攜人乳頭瘤病毒6型全基因細胞的組織工程皮片培養的初步研究

王飛 郭宗科 張紅葉 潘永正 董正邦 陳梅 單瑩 嚴翹 余衛平

攜人乳頭瘤病毒6型全基因細胞的組織工程皮片培養的初步研究

王飛 郭宗科 張紅葉 潘永正 董正邦 陳梅 單瑩 嚴翹 余衛平

目的 建立人乳頭瘤病毒6型（HPV6）全基因體外組織工程皮片培養模型，為進一步研究HPV病毒周期奠定基礎。方法 用電轉的方法，將HPV6全長線性基因和質粒pEGFP-▲EGFP共轉染hTERT細胞，G418抗性篩選，Southern印跡法檢測細胞內HPV病毒含量；3T3 J2滋養層細胞、I型鼠尾膠原與含HPV6基因的hTERT細胞（HPV6.hTERT細胞）混合后，在金屬網格上共同培養，逐漸形成皮片樣結構。HE染色和免疫組化檢測皮片的組織結構和HPV6 L1蛋白表達，電鏡檢查皮片病毒顆粒。結果 HPV6全長線性基因成功轉入hTERT細胞，Southern印跡法檢測細胞內含HPV6 DNA；與3T3 J2細胞、I型鼠尾膠原共同培養的HPV6.hTERT細胞隨時間而增殖分化，逐漸形成具有疣狀增生外觀的皮片。皮片HE染色顯示，培養7 d即出現典型的皮膚分層結構；培養21 d皮片可見明顯乳頭瘤樣增生、空泡細胞、角化過度、角化不全等HPV感染組織病理表現。免疫組化顯示皮片上部有HPV6 L1蛋白表達。電鏡檢測發現皮片中存在HPV6病毒顆粒。結論 HPV6全基因組織工程皮片培養模型為HPV的生物學研究提供了一個平臺，但在應用上有一定的局限性。

人乳頭狀瘤病毒6；培養技術；病理學；病毒包膜蛋白質類；皮片培養

人乳頭瘤病毒（HPV）是小DNA病毒，有嚴格的 嗜人類上皮組織特性；在體內HPV感染上皮細胞后，隨上皮細胞的分化而復制。HPV生活周期與人上皮細胞分化密切相關，故難以用常規、單層細胞培養來繁殖，只能用上皮組織進行培養［1-2］。目前，低危型HPV在體外培養相對困難，給HPV致病機制的研究及治療藥物的研發帶來了困難。本研究建立攜帶HPV6型全基因的hTERT細胞，該細胞與3T3 J2滋養層細胞、鼠膠原共同培養，形成具有疣狀增生外觀的皮片。檢測皮片細胞層L1蛋白的表達和是否存在病毒顆粒，明確HPV6型全基因體外組織工程皮片培養模型是否成功建立。

作者單位：210009南京，東南大學附屬中大醫院皮膚科（王飛、張紅葉、潘永正、董正邦、陳梅、單瑩、嚴翹），整形科（郭宗科）；東南大學醫學院病理生理學系（余衛平）

材料與方法

一、材料

1.質粒和細胞：hTERT細胞來自美國ATCC細胞庫（ATCC Number：CRL-4000）；3T3 J2 滋養層細胞，由本實驗室傳代維持生長；攜帶HPV6全長基因的質粒pSP65-HPV6，由美國Craig Meyers教授饋贈；質粒pEGFP-1，為美國Clontech公司產品；大腸桿菌DH5a由本室保存。

2.抗體及細胞培養試劑：表皮生長因子、胎牛血清（FBS）（美國 Sigma公司）；鼠尾膠原 I型、表皮生長因子（EGF）（美國BD Bioscience公司）；內切酶KpnI、BsrG I、BamH1、EcoRI、T4DNA 連接酶 （英國NEB公司）；Lipofectamine 2000轉染試劑盒（美國Invitrog公司）；質粒提取試劑盒（美國Qiagen公司）；硝酸纖維素膜（美國Bio-Rad公司）；抗HPV 6 L1單克隆抗體（美國Meridian life science公司）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（武漢百翌博科技有限公司）；探針Read to Go DNA標記試劑盒純化柱（Probe Quant G50 microcolumn）（美國 Amersham Pharmacia公司）。

