超聲波輔助提取川明參揮發油及化學成分的GC-MS分析

董紅敏，李　路，沈麗雯，李慧妍，李　玉，秦　文

（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

超聲波輔助提取川明參揮發油及化學成分的GC-MS分析

董紅敏，李路，沈麗雯，李慧妍，李玉，秦文*

（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

為研究川明參提取工藝及化學成分，在單因素實驗基礎上，利用Box-Behnken設計原理和響應面分析方法，確定超聲波輔助提取川明參揮發油的最優工藝，并利用GC-MS技術對川明參的揮發油成分進行鑒定。結果表明：川明參揮發油超聲輔助提取的最佳工藝條件為：液料比8∶1（mL/g）、超聲功率175W、超聲時間28min。在此工藝條件下得率為2.213%±0.042%。在川明參揮發油中共檢測出76種成分，鑒定并確定出其中42種化合物，被鑒定物質相對含量占揮發油總量的97.37%。本方法可為川明參的進一步開發和利用提供參考。

川明參，揮發油，超聲波，GC-MS

川明參為傘形科（Umbelliferae）植物川明參屬Chuanminshen violaceum Sheh et Shan的根，是我國特有的單種屬植物，是四川產道地藥材。具有潤肺化痰、和胃、健脾、解毒等功效，多用于病后補虛和強壯身體，為一藥食同源植物［1-2］。在產地常作為滋補品、菜肴等食用，故具有相當高的藥用和食用價值。但從目前的研究報道來看，對川明參的開發利用程度相對較低，主要集中在多糖、蛋白及黃酮等方面［3-4］。有關川明參揮發油化學成分的研究較少。

揮發油常用的提取方法有水蒸氣蒸餾法、熱回流提取法、超臨界CO2流體萃取法等。水蒸氣蒸餾法和熱回流提取法提取時間長，提取率低；超臨界CO2流體萃取法雖然具有提取時間短，溶劑無殘留等優點，但操作成本高。超聲波輔助提取作為一種優良的提取方法，具有操作簡便、提取時間短、提取率高及成本低等特點，廣泛應用在生物活性物質的提取方面［5-7］。運用超聲波輔助提取川明參揮發油的工藝及其成分分析尚未見報道，本實驗在單因素實驗基礎上運用響應曲面分析法研究超聲波輔助提取川明參揮發油的最佳工藝參數，同時通過氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對揮發油成分進行分析，以期為川明參食用和藥用價值的開發利用提供一定的科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮川明參2013年春由四川閬中供銷社提供；C7～C30正構烷烴對照品美國Sigma公司；正己烷、石油醚（60～90℃）、乙醚、乙酸乙酯和無水Na2SO4均為分析純。

FW177中藥粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-250DB型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發器、SHZ-III循環水真空泵上海亞榮生化儀器廠；101-4型恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀美國Agilent公司；電子天平北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1川明參揮發油的提取及得油率將新鮮川明參于40℃鼓風干燥箱中烘至恒重。用FW177中藥粉碎機粉碎，并過80目篩。放置干燥環境中保存備用。取10g川明參粉于具塞三角瓶中，加入一定液料比（mL/g）的提取劑，在一定超聲波輔助提取條件下提取一定時間后，在提取液加入無水Na2SO4后過濾，濾液加入圓底燒瓶中真空回收溶劑后稱量。得油率計算公式如下：

式中，m為所取川明參粉質量，g；m1為圓底燒瓶質量，g；m2回收溶劑后圓底燒瓶質量。

1.2.2單因素實驗

1.2.2.1提取劑的選擇分別以正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯為提取劑，固定超聲功率100W、超聲時間20min、液料比為（mL/g）10∶1，按1.2.1節操作進行提取，每組重復3次，計算得油率，考察提取劑種類對川明參揮發油得油率的影響。

1.2.2.2液料比以1.2.2.1的結果為提取劑，固定超聲功率100W、超聲時間20min，設置液料比為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL/g），5個水平，每個水平重復3次，計算得油率，考察不同液料比對川明參揮發油得油率的影響。

