丙型肝炎病毒NS5A抑制劑的3D-QSAR研究

孟令鑫，劉蒙蒙，王遠強，林治華，2（重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶400054；2.重慶大學化學化工學院，重慶400044）

丙型肝炎病毒NS5A抑制劑的3D-QSAR研究

孟令鑫1，劉蒙蒙1，王遠強1，林治華1，2
（1重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶400054；2.重慶大學化學化工學院，重慶400044）

丙型病毒性肝炎感染是輸血后肝炎的主要病因之一。NS5A蛋白的小分子抑制劑顯示出很強的體外抑制病毒生長的活性，并且初步的臨床評價也證實了NS5A抑制劑能很好地抑制體內丙型肝炎病毒的生長。因此，研發高效的NS5A小分子抑制劑為治療丙型肝炎提供了新的策略。進行了daclatasvir丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑的三維定量構效關系（3D-QSAR）研究，通過SYBYL-X 2.1.1分子模擬軟件系統搜尋方法搜尋出化合物的最低能量構象，然后在Triops力場中用共軛梯度最小化進行優化。應用比較分子力場分析（CoMFA）和比較分子相似性指數分析（CoMSIA）進行分子活性構象的選擇、分子疊合、建立空間場范圍以及數據統計。用22個衍生物作為訓練集建立模型，用6個衍生物作為測試集來驗證模型的優劣。結果表明：CoMFA模的交叉相互驗證系數q2=0.578，回歸系數r2=0.939，CoMSIA模型的q2=0.584，r2=0.968。這些結論為丙型肝炎病毒NS5A復合體抑制劑的藥物設計和篩選提供了理論依據。

丙型肝炎病毒NS5A抑制劑；三維定量構效關系；比較分子場方法；比較分子相似性指數分析法

HCV是主要的人類病原體，全球感染人數約1.7億，是人免疫缺陷病毒I型感染人數的5倍［1］。這些HCV感染個體中的相當一部分會發展成嚴重的進行性肝病，包括肝硬化和肝細胞癌［3］。對HCV生命周期［2］的探討使我們得以研究針對不同病毒復制階段直接作用的抗病毒藥物。很多新型抗病毒藥物，如NS3/4A蛋白酶抑制劑、核苷（酸）類似物和非核苷類抑制劑，以及NS5A抑制劑均已進入臨床試驗階段［4］。丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑是可用于治療HCV感染患者的化合物，可選擇性地抑制HCV病毒的復制［5］。目前治療HCV的標準方法為使用聚乙二醇化-干擾素和利巴韋林的聯合療法，目前該方法在達到持續病毒響應上沒有理想的成功率，且會引起多種副作用［6］。因此，對開發解決當下這種醫學需要的有效療法是十分必要的。

比較分子場分析方法（CoMFA）原理：如果作用在一個受體上的是一組相似的化合物，并且作用方式相同，那么這組化合物的生物活性就由每個化合物周圍分子場的差別來決定，這種分子場可以顯示出受體與藥物分子之間非鍵的相互作用特點。本文根據合理的重疊規則，將已經確立好的研究體系中各個化合物的藥效構象重疊在一個空間網格上，這個空間網格將包容全部的化合物分子；使用一個探針原子，利用其在網格中移動的一定步長，計算在化合物構象式與每個點之間的靜電勢、疏水性和立體阻障作用；利用偏最小二乘法（partial least square，PLS）來確定區分被研究化合物活性的最少網格點（以障疏水性、靜電勢、立體阻相互之間的作用來表示），即得出3D-QASR；作出CoMFA系數圖，根據系數圖上的圖像特征分析出哪些地方其場強弱對被研究化合物的生物活性影響最大，并以此為據，設計出具有更強生物活性的新化合物。而比較分子相似因子分析方法（COMSIA）與CoMFA方法最大的區別是分子場的能量函數采用的是與距離有關的高斯函數。在CoMSIA方法中，以化合物的立體場、疏水場、靜電場和氫鍵場表示其分子特征，其中氫鍵場可分為氫鍵的給予體和氫鍵的受體兩種。這種與距離有關的高斯函數彌補了CoMFA方法中只由靜電場和立體場的函數表達的缺陷。

本實驗中，通過運用sybyl 2.1軟件將分子優化，獲取了分子最優的疊合構象，并且通過比較分子場分析（CoMFA）建模，通過比較分子相似性指數分析（CoMSIA）考察模型的合理性。這些模型通過22個具有生物活性的化合物作為訓練集來預測作為測試集的6個衍生物，從而驗證模型的有效性，預測值和實驗值能較好吻合會使模型具有強大的說服力。