3.主要設備：CO2細胞培養箱（德國Hera Cell公司），GelDoc1000凝膠成像系統和電轉儀（美國Bio-Rad公司）。

二、方法

（一）攜HPV6全基因細胞株的建立：

1.質粒pEGFP-▲EGFP的構建：用KpnI和BsrG I雙酶切質粒pEGFP-1，切除EGFP片段，補平并用T4 DNA連接酶連接成環后，轉入感受態細胞DH5a，卡那霉素抗性篩選陽性克??；用質粒試劑盒提取去掉EGFP段的質粒pEGFP-▲EGFP，TE緩沖液保存。

2.攜HPV6全基因hTERT細胞的培養：①30 μg含HPV6型全基因的質粒pSP65-HPV6，用EcoR I酶切得到線狀HPV6型全基因，酚/氯仿法回收與純化，25 μl TE緩沖液保存；②線狀HPV6基因和pEGFP-▲EGFP質粒共轉入hTERT細胞：10 μl TE緩沖液（7.5 μg線狀HPV6）、10 μl（1 μg）pEGFP-▲EGFP質粒、4.25 μl（42.5 μg）鮭魚精子DNA、275 μl hTERT細胞（5×106）輕輕混勻，電轉，細胞轉移至10 cm培養皿中，375 mg/L G418篩選，細胞超過80%融合時（13～15），傳代，鑒定。

3.hTERT細胞內HPV6基因的檢測：①0.25%胰酶-EDTA消化上述轉染后80%融合的貼壁生長hTERT細胞，離心、沉淀，液氮中反復凍融；按組織DNA提取試劑盒操作步驟提取細胞內HPV6 DNA；②Southern印跡法檢測細胞內HPV6基因，DNA探針的制備按Meyers等［3］制備HPV探針的方法。pSP65-HPV6，EcoR I酶切，0.8%凝膠電泳，純化得線狀HPV6型全基因。參照Read to Go DNA標記試劑盒32P標記探針，純化柱純化；按《分子克隆操作指南進行》雜交［4］。

（二）攜HPV6型全基因組織工程皮片的培養：

1.攜HPV6型全基因皮片的培養：①胰酶消化低代3T3 J2細胞，與Ⅰ型鼠尾凝膠混勻，種于6孔培養板上，每孔6.25×105細胞和2 mlⅠ型鼠尾凝膠，37℃5%CO2培養2 h；②每孔加入1.0×106HPV6.hTERT細胞，培養過夜；③將培養物轉移到帶網眼的金屬培養網格表面，培養基不超過金屬培養網孔，每48小時換培養基。

2.攜HPV6型全基因的hTERT細胞組織工程皮片病理、免疫組化和電鏡觀察：①普通病理：收集不同培養時間皮片，HE染色，觀察是否生長成皮膚基本結構、空泡細胞是否存在；②免疫組化：不同培養時間皮片，冰凍組織切片，PBS洗3 min，10%FBS封閉15 min后與一抗反應，抗體為HPV6 L1單抗，然后與生物素標記的二抗室溫下反應；③電鏡：培養21 d的皮片修切成3×3 mm2的組織塊，JEM-1200透射電鏡觀察。

結 果

1.轉染后的hTERT細胞內HPV6 DNA的檢測：HPV6轉染hTERT細胞后提取其DNA，分別取2.5μg、5 μg、7.5 μg，BamH1 酶切，電泳、雜交、曝光。酶切前見3條DNA帶，分別為超螺旋、開環和線狀結構，酶切后8 000 bp左右單一條帶，表明HPV6全基因成功轉染hTERT細胞，攜HPV6全基因的細胞HPV6.hTERT成功建立，見圖1。酶切部位在HPV6基因序列2602-2607。

圖1 Southern印跡法檢測轉染后hTERT細胞內HPV6 DNA 1、3、5 酶切前分別為 7.5 μg、2.5 μg、5.0 μg DNA；2、4、6 酶切后，8 000 bp位置出現線狀條帶