1.2.2.3超聲功率固定超聲時間20min，液料比采用1.2.4.2節選出的結果，超聲功率設置為100、125、150、175、200W 5個水平，每個水平重復3次，計算得油率，考察不同超聲功率對川明參揮發油得油率的影響。

1.2.2.4超聲時間采用以上選出的結果為固定條件，超聲時間設置為10、20、30、40、50min 5個水平，每個水平重復3次，計算得油率，考察不同超聲時間對川明參揮發油得油率的影響。

1.2.3響應面設計優化川明參揮發油提取工藝在單因素實驗基礎上，按照Box-Behnken設計原理，選擇液料比、超聲功率和超聲時間為自變量，以揮發油得油率為響應值，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進行響應曲面分析優化提取條件，響應曲面因素與水平表見表1。

表1　響應面分析因素與水平表Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.4GC-MS分析氣相色譜條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30m×0.32mm，0.20μm）；進樣口溫度250℃；升溫程序為初始溫度45℃保持1min，15℃/min升溫至90℃，10℃/min升溫至200℃，5℃/min升溫至290℃、保持3min。載氣He，流量為1.2mL/min，溶劑延遲時間：3min；進樣量為1μL。

質譜條件：EI離子源，離子源溫度230℃，電子能量70eV，質量掃描范圍30～500amu，接口溫度280℃。

1.2.5保留指數的計算取正構烷烴混合對照品C7～C30，按1.2.4項下條件分析，記錄各正構烷烴的保留時間，采用線性升溫公式［8］計算各成分的保留指數RIx，RIx=100n+100×（tx-tn）/（tn+1-tn），其中tx，tn，tn+1分別為被分析組分及n和n+1個碳原子數的正構烷烴的流出峰的保留時間（tn＜tx＜tn+1）。

1.2.6化學成分分析定性分析：采用氣相色譜-質譜聯用儀進行分析鑒定。通過NIST11.L譜庫自動檢索獲得初步鑒定結果，再結合保留指數，選擇質譜圖和RI值匹配度最高的化學結構為最佳鑒定結果。

定量分析：通過GC-MS數據處理系統，按照峰面積歸一法進行定量分析，求出揮發油中各化學成分的相對質量分數。

1.3數據處理

單因素實驗數據采用Origin 8.0作圖軟件作圖。響應面實驗數據采用Box-Behnken的中心組合實驗設計，分析和作圖軟件使用Design-Expert 8.0.5b軟件。所有實驗均重復3次。

圖1　提取劑種類對川明參揮發油得油率的影響Fig.1　Effect of different solvents on the extraction yield of volatile oil

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1提取劑種類對川明參揮發油得油率的影響不同提取劑對川明參揮發油得油率影響結果如圖1所示。除乙酸乙酯提取物為深褐色渾濁黏稠狀，其他3種溶劑提取物為黃色透明、有芳香氣味的油狀物并含有少量白色結晶蠟狀固體。這可能是因為乙酸乙酯極性相對較高，提取物含極性高、難揮發性物質較多。4種溶劑中得油率最高的為石油醚（60～90℃）且價格也比正己烷低，故選用石油醚（60～90℃）作為提取劑。

2.1.2液料比對川明參揮發油得油率的影響不同液料比對川明參揮發油得油率的影響結果如圖2所示，液料比在4∶1～8∶1之間時，得油率隨提取劑用量的增加而迅速提高，這是因為隨著液料比的增加，增加了固相與液相間的濃度差，有利于揮發油成分的溶出，液料比超過8∶1后，得油率變化不大，略有下降。這可能是因為液料比增加會使超聲波空化作用相對減弱，從而使得油率下降。因此液料比以8∶1為宜。

圖2　液料比對川明參揮發油得油率的影響Fig.2　Effect of liquid to solid ratio on the extraction yield of volatile oil

