銀屑病患者皮損和外周血中CD8α+α+T 細胞的研究

孫秀文 李冰 張偉剛 黨二樂 晉亮 王剛

·論著·

銀屑病患者皮損和外周血中CD8α+α+T 細胞的研究

孫秀文 李冰 張偉剛 黨二樂 晉亮 王剛

目的 觀察銀屑病患者皮損和外周血中CD8α+α+T細胞的分布和比例，探討其在銀屑病發(fā)病中的作用。方法 采用免疫熒光技術觀察5例進展期尋常性銀屑病患者和5例健康人皮膚中CD8α+α+T細胞的分布，流式細胞儀分別檢測10例進展期尋常性銀屑病患者和8例健康人外周血中CD8α+α+T細胞比例及干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達。采用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件對實驗組和對照組各數據進行t檢驗。結果 在5例銀屑病患者皮損真皮淺層均可見以CD8α+α+T細胞為主的浸潤，未見明顯的CD8α+β+T細胞浸潤；而5例健康人皮膚中均未見CD8α+α+T細胞和CD8α+β+T細胞浸潤。流式細胞儀檢測，8例健康人外周血中CD8α+α+T細胞比例為9.12%±4.80%，10例銀屑病患者組為26.47%±12.99%，銀屑病患者組明顯高于對照組，兩組比較，t=3.96，P＜0.001。在銀屑病患者外周血CD8α+α+T細胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細胞比例分別為47.36%±19.38%和54.14%±21.14%，健康對照組分別為13.44%±9.21%和34.03%±17.22%，兩組差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為4.54和2.17，P值分別＜0.001和＜0.05）。結論 銀屑病患者皮損和外周血中存在CD8α+α+T細胞的分布和比例增多，CD8α+α+T細胞可能是參與銀屑病發(fā)病的主要CD8+T細胞亞群。

銀屑病；CD8陽性T淋巴細胞；干擾素γ；腫瘤壞死因子α

目前認為，T淋巴細胞活化及其分泌的促炎因子是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［1］。以往的研究認為，CD4+T細胞是銀屑病炎癥因子的主要來源［2］。然而近年研究發(fā)現，γδT細胞和CD8+T細胞也會分泌大量炎癥因子參與各種自身免疫性疾病發(fā)病［3-4］。隨著對CD8+T細胞亞群認識地逐漸深入，發(fā)現不同的CD8+T亞群在感染、腫瘤及自身免疫性疾病中的作用也不同。目前認為，CD8α+β+T細胞主要是殺傷性T 細胞，而 CD8α+α+T 細胞主要分泌細胞因子［5］。有研究報道，CD8+T細胞可以通過分泌炎癥因子參與銀屑病發(fā)病［4］，但其亞群在銀屑病發(fā)病中的作用及機制仍未明確。我們采用免疫熒光技術及流式細胞分析法對尋常性銀屑病患者皮損及外周血CD8α+α+T細胞的表達及分泌的細胞因子進行分析。

材料與方法

一、臨床資料

收集2013年9月至2014年4月我科門診10例進展期尋常性銀屑病患者外周血，所有患者1個月內未使用藥物治療；收取8例健康志愿者外周血作為對照組，患者及健康志愿者1個月內均未患上呼吸道感染等感染性疾病。10例患者中男6例，女4例，年齡18～55歲，平均37歲；8例健康志愿者中男5例，女3例，年齡20～55歲，平均35歲。5例進展期尋常性銀屑病患者皮損來源于活檢手術取材，5例健康對照組皮膚來源于植皮術修剪剩余皮膚。皮損與外周血檢測為同組患者。本研究經第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均知情同意。

二、材料

兔抗人CD8α單抗、鼠抗人CD8β多抗為美國abcam公司產品，單克隆抗體鼠抗人CD8α PECyanine 5、CD8β PE-Cyanine 7、固定/通透稀釋劑、固定/通透濃縮劑、通透緩沖液10×和細胞因子刺激劑為美國eBioscience公司產品，單克隆抗體鼠抗人干擾素 γ（IFN-γ）FITC、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）Alexa Fluor 488為美國BioLegend公司產品。

三、方法

1.免疫熒光：取銀屑病患者皮損進行4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟至水，并將切片浸入3%H2O2封閉液封閉；高壓修復；滴加稀釋后的一抗 50 μl，4℃過夜；第 2天室溫復溫 1 h，滴加二抗復合物，每張切片50 μl，室溫放置45 min；洗滌液沖洗；滴加DAPI復合物，室溫放置10 min；洗滌液反復沖洗，甘油封片。激光共聚焦方法進行圖像采集。

2.淋巴細胞分離：抽取靜脈血5 ml，肝素抗凝，與等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，加入到等體積的淋巴細胞分離液離心管中，離心，取中間淋巴細胞層，加PBS溶液離心，棄上清；加入紅細胞裂解液5 min，加入PBS溶液終止，離心，棄上清；用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)，置入6孔板中備用。

