無血清培養CHO細胞的研究進展

董慧君 曾憲卓 魯 菲 郭明輝 張 哲

（深圳愛生再生醫學科技有限公司，廣東 深圳518057）

隨著生物技術的飛速發展，單克隆抗體、細胞因子、疫苗和各種生物活性蛋白等生物制品在診斷和治療中應用日益廣泛，其需求量大大增加，因此，通過體外大規模培養動物細胞生產生物制品技術的研究越來越受到青睞。CHO細胞是生產蛋白類生物制品最重要的表達系統，采用無血清培養CHO細胞相比含血清培養，能避免對實驗動物的傷害、潛在的污染源影響、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致及價格高等諸多弊端，因而受到生物制藥領域的廣泛關注。

1 CHO細胞

CHO細胞即中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell)，是最具代表性的動物細胞表達系統，被廣泛應用于生物制藥領域。它建株于1957年，由美國科羅拉多大學Theodore T.Puck從一成年雌性中國倉鼠卵巢中分離得到，是一種連續細胞系，能傳百代以上，具有永生性。后來陸續又有很多科學家用藥物加壓、極端條件篩選和誘導突變等方法篩選得到了一系列不同表型的CHO細胞株[1]，如DUKX-B11、DG-44和CHO-K1等。

CHO細胞能用于表達各種復雜的重組蛋白。據統計，70%以上的動物細胞表達藥物產品都是以CHO細胞為表達宿主[2]。2011年6月批準的27種單克隆抗體中，其中13種就是通過CHO細胞表達的，占了約50%的比例。

CHO細胞之所以成為最受歡迎的宿主細胞，主要在于其易于培養以及基因操作，而且相比其他表達系統，它還具有許多優點[3-4]：①具有準確的轉錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有產物胞外分泌功能，便于下游產物分離純化；③具有外源重組基因的高效擴增和表達能力；④既可貼壁生長也可以進行懸浮培養，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，外源蛋白表達水平較高；⑤CHO細胞屬于成纖維細胞，很少分泌自身的內源蛋白，利于外源蛋白的后分離。

2 無血清培養基

無血清培養基是繼天然培養基、合成培養基之后的第三類培養基。與傳統的培養基相比，無血清培養基不含動物血清或其他動物提取成分，但仍可滿足細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養基。無血清培養基由基礎培養基和添加組分兩部分組成。基礎培養基含有各種營養物質，能維持組織或細胞的生長、發育、遺傳、繁殖等一系列生命活動。目前應用最廣泛的是MEM、DMEM、RPMI1640等。添加組分為各種代替血清的因子總稱，主要包括促貼壁物質、生長因子與激素、酶抑制劑、結合蛋白以及微量元素等幾大類。這些因子既能滿足細胞的培養要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素[5-6]。

3 無血清培養CHO細胞的研究進展

隨著生物制品的需求加大以及無血清培養基諸多優勢，越來越多的生物制藥公司開始采用無血清培養基培養CHO細胞，研制適合于CHO細胞生長和產物表達的低成本無血清培養基是生物制藥領域關注的熱點。

3.1 無血清培養基成分研究

無血清培養基的成分相對比較清楚，人們可根據培養目的及細胞種類的不同，對培養基成分進行調整優化，以達到更好地培養目的。

研究證明，在無血清培養基中添加蛋白水解物可以提高最大細胞密度和生產效率。酵母水解物可作為一種低成本的無血清培養基添加物，用以成產人血小板生成素（hTPO）[7]。大豆水解物能較好地支持細胞生長和維持細胞活性[8]。Ballez等[9]研發出一種培養CHO-320細胞生產IFNγ的無蛋白培養基，該培養基中添加了大米水解物，最終最大細胞密度能提高25%，IFNγ濃度能提高60%。

