大孔吸附樹脂分離純化苦蕎總皂苷的研究

智秀娟，馬挺軍，丁　　軻，李　　棟

（1.中國農業大學工學院，北京100083；2.北京農學院食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京102206）

大孔吸附樹脂分離純化苦蕎總皂苷的研究

智秀娟1，2，馬挺軍2，丁軻2，李棟1，*

（1.中國農業大學工學院，北京100083；2.北京農學院食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，食品質量與安全北京實驗室，北京102206）

為優化大孔吸附樹脂分離純化苦蕎總皂苷的工藝條件，通過靜態吸附解吸實驗篩選出適合分離純化苦蕎總皂苷的大孔吸附樹脂SP700，其飽和吸附量為（25.241±0.590）mg皂苷/g樹脂。研究了樣液濃度、吸附時間對吸附容量的影響，乙醇體積分數對解吸得率的影響，并進行了動態實驗，確定了SP700型大孔樹脂分離純化苦蕎總皂苷的最佳工藝條件為：最佳上樣濃度約0.586mg/mL，流速2BV/h，樹脂比樣液體積為1∶1，動態洗脫實驗中，上樣后用體積分數分別為50%和70%的乙醇溶液進行分段洗脫，洗脫流速為2BV/h，用量為2～3BV，洗脫得率最高可達到88.9%，洗脫液蒸干后所得固形物中皂苷含量較提取液固形物中皂苷含量提高了約2倍。

苦蕎，皂苷，分離純化，大孔吸附樹脂

蕎麥多生長于高寒、高海拔山區，是蓼科蕎麥屬的雙子葉假禾本科作物，在中國、印度、俄羅斯、波蘭、巴西、韓國、日本及美國等眾多國家均有種植，耐寒、耐旱、耐貧瘠，生長周期短，是一種綠色生態作物，營養價值豐富［1］。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，主要分布于陸地高等植物中，也少量存在于海星和海參等海洋生物中，是天然產物化學庫的重要組成之一，具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，如抗腫瘤［2］、抗病毒［3］、防治心血管疾病［4］、降血糖［5-6］、免疫調節等，其功能價值已引起藥物學、功能食品學和化學工業工作者的廣泛關注。

天然產物分離純化的方法很多，如柱層析、大孔吸附樹脂法、高速逆流色譜法等，其中大孔吸附樹脂分離純化技術是一種快速、經濟、有效的純化方法，具有物理化學穩定性高，選擇性好，再生處理方便，使用周期長，成本低廉等優點［7］，近年來廣泛應用于天然產物的分離純化研究和生產，如張若潔等［8］用大孔吸附樹脂純化蘆筍總皂苷，張小飛等［9］對大孔樹脂分離純化穿山龍薯蕷總皂苷的工藝進行了優化研究，丁軻等［10］研究了酸棗仁中三萜總皂苷的大孔樹脂分離純化工藝，均取得了較理想的純化效果。目前，國內外有關苦蕎中提取分離活性物質研究報道已有很多，但是對其中皂苷類成分進行分離純化的研究卻鮮有報道，僅黃海燕對苦蕎乙醇提取物進行了分離純化并分析了其中所含有效成分的功能活性［11］。

為提高苦蕎總皂苷的得率，節約資源，本文通過考察6種不同極性的大孔吸附樹脂對苦蕎總皂苷的靜態吸附和解吸性能，篩選出最合適的SP700型樹脂，對其靜態及動態吸附性能進行了研究，為大孔吸附樹脂法富集、純化苦蕎總皂苷提供可行的工藝路線。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

苦蕎（黑豐一號） 由山西省農業科學院提供，于60℃真空干燥至恒重，粉碎后過60目篩保存備用；大孔吸附樹脂日本三菱化學公司生產，均經過前處理，密封后放入冰箱待用；薯蕷皂苷標準品（＞95%） 百靈威科技有限公司；香草醛（99.0%） 北京化學試劑公司；石油醚（30～60℃）、無水乙醇、正丁醇、高氯酸等其余常規試劑均為分析純。