1　研究方法

1.1數據來源

該化合物（見表1）的基本骨架結構見圖1。根據隨機數字表，從28個化合物中抽取6個作為預測集（含“*”號），余下22個作為訓練集。以訓練集建立3D-QSAR模型，并對預測集中化合物活性進行預測［7］，進而檢驗所建模型的可靠性與預測能力。在CoMFA分析中這28個化合物以半最大效應制濃度（EC50）表示，實驗值見表1。

表1　目標化合物（1-28）的結構與活性

1.2生物活性分子構象的優化

本文研究的丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑的結構通式如圖1所示。建立分子定量構效關系（QSAR）的重要步驟之一就是化合物活性構象的確定［8］。本文選用Tripos力場MMFF94電荷將28個目標化合物進行優化，將最大重復次數增加到1 000，Gradient［21-23］減到0.005，從而得到各分子的優化構象，進而在3D定量構效關系中建立模型以進行研究分析。

圖1　化合物的結構通式

1.3分子疊合

構象分子的疊合在3D-QSAR中是一個至關重要的步驟［9］。本文采用了將原子疊合的方式，即以生物活性最高的14號化合物作為模板分子，將各個分子的結構進行觀察，得到了32個疊合位點，然后將分子中有相同原子特征的骨架結構進行疊合。28個化合物分子的疊合如圖2所示。

圖2　目標化合物的疊合圖

1.4CoMFA模型的建立

采用SYBYL軟件的QSAR模塊進行分析。將上述疊加好的活性構象分子置于SYBYL/CoMFA自動生成的作用區域中。首先用PLS方法進行leave-one-out（LOO）交互驗證，從而計算出所建立模型的最佳主成份數（n）和交叉驗證的回歸系數［10］。一般認為，交叉驗證系數q2值大于0.5時，所建立的模型就有較可靠的預測能力［11］。然后再利用非交叉驗證法對其進行回歸計算，從而得到較好的CoMFA模型［12］。

1.5CoMSIA模型的建立

對于CoMSIA模型的建立，選取靜電場（E）、立體場（S）、疏水場（H）、氫鍵受體場（A）和氫鍵供體場（D）來考慮受體與化合物之間的影響［13］。首先將全部5種場考慮用于建立CoMSIA模型，若所得到的計算結果中q2并不理想，即沒有很好的預測能力，則選擇通過對各種場組合的計算來獲得具有較好交叉驗證系數的分子場［14］。對于最佳的CoMSIA結果，交叉驗證采用leave-one-out（LO0）得到最佳組分數和交叉驗證的回歸系數。然后進行非交叉驗證，建立CoMSIA模型［15］。

2　結果與討論

2.1統計結果

在CoMSIA模型的建立中，由于當把全部5種場考慮進去后所得到的q2大于0.5時才具有很好的預測能力，因此選擇通過分別對各種場的組合進行計算來獲得具有較好交叉驗證系數的分子場。表2為其中一組活性的組合對CoMSIA和CoMFA結果的影響。最佳分子場組合為立體場（S）、靜電場（E）、疏水場（H）、氫鍵受體場（A）和氫鍵供體場（D）［16］。

表3顯示了CoMFA和CoMSIA的3D-QSAR模型的統計結果。在CoMSIA當中，只考慮了立體場（S）、靜電場（E）、氫鍵受體場（A）和氫鍵供體場（D）的貢獻，所得交叉驗證系數較為滿意［17］（q2=0.584，R2=0.968，F=46.813，最佳組分數為2）。

從統計結果來看，CoMFA和CoMSIA方法都能對該系列化合物的結構活性關系給出較好相關模型［18］。CoMFA所得q2值比CoMSIA略低，CoMSIA的最佳組分數比相應CoMFA結果大，CoMFA模型考慮了靜電場和立體場的貢獻，而CoMSIA則考慮了立體場（S）、靜電場（E）、氫鍵受體場（A）和氫鍵供體場的貢獻［19］。從表4來看，除了個別化合物，兩種模型對于訓練集和測試集中化合物的活性預測還是比較準的。