2.HPV 6型全基因體外組織工程皮片培養不同時段大體形態觀察：觀察培養不同時間皮片形態、顏色的變化。發現隨培養時間延長，皮片由表面光滑的粉紅色（主要是培養基的顏色），顏色逐漸變淡，變成表面粗糙（培養第7天后）、疣狀增生的角化性物質（培養21 d）。見圖2。

圖2 HPV6型全基因體外組織工程皮片培養不同時段大體形態 2A：第0天，表面光滑；2B：第7天，有細胞長出；2C：第14天，角質樣物質形成；2D：第21天，明顯疣狀增生

3.HPV 6全基因體外組織工程皮片培養不同時段組織結構觀察：角化過度和空泡細胞是HPV感染特征性病理改變。在皮片培養7、14、21 d，HE染色和免疫組化檢查，觀察皮膚結構、空泡細胞和HPV蛋白的表達。發現隨皮片培養時間延長，細胞增生，出現角化過度、分層結構和空泡細胞，免疫組化發現HPV L1蛋白，提示皮片有HPV病毒感染。見圖 3，4。

4.培養組織工程皮片的病毒顆粒檢測：HPV病毒隨皮片細胞分化而復制，在培養21 d的皮片，細胞核內見明顯病毒顆粒。見圖5。

討 論

在體內HPV感染上皮細胞后，隨上皮細胞的分化而復制，感染了HPV的上皮細胞分化增殖形成具有疣狀增生外觀的組織，該組織具有棘細胞層、顆粒層、角質層等上皮結構，組織病理顯示假上皮瘤樣增生、角化過度和角化不全，顆粒層和棘細胞層見空泡細胞。含有大量具有感染性的HPV病毒顆粒，其中顆粒層和角質層病毒含量最高［5］。

圖3 HPV6型全基因體外組織工程皮片培養不同時段組織病理（HE×100） 3A：第7天，3～4層上皮細胞；3B：第14天，6～8層上皮細胞；3C：第21天，10～11層上皮細胞，見明顯角化過度，部分空泡細胞

圖4 HPV6型全基因體外組織工程皮片培養不同時段免疫病理（HE×100） 4A：第7天，未見L1蛋白表達；4B：第14天，未見L1蛋白表達；4C：第21天，L1染色陽性，近角質層較多棕色顆粒

圖5 病毒透視電鏡（5A：TEM×50 000） 箭頭所指為細胞內HPV6病毒顆粒，5B、5C分別是局部放大

Asselineau與Prunieras在1984年首次提出三維上皮細胞培養模型［5-6］。2004年 Meyers等利用此模型，將HPV16全基因組分別通過電穿孔法轉入PHK，抗生素篩選后形成攜帶HPV全基因組的PHK，然后將其種植在真皮類似物表面。經過12～21 d，HPV陽性PHKs分層分化，形成的復層上皮組織出現空泡細胞及角化不全，上皮的表層L1衣殼蛋白呈陽性表達，含有感染性的病毒顆粒［7］。近年來很多人在Meyer研究基礎上改進實驗方法，嘗試體外培養不同型別的HPV天然病毒顆粒，多種HPV亞型，包括低危的HPV11，利用三維上皮培養模型，在體外復制成功［8-10］。低危型HPV在體外較高危型HPV難以培養，其原因是低危型HPV通常不能整合入宿主細胞的染色體，在宿主細胞里復制一代較高危型時間長，且復制較少［11］。

我們用改良的Meyers進行HPV6的體外培養。為了培養HPV，必須將HPV病毒全基因轉入角質形成細胞；病毒DNA隨細胞分化而復制，提高HPV轉染率和增加角質形成細胞傳代是重要一步。我們曾用來自包皮的原代角質形成細胞作為宿主細胞，將HPV6全長線性基因轉入其中，因原代細胞生命周期較短，轉染效率很低，培養細胞內難以檢測到病毒DNA。后比較多種細胞，發現永生化的角質形成細胞株hTERT細胞（含人端粒酶逆轉錄酶hTERT）是較好的 HPV6 宿主細胞［12］。采用電轉（而不是脂質體轉染）的方法將線性HPV全長線性基因轉入hTERT細胞，通過調整電轉參數來獲得最佳轉染率。研究發現低電流、長時間電轉可有效提高HPV基因轉入細胞的轉入率，電轉時間最長可到180 s；低代hTERT細胞電轉后有更低的死亡率且能較長時間傳代。