3.流式細胞鑒定：收集6孔板中的外周血單一核細胞于無菌流式管中吹勻，離心，棄上清；加入1 ml含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基混勻，并加2 μl細胞因子刺激劑混勻，37℃孵箱中封閉4 h；1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，加入100 μl流式洗滌液吹勻，加入CD8α和CD8β抗體，并設相應的單標，4℃避光30 min；加入1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，加入按3∶1稀釋的固定/通透稀釋劑和固定/通透濃縮劑 200 μl，室溫避光 30 min；加入 1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，并重復1次，加以通透緩沖液10×與PBS按1∶9稀釋后的液體1 ml，混勻，離心，棄上清，加IFN-γ及TNF-α抗體，4℃避光2 h；加入1.5 ml流式洗滌液離心，棄上清，加入固定液200 μl混勻，上流式細胞儀檢測。

4.統(tǒng)計分析：應用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，均數以±s表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、銀屑病皮損中CD8α+α+T細胞的分布

5例銀屑病患者皮損表皮及真皮淺層均可見以CD8α+α+T 細胞為主的浸潤，未見明顯的 CD8α+β+T細胞浸潤；而5例健康人皮膚中均未見CD8α+α+T細胞和CD8α+β+T細胞浸潤。見圖1。

二、銀屑病患者外周血CD8α+α+T細胞比例

流式細胞儀檢測10例進展期尋常性銀屑病患者和8例健康人外周血中CD8α+α+T細胞比例，結果發(fā)現，健康對照組外周血CD8α+α+T細胞比例為9.12%±4.80%，銀屑病患者組為26.47%±12.99%，兩組比較，t=3.96，P ＜ 0.001。見圖 2。

三、銀屑病患者外周血CD8α+α+T細胞亞群中細胞因子的表達

在進展期尋常性銀屑病患者外周血CD8α+α+T細胞中分泌IFN-γ和TNF-α的細胞比例分別為47.36%±19.38%和54.14%±21.14%，健康對照組分別為13.44%±9.21%和34.03%±17.22%，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為4.54和2.17，P值分別＜0.001和＜0.05）。見圖3。

討 論

銀屑病是多基因遺傳背景介導下的慢性炎癥性疾病，嚴重影響患者的身心健康，其發(fā)病機制尚未闡明［6］。現普遍認為，T細胞是銀屑病免疫紊亂形成的主導者，其異常活化是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)［7］。T細胞活化后，釋放大量的炎癥因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-17等，參與銀屑病的發(fā)生及發(fā)展［8］。

圖1 免疫熒光檢測尋常性銀屑病患者皮損CD8α及CD8β表達情況（×20） 健康人皮膚全層未見CD8α及CD8β陽性T細胞浸潤，銀屑病患者皮損可見CD8α陽性T細胞浸潤及散在CD8β陽性T細胞，以真皮淺層為主

圖2 流式細胞儀檢測健康人8例與尋常性銀屑病患者10例外周血中CD8α+α+T細胞比例 與健康對照組相比，銀屑病患者外周血中CD8α+α+T細胞比例明顯增高 2A：對照組和銀屑病患者組外周血中CD8α+α+T細胞流式細胞儀檢測結果；2B：對照組和患者組CD8α+α+T細胞和CD8α+β+T細胞的構成比

圖3 流式細胞儀檢測健康人8例與尋常性銀屑病患者10例外周血CD8α+α+T細胞亞群中細胞因子的表達 銀屑病患者外周血中CD8α+α+T細胞表達IFN-γ和TNF-α的水平均明顯高于健康對照組

CD8+T細胞起源于骨髓，在胸腺內發(fā)育成熟，成熟后隨著淋巴循環(huán)到達全身各處，外周CD8+T細胞主要分布在脾臟、扁桃體和淋巴結等器官中［9］。T細胞表面CD8分子主要參與TCR的親和力調控。功能性CD8分子是由CD8α鏈和CD8β鏈形成的異源或同源二聚體，據此CD8+T細胞可分為CD8α+α+T細胞與CD8α+β+T細胞兩個亞型，且其功能有著顯著的差別［5］。CD8αβ能夠提高TCR的親合力，CD8αα可以降低TCR的抗原敏感性［5］。以往，學者們普遍認為，CD8α+α+T細胞具有負向免疫調控作用。然而，近期 Zhu 等［10］發(fā)現，CD8α+α+T 細胞長期定位在生殖器皮膚和黏膜內，發(fā)揮著免疫監(jiān)控功能，抑制病毒感染，對生殖器皰疹的復發(fā)發(fā)揮著重要的抑制作用；皰疹皮損愈合后，皮損局部CD8α+β+T細胞被完全清除，而CD8α+α+T細胞可在局部持續(xù)存在。