TU1810型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；BT-100N型數顯恒流泵、CBS-B型程控多功能全自動部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-S型數顯恒溫水浴鍋江蘇常州翔天實驗儀器廠；HZS-HA型恒溫振蕩器哈爾濱市東明醫療儀器廠；RE52-98型旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；H35型冷卻水循環器北京萊伯泰科儀器有限公司；GL-20B型臺式離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1苦蕎總皂苷粗品的制備將苦蕎籽粒脫殼粉碎后過60目篩，以石油醚（30～60℃）于50℃索氏提取8h，干燥至恒重得脫脂苦蕎粉末。精確稱取一定量的脫脂原料，以1∶12的固液比，用70%的乙醇水溶液于50℃置于磁力攪拌器上保持恒定的轉速回流提取提取1h，4000r/min離心10min除去殘渣，濃縮提取液，濃縮后的提取液用蒸餾水溶解后加石油醚等體積萃取3次脫脂，取下層水相加水飽和正丁醇等體積萃取3次，合并正丁醇相，濃縮干燥，取干燥品以蒸餾水復溶后待用。

1.2.2苦蕎總皂苷濃度的測定方法

1.2.2.1標準曲線的制作參照張小飛等［9］的方法，并略有改進：精密稱取干燥至恒重的薯蕷皂苷對照品10.0mg，用甲醇溶解并定容至25mL，搖勻，配制成質量濃度為0.4mg/mL的薯蕷皂苷標準溶液，分別準確量取該標準品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于25mL具塞試管中，在70℃水浴上蒸干甲醇后取出，依次加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，于70℃水浴上封口加熱15min，迅速在冰水中冷卻，再加入5mL的冰醋酸搖勻，以香草醛-冰醋酸溶液∶高氯酸∶冰醋酸=1∶4∶25的混合溶液作為空白對照，于最大吸收波長454nm處測得吸光值（A），以吸光值A為縱坐標，薯蕷皂苷標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線，得擬合回歸方程：x=4.2937A－0.8523（R2=0.9989），薯蕷皂苷標準品質量含量在0～46.7μg/mL范圍內與吸光值線性關系良好。

1.2.2.2含量的測定參照1.2.2.1中的步驟處理樣液后，測定吸光值A，根據標準曲線分別計算苦蕎提取液中總皂苷的含量，取平均值。

1.2.3樹脂的篩選

1.2.3.1不同樹脂的吸附容量的測定分別準確稱取預處理后的SP700、SP825、HP20、HP2MGL、SP70、SP207大孔樹脂各1.0g，置于50mL的具塞三角瓶中，精確加入制備好的苦蕎總皂苷提取液（樣液濃度0.586mg/mL）50mL，以150r/min的速度在室溫下振蕩吸附24h，至吸附平衡，抽濾，按照1.2.2中的方法測定濾液中的總皂苷濃度，按照公式（1）計算上述6種樹脂的飽和吸附容量［10］。

式中：Q為飽和吸附容量（mg/g干樹脂）；C0為苦蕎皂苷在樣液中的初始濃度（mg/mL）；Ce為苦蕎皂苷在吸附殘液中的濃度，即平衡濃度（mg/mL）；V1為加入的吸附溶液的體積（mL）；m為干樹脂用量（g）。

1.2.3.2不同樹脂的解吸得率的測定實驗中選用毒性低、易濃縮回收的乙醇作解吸溶劑。向上述1.2.3.1中充分吸附后的各份樹脂中加入體積分數為90%的乙醇50mL，密塞，以150r/min的速度于室溫下振蕩解吸24h，至解吸平衡，抽濾，按照1.2.2中的方法測定濾液中總皂苷濃度，利用公式（2）計算各種樹脂的解吸得率［10］。

式中：D為苦蕎總皂苷的解吸得率（%）；Cx為解吸液中苦蕎皂苷的濃度（mg/mL）；V2為解吸液體積（mL）；Q為吸附容量（mg/g干樹脂）；m為干樹脂用量（g）。

1.2.4SP700對苦蕎總皂苷的靜態吸附-解吸條件優化

1.2.4.1最佳樣液濃度的確定分別準確稱取預處理后的6份SP700大孔樹脂各1.0g，置于50mL的具塞三角瓶中，精確加入初始樣液濃度分別為0.147、0.293、0.440、0.586、0.733、0.879mg/mL的苦蕎總皂苷提取液50mL，按照與1.2.3.1中相同的操作方法使其充分吸附后抽濾，按照1.2.2中的方法檢測濾液中苦蕎總皂苷的濃度，計算其吸附率。之后對上述充分吸附后的樹脂按照1.2.3.2中相同的操作，解吸至平衡后抽濾，測定濾液中總皂苷的濃度，按照公式（2）計算解吸得率，考察室溫下不同樣液濃度對吸附解吸效果的影響，以確定最佳樣液濃度［12］。

