膜，增厚的血管周圍心肌纖維腫脹，胞漿疏松，血管周圍組織疏松。針刺組與藥物組少數心肌細胞腫脹、細胞間輕度疏松溶解，心肌間質組織中血管管壁輕度增厚，偶見小灶狀心肌纖維變性；小血管輕度增厚，外膜輕度水腫。詳見圖1。

圖1 各組心肌組織HE染色（×400）

2.3 各組心肌組織免疫組化染色

2.3.1 染色比較

對照組心肌細胞中可見較多的棕黃色 CX43蛋白表達，模型組則較少表達或消失，針刺組與藥物組中可見部分棕黃色CX43表達。詳見圖2。

圖2 各組心肌組織免疫組化染色（×400）

2.3.2 Cx43陽性表達面積比較

模型組、針刺組、藥物組Cx43陽性表達面積檢測灰度值分別為（127.9±16.7）、（177.7±19.4）、（186.5±13.3），對照組為（206.7±11.3），結果表明，模型組、針刺組、藥物組Cx43陽性表達面積均較對照組明顯降低（P＜0.01），對照組與藥物組較模型組明顯增加（P＜0.01），針刺組與藥物組之間無差異（P＞0.05）。

3 討論

靜脈注射氯化鋇是造成室性心律失常模型的常用方法之一［8］。氯化鋇可增加浦氏纖維Na+內向電流，提高舒張期去極化的速率，從而誘發異位性節律。我們給予兔耳緣靜脈注射氯化鋇的劑量為10 mg/kg，發現誘發兔的心律失常主要為室性早搏和室性心動過速。

細胞縫隙連接通道是相鄰細胞電學和化學代謝耦聯的基礎，Cx43是其構成的主要電耦聯蛋白。心肌細胞Cx43的重構會致心肌細胞間電活動的同步性、協調性改變，電傳導速度及各向異性的改變等，從而誘發心律失常。動物實驗研究證實，Cx43表達下降的程度對誘導室性心律失常的發生具有重要的影響［2］，心肌缺血病灶及其鄰近區域Cx43的數量及分布的高度不均一性是折返性心律失常的結構基礎［9］。近年合成的抗心律失常多肽即通過上調Cx43的磷酸化水平而發揮抗心律失常作用［10］。鹽酸普羅帕酮片（心律平）作為臨床上最常用的抗心律失常藥物，能降低蒲肯野氏纖維、心室肌和心房肌的自律性，減慢其傳導速度，有輕度β-受體阻斷作用和輕微的鈣通道阻滯作用［11］。實驗結果表明，鹽酸普羅帕酮片平能降低模型兔室性心律失常持續時間，并能增加心肌細胞中Cx43的表達。對于后者，我們推測，這可能是鹽酸普羅帕酮片通過抑制細胞內Ca2+，從而影響Cx43的磷酸化過程，最終影響Cx43的表達。

內關穴對心臟有相對特異性。以往的研究發現，針刺內關穴可改善左心功能，增強心肌缺血時的收縮力［12］，增加心肌組織灌流量，改善末梢循環，糾正由于心肌缺血而誘發的心律失常［13］，減少了后除極電位和心律不齊的發生率［14］。靈臺、神道穴對于早搏也具有相對特異性的治療作用［15］，在調心安神針法中要求兩穴的操作須力求使針感向前胸或側胸部放散，即“氣至病所”。有學者認為，Cx43可能是構成穴位的主要物質基礎之一，針刺后穴位處Cx43表達增加激活了間隙連接通道，促進了Ca2+、cAMP、IP3或其他小分子物質快速傳遞至相應臟器，形成了“氣至病所”的物質基礎［16］，進而調節臟器功能。

本實驗表明，造模后給予調心安神針法，可以減少心肌細胞的損傷，明顯縮短室性心律失常持續時間，增加左心室心肌細胞中Cx43的表達。眾所周知，針刺治療心律失常是個多靶點、多層次、多途徑的過程。雖然調心安神針法增加心肌細胞中Cx43表達的過程和機制尚不清楚，但我們認為，這可能是該針法治療室性心律失常的機理之一。

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Immunohistochem ical Study of Heart-regulating and M ind-calm ing Acupuncture for Ad justing Cx43 Expression in M yocardial Cells in a Rabbit M odel of Ventricular Arrhythmia

WANG Rui1, GUO Li1, LI Yong-chun2, CUI Hua-feng1, GUAN Lin1.
1.S handong University of Traditional Chinese Medicine Hospital,Jinan 250011,China; 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,China

Objective To investigate the effect of heart-regulating and mind-calming acupuncture on the expression of gap junction protein connexin43 (Cx43) in myocardial cells in a rabbit model of ventricular arrhythmia. Method A rabbit model of ventricular arrhythmia was made by injecting barium chloride into the marginal ear vein. Forty New Zealand rabbits were randomized into control, model, acupuncture and medication groups. The acupuncture group received heart-regulating and m ind-calming acupuncture [at Lingtai (GV10), Shendao (GV 11), bilateral Neiguan (PC6) and Baihui (GV20)] and the medication group, oral gavage of propafenone. Rabbit left ventricle was taken after the completion of the experiment. Cx43 expressions were compared and analyzed using an immunohistochem ical staining technique and a computer image processing system. Result Cx43 expression decreased significantly in the model group compared w ith the control group (P＜0.01) and increased in the acupuncture and medication groups compared w ith the model group (P＜0.05). There was no significant difference in Cx43 expression between the acupuncture and medication groups (P＞0.05). Conclusion Adjusting Cx43 expression in myocardial cells may be one of the target points for this acupuncture treatment of arrhythm ia

Acupuncture; Heart-regulating and mind-calming acupuncture; Arrhythmia, ventricular; Gap junction protein connexin43; Immunohistochemical method

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.12.1241

1005-0957（2015）12-1241-03

2015-04-20

國家中醫藥管理局針灸重點學科重點項目；山東省中醫藥科技發展計劃項目（2013ZDZK-014）

王銳（1965 - ），男，主任醫師，Email：wr_6510@163.com