以往研究認為，銀屑病炎癥因子主要來源于CD4+輔助性 T 細胞（Th）［11-12］。近年研究發(fā)現，CD8+T細胞在銀屑病的發(fā)病中也發(fā)揮著重要的作用［13］，銀屑病患者皮損中可見CD8+T細胞浸潤［4］。銀屑病中CD8+T 細胞可通過分泌 IL-17、IL-21、IFN-γ 及TNF-α等細胞因子參與疾病的發(fā)病［14］。但是哪一類CD8+T細胞亞群在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮致病作用及其機制尚不清楚。

本研究發(fā)現，與健康人相比，銀屑病患者外周血中CD8α+α+T細胞比例明顯升高。此外，銀屑病患者CD8α+α+T細胞表達IFN-γ和TNF-α水平均明顯增高。該研究發(fā)現，CD8α+α+T細胞亞群通過分泌炎癥因子參與銀屑病發(fā)病，明確了CD8+T細胞亞群在銀屑病發(fā)病中作用。此外，該研究發(fā)現了銀屑病患者CD8α+α+T細胞的促炎作用，拓展并完善了對CD8+T細胞亞群及其功能的認識，為CD8+T細胞在自身免疫病及炎癥性疾病中的作用研究提供了新思路。

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第六屆全國深部真菌感染學術會議征文通知

全國深部真菌感染學術會議是由感染、呼吸、血液、皮膚、重癥醫(yī)學等多學科權威專家于2005年共同組織發(fā)起的，旨在為深部真菌研究人員提供一個溝通和交流的平臺，真正實現多學科協作與交流。第六屆會議定于2015年11月27－29日在安徽合肥召開，由國家衛(wèi)生計生委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心主辦。會議將邀請國內外知名專家就深部真菌感染的流行病學、臨床診治以及病案討論等最新研究成果展開交流與討論。同時歡迎從事相關研究的學者踴躍投稿參會。

征文內容：①深部真菌感染的病原學、流行病學、組織病理學、發(fā)病機制等基礎研究；②深部真菌感染的診斷學，包括實驗室診斷和影像學診斷；③深部真菌感染的臨床診治研究；④抗真菌藥物研究；⑤典型病例討論。

征文要求：投稿請?zhí)峁┱撐恼瑧ㄑ芯磕康摹⒉牧虾头椒ā⒔Y果、結論，字數400～800字。截稿日期：2015年9月30日。

論文評審：組委會邀請權威專家對論文進行評審，優(yōu)秀論文將頒發(fā)獲獎證書并給予一定的獎勵，部分優(yōu)秀論文可推薦至相關專業(yè)雜志發(fā)表。

會議注冊及學分：參會代表可授予國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目Ⅰ類學分10分。

投稿郵箱：sbzj2015@163.com，官方微信號：fungalinfection，聯系人：馬立英，電話/傳真：010－65041809/65005315。

CD8α+α+T cells in lesions and peripheral blood of patients with psoriasis

Sun Xiuwen,Li Bing,Zhang Weigang,Dang Erle,Jin Liang,Wang Gang.Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Wang Gang,Email:xjwgang@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the distribution and proportion of CD8α+α+T cells in lesions and peripheral blood of patients with psoriasis,and to assess their roles in the pathogenesis of psoriasis.Methods An immunofluorescence assay was performed to observe the distribution of CD8α+α+T cells in lesions of 5 patients with progressive psoriasis vulgaris and normal skin of 5 healthy human controls.Flow cytometry was conducted to determine the proportion ofCD8α+α+T cells,and to measure the expressions of interferon（IFN）-γ and tumor necrosis factor（TNF）-α in peripheral blood from 10 patients with progressive psoriasis vulgaris and 8 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest with GraphPad Prism software.ResultsA massive infiltrate mainly composed of CD8α+α+T cells but not CD8α+β+T cells was observed in the upper dermis of lesions from the 5 patients with psoriasis,while there was no infiltrate of CD8α+β+or CD8α+α+T cells in the normal skin of 5 healthy human controls.Flow cytometry revealed that the proportion of CD8α+α+T cells was significantly higher in peripheral blood from 10 patients with psoriasis than in that from 8 healthy human controls（26.47%±12.99%vs.9.12%±4.80%,t=3.96,P＜0.001）.Significant differences were also noted between the psoriatic patients and healthy human controls in the percentage of cells secreting IFN-γ（47.36% ±19.38%vs.13.44% ±9.21%,t=4.54,P＜0.001）and cells secreting TNF-α （54.14% ±21.14%vs.34.03% ± 17.22%,t=2.17,P ＜ 0.05）in peripheral blood CD8α+α+T cells.ConclusionsBoth the distribution and proportion of CD8α+α+T cells are increased in lesions and peripheral blood from patients with psoriasis,suggesting that CD8α+α+T cells may be the main subgroup of CD8+T cells that contribute to the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;CD8-positive T-lymphocytes;Interferon-gamma;Tumor necrosis factor-alpha

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.003

國家自然科學基金（81171494）

710032西安，第四軍醫(yī)大學西京皮膚醫(yī)院

王剛，Email：xjwgang@fmmu.edu.cn

2014-06-19）

（本文編輯：顏艷）