還有研究評價激素、脂類及微量元素等成分對無血清培養CHO細胞的影響。趙麗麗等[10]以表達重組TNFR-Fc融合蛋白的CHOK1細胞為研究對象，確定大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳劑這幾種關鍵組分對培養基的影響，為適合于細胞生長和產物表達的低成本無血清培養基的研制提供了參考。張大鶴等[11]研制出兩種適于重組CHO-K1細胞培養的無血清培養基。微量元素完全可以替換無血清培養基中的蛋白，支持細胞生長和促進蛋白表達。通過優化調整其他營養物質，去除蛋白水解物，且不需添加任何小肽化合物后，仍能支持高密度的CHO細胞培養。

添加氨基酸有利于維持細胞活性與抗體合成；添加B族維生素能促進細胞生長并延長培養時間；葡萄糖濃度較高時會抑制細胞生長，而濃度較低時又不能有效支持細胞的生長與抗體的合成，因此需要維持適當的濃度。通過合理調整這幾類營養物的濃度配比形成的優化無蛋白培養基，可使培養的CHO細胞最高密度達到52.6×105cells/mL，抗體產量達到274mg/L，與初始培養基相比分別提高了33%和63%[12]。

通過對無血清培養基成分的適當調整和改進，可以實現對某一類細胞或細胞產物快速、專一的培養目的，如何將這些改進應用到大規模生產中還需要進一步的研究。

3.2 適用于懸浮培養的無血清培養基

懸浮培養是哺乳動物細胞大規模培養研究和應用的重要模式和首要選擇[13-14]。CHO細胞為貼壁依賴性細胞，進行懸浮培養面臨的最大問題就是細胞易集結成團使得細胞生長緩慢，且細胞團中央細胞因營養不足而容易凋亡。對于CHO細胞的懸浮培養而言，培養基是影響細胞生長和目標表達產物生產的最重要因素之一。目前已有適于CHO細胞大規模懸浮培養的商業化無血清培養基，但存在成分復雜、不明確及知識產權問題，影響培養基的進一步優化，且價格昂貴成本高，因此開發基于懸浮培養工藝的個性化無血清培養基至關重要。

研究發現腐胺、胰島素及轉鐵蛋白對11G-S細胞的懸浮培養具有明顯的生長促進作用，劉興茂等[15]選擇商業化的DMEM/F12(1∶1,V/V)為無血清培養的基礎培養基，并選取了腐胺、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺、β-巰基乙醇等常用添加劑，得到SFM-CHO-S無血清培養基，培養效果優于商品化的同類無血清培養基。郭紀元[16]從CHO細胞培養基庫中篩選得到無血清基礎培養基BM，在此基礎上調整酵母水解物、硫酸葡聚糖、檸檬酸鐵及起始葡萄糖與氨代謝相關氨基酸濃度，獲得其個性化無血清培養基Opti-BM，并研發得到相應的流加懸浮培養基FM與FM plus。

孫亞婷[17]研制出PFIA無血清無蛋白培養基，比HyQ和Ex-302兩種商業無血清培養基效果好，可作為后續流加培養的初始培養基。謝奎[18]獲得自主知識產權的無血清培養基，經驗證蛋白表達結果優于商業化培養基CD DG44，接近商業培養基P8，且成本節約一半以上。Zhang等[19]以表達重組TNFR-Fc融合蛋白的CHO-GS細胞為研究對象，以DMEM：F12：RPMI1640(2：1：1)為基礎培養基，通過調整添加氨基酸、胰島素、轉運蛋白及Pluronic F68，并結合流加培養工藝，研制出適合CHO懸浮培養的無血清培養基。

4 結語

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大，動物細胞無血清培養基的研究越來越多，也取得很大進展。隨著對細胞營養與代謝、細胞周期、細胞凋亡、信號轉導以及外源蛋白表達機制等各方面機理的深入研究，以及蛋白質組學和代謝組學技術[20]在細胞培養基設計和研究上的應用，必將為進一步推進哺乳動物細胞無血清培養基的開發，從而使細胞培養技術在生物制備、基因工程、細胞移植等領域得到更安全、更低成本和更廣泛的應用。

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［9］Ballez JS,Mols J,Burteau C,et al.Plant protein hydrolysates support CHO-320 cells proliferation and recombinant IFN-gamma production in suspension and inside microcarriers in protei-free media[J].Cytotechnology,2004,44(3)：103-114.

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