表2　各種分子場的組合對CoMSIA和CoMFA結果的影響

表3　CoMFA和CoMSIA的3D-QSAR模型的統計結果

表4　目標化合物的活性

2.2QSAR模型的驗證

結合CoMFA和CoMSIA進行3D-QSAR研究有助于得到更為可靠的預測模型［20］。在本研究中，最佳CoMFA模型和CoMSIA模型的R2值分別為0.939和0.968，CoMSIA的R2值要略高于CoMFA。用此CoMFA和CoMSIA模型來驗證其穩定性和可預測性。先預測了22個訓練集化合物，然后把沒有進行預測的6個測試集化合物放入已經建好的模型中進行預測，從而對建立好的模型進行驗證。表4中列出了28個化合物在CoMFA和CoMSIA模型中活性的預測值與實驗值。在建立好的模型中，所有化合物的預測值與實驗值的活性相關性表現在圖3中。從實驗值和預測值的相關圖中可以看出，建立好的CoMFA和CoMSIA模型都對化合物有很好的預測性，其中CoMSIA模型有著更好的預測性。CoMFA模型的相關圖顯示，所有的訓練集數據點并沒有都集中在趨勢線上，還是有些分散在趨勢線兩側；CoMSIA模型的相關圖顯示，基本上所有的訓練集數據點都集中于趨勢線。由此可以看出，通過22個訓練集化合物所建立的3D-QSAR模型有較強的相關性［23］。利用已經建立好的3D-QSAR模型對沒有進行預測的6個測試集化合物進行活性預測，預測值和實測值也都能靠近趨勢線且分布在其兩側，說明這個3D-QSAR模型的預測性是比較好的，可以用于預測與實驗中的模板化合物骨架結構相似的分子的生物活性［24］。

2.3三維等值線圖

通過CoMFA的一系列計算，可以很明顯地看到分子在包括靜電場、立體場在內的各種場性質條件下生物活性的影響。疊合分子不同性質的等值空間區域由不同顏色的等勢面區域表示。其中靜電效應以藍色和紅色的區域來代表，立體效應以黃色和綠色的區域來代表［25］。

圖4（見本期封三）為以化合物3為參照分子的CoMFA模型的三維立體場等值線圖，圖4（a）為CoMFA模型的立體等值線圖，圖4（b）為CoMFA模型的靜電場等值線圖。圖4（a）中綠色區域表示在該區域中增大取代基的體積，有利于增加化合物的生物活性，在黃色區域內增大立體位阻將使化合物生物活性遞降。圖4（b）中藍色區域表示增加帶正電荷基團有利于提高化合物的生物活性，而在紅色區域增加帶負電荷基團可使化合物的生物活性上升［26］。

圖3 3D-QSAR模型中訓練集和測試集EC50的實驗值數據和預測值數據之間的相關性

圖5（見本期封三）顯示了以化合物3為參照分子的CoMSIA模型的三維等值線圖。圖5（a）為CoMSIA模型的立體場分布圖；圖5（b）為CoMSIA模型的靜電場分布圖；圖5（c）為CoMSIA模型的氫鍵受體場分布圖；圖5（d）為CoMSIA模型的氫鍵供體場分布圖；圖5（e）為CoMSIA模型的疏水場分布圖。從CoMSIA模型的立體場分布圖可以看出：它與CoMFA的立體場分布圖大致相同，說明此模型的立體場等值線分布圖還是比較可靠的，其對化合物改造的指導作用也是大致相同。例如，從圖5（b）反映的靜電場分布圖上可以看出：在藍色的區域加強化合物的正電性，在紅色區域引入電負性較大的基團有助于提高化合物的生物活性。圖5（c）提供了關于氫鍵供體場的有關信息，在藍綠色空間給化合物引人氫鍵供體的基團或原子有利于提高化合物與受體的親和力從而增加其生物活性，而在黃色區域氫鍵受體場的增加對提高化合物的活性不利。從圖5（d）顯示的氫鍵受體場分布圖可以看出，在紫色給化合物引入氫鍵受體的基團或原子有利于增加化合物與受體的親和力而提高活性，紅色區域增加氫鍵受體場不利于提高化合物的活性。

3　結論和展望

本文對丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑進行了系統的3D-QSAR研究。通過分子力學的結構優化，選取分子的最低能量構象并進行了分子疊合。基于LOO法建立了在三維水平上的定量關系模型，其CoMFA的交互驗證系數q2=0.578，傳統的相關系數R2=0.939，CoMSIA的交互驗證系數q2=0.584，傳統的相關系數R2=0.968。利用此模型對6個化合物進行預測，預測值與實驗值非常吻合，表明所建模型具有良好的穩定性及預測能力。根據CoMFA和CoMSIA的三維等值線圖，解釋了化合物中各位置上取代基對化合物活性的影響，為進一步設計、合成高活性的標題化合物提供一定的理論依據。