2.1.3超聲功率對川明參揮發油得油率的影響不同超聲功率對川明參揮發油得油率的影響結果如圖3所示，隨著超聲功率的增加，超聲波對細胞壁的破碎作用增強，揮發油溶出速率增大，得油率逐漸增加，功率超過175W時，得油率略有下降。相似的結果在超聲提取木薯皮香豆素時也有出現過［9］，可能是因為超聲功率大于175W時，提取液振動加速，產生的空化作用使空化氣泡閉合過快，細胞破碎作用隨之減弱，導致得油率下降。因此超聲功率以175W為宜。

圖3　超聲功率對川明參揮發油得油率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic power on the extraction yield of volatile oil

2.1.4超聲時間對川明參揮發油得油率的影響不同超聲時間對川明參揮發油得油率的影響結果如圖4所示，在10～30min時，得油率隨著超聲時間的增加而迅速提高，隨后提取率有所下降。其原因可能是隨著時間的增加，在超聲波作用下川明參細胞破碎度逐漸增大，揮發油溶出量逐漸增加，得油率提高；但繼續延長超聲時間，川明參細胞碎片過多阻礙揮發油溶出［10］，得油率下降。

圖4　超聲時間對川明參揮發油得油率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic time on the extraction yield of volatile oil

2.2響應面優化超聲波提取工藝

2.2.1響應曲面實驗設計與結果在單因素實驗的基礎上，以川明參揮發油得油率為實驗指標，用Design-Expert 8.0.5b軟件設計響應面實驗方案，以液料比（X1），超聲功率（X2）與超聲時間（X3）作為響應面實驗的因素，進行三因素三水平17個實驗點的響應面分析實驗，響應面實驗設計及結果見表2。

表2　響應面實驗設計及結果Table 2　Experimental design and results of response surface analysis

運用Design Expert 8.0.5b數據統計分析軟件對表2實驗結果進行多元回歸擬合，得川明參揮發油得油率與各因素的二次多項式回歸模型為：

Y=2.1736-0.05788X1+0.20175X2-0.06038X3+ 0.038X1X2-0.03525X1X3+0.1265X2X3-0.43493X12-0.46818X22-0.07993X32

對該回歸模型進行方差分析，結果見表3，回歸系數顯著性檢驗結果見表4，響應曲面圖見圖5。

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the fitted regression model

從表3可以看出，該模型p＜0.0001，表明該二次回歸方程模型極顯著，模型的相關系數R2=0.994733，表明該模型可以解釋99.47%的響應值Y的變化，模型修正R2（0.98796）與預測R2（0.930725）相差不大，表明模型實際值與預測值擬合較好，且失擬項p= 0.0680＞0.05，失擬項不顯著，實驗誤差較小，因此可用該模型對川明參揮發油的超聲提取效果進行分析和預測。

表4　回歸系數的顯著性檢驗Table 4　Significance test of each regression coefficient

由表4可知，模型一次項和二次項對響應值Y影響都極顯著（p＜0.01），說明分析結果可靠；模型交互項X2X3對響應值Y影響極顯著，表明各影響因素對得油率的影響非簡單的線性關系；從實驗所得的響應面分析結果可以找到提取過程中的交互作用，如表4和圖5可知，超聲功率和超聲時間的交互作用極顯著，其余項之間的交互作用不明顯。根據F值大小，可知各因素對得油率影響的程度依次是超聲功率（X2）＞超聲時間（X3）＞液料比（X1）。

2.2.2驗證實驗運用Design Expert 8.0.5b軟件對實驗結果進行優化分析，確定最佳提取條件為：液料比7.9∶1、超聲功率179.58W、超聲時間27.79min，在該超聲條件下，預測得油率可達到2.200%?？紤]到實際操作的可行性，將最佳工藝條件修正為：液料比8∶1、超聲功率175W、超聲時間28min。采用上述優化條件進行3次驗證實驗，得油率實測值為2.213%±0.042%，表明實測值與預測值基本吻合，該模型能較好的預測川明參總揮發油得油率，可用于指導生產實踐。