1.2.4.2吸附平衡時間的確定精密稱取SP700樹脂1.0g各3份，置于三角瓶中，分別加入苦蕎總皂苷提取液50mL（最佳樣液濃度由1.2.4.1確定），于搖床中以150r/min的轉速，室溫下振蕩吸附，每隔30或60min取其上清液，按照1.2.2中的方法檢測其中苦蕎總皂苷的含量，以吸附時間為橫坐標，吸附容量為縱坐標繪制其吸附動力學曲線，以考察不同的吸附時間對吸附容量的影響［10］，確定吸附平衡時間。

1.2.4.3洗脫液最佳體積分數的確定精密稱取SP700樹脂1.0g各5份，置于三角瓶中，分別加入苦蕎總皂苷提取液50mL（最佳樣液濃度由1.2.4.1確定），按照1.2.3.1中的操作充分吸附后，再按照1.2.3.2中的方法在室溫下用不同體積分數的乙醇溶液（10%、30%、50%、70%、90%）50mL對其進行解吸，按照公式（2）計算其解吸得率，以確定解吸液的最佳體積分數［13］。

1.2.5SP700大孔樹脂動態吸附-解吸條件優化

1.2.5.1最佳上樣量的確定將已預處理過的SP700大孔吸附樹脂15mL，濕法裝柱（Φ10mm×200mm），上樣，對層析柱下端流出液間隔取樣，每3mL一管，并編號，直至達到飽和吸附，測定每管樣品中苦蕎皂苷的含量，計算泄漏率，以流出液的樣品標號為橫坐標，泄漏率為縱坐標繪制泄露曲線［9］，根據漏點，確定最佳上樣液體積。

確定泄露點的計算公式：

式中：C0為流出液總皂苷濃度；C為上樣液中總皂苷濃度。

1.2.5.2梯度洗脫實驗取50mL苦蕎總皂苷樣液，采用1.2.4.1中確定的最佳樣液濃度，1.2.5.1中確定的最佳上樣量進行動態吸附實驗，控制流速為2BV/h［10，14］，使其流經SP700大孔吸附樹脂柱，達到上樣終點后，先用2～3BV的蒸餾水洗掉雜質及殘留在柱中的提取液，然后以不同體積分數的乙醇水溶液進行洗脫，第一洗脫模式為10%（40min）→30%（40min）→50%（40min）→70%（40min）→90%（60min），洗脫流速為2BV/h，洗脫液每5mL收集一管，每一濃度的乙醇用量以洗脫液吸光度減小至恒定時為限，測定其皂苷濃度，以確定適合除去雜質和洗脫皂苷的乙醇體積分數。根據第一梯度洗脫模式的結果調整第二洗脫模式梯度為：50%（30min）→70%（110min）。洗脫得率以合并后的分段洗脫液中皂苷總量占上樣液中皂苷總量的比例計。

1.3數據處理與統計分析

所有實驗數據采用均值±標準差（Means±SD）表示，重復次數n=3，以Microsoft Excel 2007軟件繪圖，SAS9.2軟件進行ANOVA單因素方差分析來檢驗平均值之間的顯著性差異，p＜0.05。

2　結果與分析

2.1樹脂篩選結果

經過測定，6種大孔樹脂對苦蕎總皂苷的靜態吸附容量和解吸得率的分析結果如圖1所示，數據分析顯示，6種樹脂對苦蕎總皂苷的吸附與解吸能力差異顯著，其中SP700、SP207、SP825對苦蕎總皂苷的吸附性能較好，SP70、SP700、HP20解吸性能較好。評價樹脂性能的優劣，要綜合考查其對該成分的吸附容量和解吸得率，吸附容量反映樹脂對其的吸附能力，解吸得率則反映該物質被吸附之后能否被充分洗脫下來，顯著性分析表明SP700樹脂對苦蕎總皂苷的吸附與解吸性能均為最好，因此優選SP700大孔吸附樹脂作進一步研究。