查閱相關文獻與數據庫Reaxys后，以活性最高的模板骨架分子14號為例，筆者設計了其合成路線，見圖6和7。

實驗過程中也有一些問題需要進一步研究和探討：QSAR研究需要以大量高質量的活性數據為基礎，而由于實驗條件和方法的差異，不同來源的數據可比性差，往往不能綜合起來建模。活性數據樣本量直接影響著模型的好壞，一般認為模型訓練集的樣本量應高于建模參數個數的5倍以上，即至少需要5個以上樣本的活性數據才能建立相對穩健的單參數模型。此次試驗可能會出現不穩定因素。由于化合物的活性通常受到多個因素的制約，因而建模時又應考察盡量多的相關結構參數以獲得高擬合精度和強預測能力的模型。雖然數據庫有許多用于QSAR研究的結構參數，但遠不能滿足QSAR研究的需要。QSAR方法的研究不會只是停留在采用一些經驗參數定量描述有機化合物的活性，而是會向著更加注重模型的理論性、智能化和程序化方向發展。如何提取出表達物質結構特征的結構描述符才是QSAR研究的關鍵。

本文對丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑進行了定量構效關系的研究，雖然得到了較好的結果，但還有待進一步深入研究和不斷完善。總的來說，丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑藥物的研究已經取得了重大的成果，其構效關系研究還有較廣闊的空間和發展前景，有效的丙型肝炎病毒NS5A復制抑制劑進入臨床并走進市場指日可待。

圖6　14號模板分子

圖7　合成路線

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（責任編輯何杰玲）

3D-QSAR Studies of Hepatitis C Virus NS5A Inhibitors

MENG Ling-xin1，LIU Meng-meng1，WANG Yuan-qiang1，LIN Zhi-hua1，2
（1.College of Pharmacy and Biological Engineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China；2.Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

Viral hepatitis C infection is one of themain causes of the hepatitis after blood transfusion. NS5A protein of smallmolecule inhibitors shows strong activity in inhibiting the growth of the vitro virus，and the preliminary clinical evaluation also confirmed that NS5A inhibitors can inhibit the growth of hepatitis c virus in the body.Therefore，the research and developmentof efficientNS5A smallmolecule inhibitors provides a new strategy for the treatment of hepatitis C.In this study，we investigatedthe daclatasvir hepatitis C virus NS5A inhibitor complex 3D-QSAR，and searched out the lowest energy conformations of compounds through SYBLE-X 2.1.1 molecularmodeling software system search method，and then Triops force field conjugate gradientminimization optimization.Comparative Molecular Field Analysis（CoMFA）and Comparative Molecular Similarity Indices Analysis（CoMSIA）were used to havemolecular active conformation selection，molecular alignment，as well as the establishmentof spatial statistics field range.In this experiment，taking 22 derivatives as the training set to build themodel，themerits of the model was validated with 6 derivatives as a test set.Results show that Cross CoMFA model's mutual authentication factor q2=0.578，and the regression coefficient r2=0.939，while CoMSIA model q2=0.584，and the r2=0.968.These conclusions laid a reliable theoretical basis for drug design and screening of hepatitis C virus NS5A complex inhibitors.

hepatitis C virus NS5A；3D-QSAR；CoMFA；CoMSIA

R914.2

A

1674-8425（2015）05-0052-09

10.3969/j.issn.1674-8425（z）.2015.05.010

2015-03-06

國家自然科學基金資助項目（81171508）；重慶市自然科學基金重點項目（CSTC2013JJB10004）；重慶理工大學研究生創新基金資助項目（YCX2013222）

孟令鑫（1987—），女，青海西寧人，碩士研究生，主要從事藥物設計與合成研究。

孟令鑫，劉蒙蒙，王遠強，等.丙型肝炎病毒NS5A抑制劑的3D-QSAR研究［J］.重慶理工大學學報：自然科學版，2015（5）：52-60.

format：MENG Ling-xin，LIUMeng-meng，WANG Yuan-qiang，etal.3D-QSAR Studies of Hepatitis CVirus NS5A Inhibitors［J］.Journal of Chongqing University of Technology：Natural Science，2015（5）：52-60.