圖5　各兩因素交互作用對得油率的影響Fig.5　Response surface plots of mutual influences of extraction conditions on the extraction yield of volatile oil

圖　川明參揮發油的TICFig.6　The TIC of the volatile oil from Chuanminshen violaceum

2.3川明參揮發油的GC-MS分析

對川明參揮發油進行氣相色譜-質譜聯用分析，總離子流圖（TIC）見圖6、鑒定結果見表5。采用面積歸一化法從川明參揮發油中共檢測出76種成分，鑒定并確定出其中42種化合物，占其總量的97.37%，其中酸類3種，占揮發油的36.09%，醇類1種，占揮發油的18.88%，酯類10種，占揮發油的15.64%，酮類6種，占揮發油的13.62%，烴類18種，占揮發油的11.18%，酚類1種，占揮發油的0.8%，醛類1種，占揮發油的0.31%，其他化合物2種，占揮發油的0.85%。相對含量較高的有鐮葉芹醇（18.88%）、亞油酸（26.13%）、棕櫚酸（9.8%）、亞磷酸二（十二烷基）酯（6.4%）、3，4-雙氫-8-羥基-6-甲氧基-3-甲基-苯并吡喃酮（5.2%）、歐前胡素（3.87%）等成分。

表5　川明參揮發油的化學成分Table 5　Chemical compositions of volatile oil from Chuanminshen violaceum

一些化合物的質譜極相似，所得匹配度高的化合物不止一種。僅靠質譜圖的匹配，難以對化合物準確定性，采用保留指數輔助定性可以提高川明參揮發油化學成分的準確性。相同實驗條件下，測定C7～C30系列正構烷烴標準溶液的TIC譜圖見圖7。計算本實驗條件下待鑒定化合物的保留指數，見表5，與質譜匹配度高的幾種化合物的參考保留指數進行比對，將偏差較大的化合物排除，選擇保留指數較為一致的（偏差不超過3%）［11］。為化合物的準確定性提供依據。

圖7　C7～C30系列正構烷烴標準溶液的TICFig.7　The TIC of standard solution of C7～C30

所得化合物中亞油酸是不飽和脂肪酸，具有預防癌癥、心血管疾病、糖尿病以及免疫調節等作用［12-13］；棕櫚酸是機體，特別是嬰兒生長最重要的脂肪酸，為機體的生長發育、大腦活動、新陳代謝提供能量，是機體代謝不可缺少的飽和脂肪酸［14］；鐮葉芹醇又稱人參炔醇，具有抗癌、降壓、抗菌等生物活性［15］；歐前胡素等香豆素成分具有抗菌、平喘及抗過敏等作用［16-17］。此外，川明參揮發油具有獨特的香味，這可能與其含有大量酯類和香豆素類化合物有關。

3　結論

3.1在單因素實驗的基礎之上，采用Box-Behnken實驗設計以及響應面分析對提取工藝進行優化，得出最優工藝條件為：液料比8∶1、超聲功率175W、超聲時間28min。在此工藝條件下得油率為2.213%± 0.042%。該方法操作簡單方便，成本低，為川明參揮發油的工業化生產提供科學依據和參考。

3.2采用保留指數對川明參揮發油各組分進行鑒別，為明確各組分出峰順序及進一步研究川明參揮發油組分提供了依據。從上述鑒定的結果可以看出，川明參揮發油中的主要成分是酸類、醇類、烴類、酯類、醛類、酮類及酚類。所得川明參揮發油組分以保留指數大，高沸點組分為主，表明超聲波輔助提取法適用于高沸點組分的提取。目前未有報道單一提取方法可全面提取植物揮發油組分，各提取方法都只能獲得部分揮發性成分，為全面分析川明參揮發油組分，應進一步考慮多種方法綜合使用。

［1］佘盂蘭，單人驊.傘形科兩新屬——環根芹屬和川明參屬［J］.植物分類學報，1980，18（1）：45-49.

［2］萬德光，彭成，趙軍寧.四川道地中藥材志［M］.成都：四川科學技術出版社，2005：53-55.