圖1　不同類型樹脂的吸附容量與解吸得率Fig.1　The adsorption capacity and desorption ratio of different macroporous resin

表1　不同濃度樣液下SP700的吸附與解吸性能Table 1　The SP700 adsorption and desorption performance of different concentrations of sample solution

2.2SP700樹脂靜態吸附-解吸條件優化

2.2.1上樣液濃度的確定表1實驗數據表明，不同樣液濃度下SP700樹脂對苦蕎總皂苷的吸附與解吸性能差異顯著，樣液中總皂苷的質量濃度控制在約0.586mg/mL左右時，其吸附容量和解吸得率均較好，繼續增加初始樣液的初始濃度時，吸附容量和解析得率的變化不明顯。與謝宏等［15］在優化人參籽皂苷時的數據趨勢相吻合，當樣液濃度大于0.586mg/mL時，隨著濃度的繼續增大，吸附量基本保持穩定，這亦與李淑珍等［12］的實驗現象相吻合。這說明雖然樣液濃度的增加有利于提高樹脂的吸附效率，但是隨著濃度的繼續增加，樣液粘度變大，混濁現象嚴重，一則容易堵塞樹脂孔隙而影響吸附和解吸［12］，增大在動態吸附過程中上樣的流動阻力，不利于操作；二則會加重對樹脂的污染，縮短樹脂的使用壽命［10］，結合不同樣液濃度下的解吸得率，確定實驗用最佳樣液濃度約為0.586mg/mL。

2.2.2吸附平衡時間的確定經過測定，0.568mg/mL的樣液濃度下，不同的吸附時間下SP700的吸附情況如圖2所示。

圖2　不同吸附時間下的SP700吸附量Fig.2　The SP700 adsorption quantity under different adsorption time

由圖2可知，SP700樹脂的吸附容量隨著吸附時間的增加而增大，在吸附進行6h后吸附容量基本穩定，不再增加，達到吸附平衡狀態，此時其飽和吸附容量約為（25.241±0.590）mg/g。為了使樹脂充分吸附達到飽和吸附量，參考丁軻及張若潔［8-10，12］等人的實驗方法，并結合夜間無法持續進行實驗的實際情況，在靜態吸附實驗中吸附時間均選擇24h。

2.2.3不同乙醇體積分數下SP700樹脂的解吸性能經過測定，不同乙醇體積分數下SP700樹脂的解吸性能如圖3所示。

圖3　不同乙醇體積分數下SP700樹脂的解吸得率Fig.3　The SP700 desorption ratio of different ethanol volume fraction

由圖3可知，隨乙醇濃度的增大，解吸得率明顯增加，50%以下的乙醇溶液對SP700大孔樹脂中的總皂苷的解吸得率很小，90%乙醇解吸效果最佳，大量的皂苷類成分在該部位得到富集，可見較高濃度的乙醇溶液有利于苦蕎總皂苷的解吸，因此在靜態吸附實驗中使用90%的乙醇作為解吸劑；但同時考慮到乙醇濃度越高，洗脫能力越強，隨目標成分洗下的雜質也越多［16］，且在洗脫過程中易揮發，因此在動態實驗的梯度洗脫模式中選擇50%、70%作為洗脫梯度。

2.3SP700樹脂的動態洗脫實驗

考慮到實際樹脂純化是一個動態的過程，與靜態吸附、解吸有一定的差異［12］，對通過靜態實驗篩選出的SP700樹脂，進行動態吸附實驗。

2.3.1上樣流速與洗脫流速的選擇動態實驗中樣品溶液通過樹脂柱的流速過快，則樣品未完成吸附，便隨吸附液流出，造成吸附率減低［7］，上樣流速過慢則會影響生產效率，延長生產周期，提高生產成本。因此該動態吸附實驗中設定上樣流速為2BV/h，以利于樣品的充分吸附。洗脫過程中，流速太快時，洗脫劑還未與被吸附的皂苷進行充分作用便將其從大孔樹脂的吸附位點上置換出來，影響洗脫效率［7］，而流速太慢則使作業周期延長，結合劉穎等［17］在大孔樹脂純化穿山龍總皂苷的實驗中對最佳流速篩選的分析，確定動態實驗的洗脫流速為2BV/h。