［3］張梅，雨田，蘇筱琳，等.川明參多糖的提取工藝［J］.華西藥學雜志，2007，22（3）：361-362.

［4］邵承斌，李宏，吳鶴麟，等.川明參營養化學成分的研究［J］.中草藥，1997，28（10）：590-591.

［5］劉開源，趙衛紅.超聲波法提取紅香酥梨揮發性成分的研究［J］.食品科學，2005，26（3）：215-217.

［6］楊月云，王小光，周娟.超聲波輔助萃取油菜花揮發油及其化學成分的氣質聯用分析［J］.食品科學，2013，34（18）：98-102.

［7］郭璇，鄭聯合，柴萌，等.兩種方法提取降香黃檀籽揮發油的成分分析［J］.食品工業科技，2011，32（10）：95-98.

［8］Dung N T，Kim J M，Kang S C.Chemical composition，antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract of Cleistocalyx operculatus（Roxb.）Merr and Perry buds［J］.Food and Chemical Toxicology，2008，46：3632-3639.

［9］陳曉明，李開綿，臺建祥，等.木薯皮總香豆素活性物質超聲波提取工藝優化［J］.農業機械學報，2012，43（1）：158-164.

［10］張國棟，嚴科丹，胡博然.超聲波輔助提取薄荷揮發油的工藝優化［J］.農產品加工·學刊，2013（8）：44-46，50.

［11］閆婕，衛瑩芳，古銳.應用自動質譜退卷積定性系統（AMDIS）和保留指數分析馬爾康柴胡地上、地下部分與北柴胡揮發油的成分差異［J］.中國中藥雜志，2014，39（6）：1048-1053.

［12］樂薇，吳士筠，高欣.大紅袍花椒揮發油的提取及化學成分的氣相色譜-質譜分析［J］.食品科學，2014，35（2）：261-265.

［13］劉佩，沈生榮，阮暉，等.共軛亞油酸的生理學功能及健康意義［J］.中國糧油學報，2009，24（6）：161-165.

［14］商允鵬，生慶海，王貞瑜，等.三酰甘油Sn-2位上棕櫚酸生理功能及研究概況［J］.中國糧油學報，2010，25（10）：119-123.

［15］段賢春，汪永忠，居靖，等.人參炔醇研究進展［J］.安徽醫藥，2008，12（1）：1-3.

［16］王夢月，賈敏如，馬逾英，等.白芷中四種線型呋喃香豆素類成分藥理作用研究［J］.天然產物研究與開發，2010，22（3）：485-489.

［17］包文艷，歐陽貴平，陳廣明，等.香豆素及其衍生物的合成與生物活性研究進展［J］.精細化工中間體，2011，41（1）：1-7，26.

Ultrasonic-assisted extraction and composition analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of volatile oil from Chuanminshen violaceum

DONG Hong-min，LI Lu，SHEN Li-wen，LI Hui-yan，LI Yu，QIN Wen*
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

To study the extraction and analysis of chemical constituents in volatile oil from Chuanminshen violaceum，the volatile oil of from Chuanminshen violaceum was extracted by ultrasonic-assisted extraction method and its chemical composition was analyzed by GC-MS.On the basis of single factor experiments，a polynomial regression model was fitted by means of Box-Behnken design.The optimum extraction conditions were as follows：liquid to solid ratio 8∶1（mL/g），ultrasonic power 175W，and ultrasonic time 28min.Under the conditions，the extraction yield of volatile oil reached 2.213%±0.042%.A total of 76 compounds were detected in the volatile oil，of which 42 were identified，accounting for 97.37%of the total volatile compounds.This study could provide useful

for the development and exploitation of Chuanminshen violaceum.

Chuanminshen violaceum；volatile oil；ultrasonic；GC-MS

TS201.1

B

1002-0306（2015）12-0259-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.046

2014－09－25

董紅敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：農產品產后處理與品質控制。

秦文（1967-），女，博士，教授，研究方向：農產品產后處理與品質控制。