2.3.2最佳上樣量的確定根據圖4繪制的泄露曲線確定最佳上樣量，一般來說當泄漏率達到10%左右時可視為漏點［9］。圖4結果表明4號樣品時樹脂已經開始發生輕微的泄露，隨著上樣量的增加，泄漏量增大，5號樣品的泄漏率已經達到10%左右，此時上樣量為15mL，即樹脂比樣液體積為1∶1。當動態吸附過程到達穿透點（即漏點）時，吸附作用開始減弱，甚至消失，因此選擇合適的上樣量，可以提高樹脂對樣品的吸附性能。理論上講，上樣量越小，樹脂對樣品的吸附效果越好，但上樣量太小，樹脂的利用率太低，上樣量太大，樣品得不到有效吸附而被浪費［18］，依據泄露曲線中穿透點的位置，確定最佳上樣量為15mL。

圖4　泄露曲線Fig.4　The dynamic penetration curve

2.3.3動態解吸洗脫結果如圖5所示，從結果中可以看出，在第一梯度洗脫模式下，10%、30%、50%的乙醇幾乎未能洗脫皂苷，70%的乙醇洗脫皂苷的得率為72.3%，90%的乙醇洗脫皂苷的得率為13.6%，總的洗脫得率為85.9%。

根據上述第一梯度洗脫模式的實驗結果調整為第二梯度洗脫模式，先用50%的乙醇洗去雜質，再用70%的乙醇將皂苷洗脫下來，如圖6所示。經測定，在這種模式下的洗脫得率可以達到88.9%，取得了較好的洗脫效果。洗脫液蒸干后所得固形物中皂苷含量較提取液固形物中皂苷含量提高了約2倍，確定采用第二種梯度洗脫方式。

圖5　第一梯度洗脫模式Fig.5　The first gradient elution curves in dynamic state

圖6　第二梯度洗脫模式Fig.6　The second gradient elution curves in dynamic state

3　結論

通過靜態吸附解吸實驗篩選出適合分離純化苦蕎總皂苷的大孔吸附樹脂SP700，其飽和吸附量為（25.241±0.590）mg皂苷/g樹脂。研究SP700對苦蕎總皂苷的靜態及動態吸附性能，確定SP700型大孔樹脂分離純化苦蕎總皂苷的最佳工藝條件為：最佳上樣濃度約0.586mg/mL，上樣流速2BV/h，樹脂比樣液體積為1∶1，動態洗脫實驗中，以體積分數分別為50%和70%的乙醇溶液進行分段洗脫，洗脫流速為2BV/h，用量為2～3BV，洗脫得率最高可達到88.9%，洗脫液蒸干后所得固形物中總皂苷含量較提取液固形物中總皂苷含量提高了約2倍，SP700樹脂分離純化苦蕎總皂苷的效果較好。

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Study on separation and purification of total saponins from tartary buckwheat with macroporous resin

ZHI Xiu-juan1，2，MA Ting-jun2，DING Ke2，LI Dong1，*
（1.College of Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China；2.Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing 102206，China）

In order to optimize process condition of separation and purification of total saponins from tartary buckwheat with macroporous resin.The appropriate SP700 resin was choosed，which the saturated adsorption capacity was up to（25.241±0.590）mg saponins/g resin through the static adsorption and desorption test.The influence of sample liquid concentration，adsorption time on the adsorption capacity，and the effect of ethanol volume fraction on the yield of desorption were studied in the static test.And in the dynamic test，the optimal purification conditions of using SP700 resin to absorb and purify total saponins from tartary buckwheat were as follows：the best concentration of sample solution 0.586mg/mL，velocity 2BV/h，the ratio of resin and sample solution 1∶1，in the dynamic elution experiment，segmented elution was carried with 50%and 70%ethanol solution respectively elution velocity 2BV/h，dosage 2～3BV，elution rate was up to 88.9%，the content of saponins in eluent was 2 fold as that in sample solution.

tartary buckwheat；saponin；separation and purification；macroporous resin

TS201.2

B

1002-0306（2015）12-0226-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.039

2014－11－18

智秀娟（1975-），女，在讀博士研究生，講師，研究方向：農產品加工及貯藏工程。

李棟（1973-），男，教授，研究方向：農產品加工及貯藏工程。

國家燕麥蕎麥產業體系建設專項資助（CARS-08-D-2）。