為了將成功轉染的細胞篩選出來，采用了G418抗性基因篩選的方法。在電轉HPV6全長線性基因的同時，將G418抗性基因pEGFP-▲EGFP，共同轉入hTERT細胞，使含HPV基因的hTERT細胞有抗G418的能力。質粒pEGFP-1為4 200 bp的真核表達載體，內含約800 bp表達綠色熒光蛋白（EGFP）的報告基因，因該報告基因在本研究中無意義，且小質粒有利于轉染效率的提高，故用內切酶切掉EGFP片段。G418梯度篩選，G418殺死未成功轉染HPV的hTERT細胞，含HPV的hTERT細胞分化繁殖、逐漸相互融合。檢測發現子代hTERT細胞內穩定富含HPV DNA，是永生化細胞，該細胞可用于HPV6體外培養模型的建立。本研究用Southern印跡分析，證實轉染細胞HPV質粒DNA的存在，用BamH1酶切，酶切前DNA3條帶，酶切后發現在8 000 bp處有明確條帶。

用改良的Meyers的方法，試圖建立HPV6體外組織工程皮片培養模型，但皮片病毒的生成很不穩定，分析認為轉染后皮片培養時間和培養基成分可能對病毒生成有影響。縮短轉染后的培養時間，電轉染后培養7 d左右，細胞融合為50%左右（不等到80%～90%融合），不進行傳代，就將含HPV6全基因的高活力hTERT細胞與3T3 J2滋養層細胞、Ⅰ型鼠膠原在特制金屬網格上混合培養；培養基換成角質形成細胞專門培養基，且多次加入表皮生長因子和某些金屬離子，常規液體培養基不超過金屬網格。培養18 d時，偶能發現HPV病毒顆粒和病毒蛋白。皮片培養隨時間推移，細胞增生分化，從單層細胞逐漸分化為8～10層細胞，見典型的表皮結構，大體形態出現不同的外觀，由表面光滑變成表面粗糙，培養21 d時，出現明顯角化外觀；培養5 d時，HE染色即見細胞分化為3層細胞，隨時間推移，細胞層數增多，角化明顯，出現基底層、棘細胞層、顆粒層、角質層，疣狀增生和特征性空泡細胞。21 d后，細胞角化更明顯，但細胞層數減少。

HPV6組織工程皮片培養模型為HPV的生物學研究提供了一個平臺，但制備周期長、操作復雜，條件要求高，病毒產生不穩定等，使其在應用上有一定的局限性。

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Preparation of tissue-engineered skin grafts with hTERT cells carrying human papillomavirus type 6 genomein vitro:a preliminary study

Wang Fei*,Guo Zongke,Zhang Hongye,Pan Yongzheng,Dong Zhengbang,Chen Mei,Shan Ying,Yan Qiao,Yu Weiping.*Department of Dermatology,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China

ObjectiveTo establish a model for preparation of tissue-engineered skin grafts with hTERT cells carrying human papillomavirus type 6 （HPV 6）genomein vitro,so as to lay a foundation for studying HPV life cycle.MethodsThe full-length linear HPV6 genome and plasmid pEGFP-▲EGFP were electrophoretically cotransferred into hTERT cells.After selection using G418 resistance,Southern blotting was performed to determine the viral load of HPV6 in transfected cells.3T3 J2 trophoblastic cells,type I rat-tail collagen and hTERT cells containing the full-length HPV6 genes （HPV6.hTERT cells）were mixed and cocultured on metal meshes to form skin graft-like structures.Hematoxylin and eosin（HE）staining was performed to observe the structure of formed skin grafts,an immunohistochemical assay to measure the expression of HPV6 L1 protein,and electron microscopy to observe virus particles in the skin grafts.ResultsThe linear HPV6 gene was successfully transferred into hTERT cells,and Southern blotting showed the presence of HPV6 DNA in the transferred hTERT cells.The HPV6.hTERT cells,which were cocultured with 3T3 J2 trophoblastic cells and type I rat-tail collagen,proliferated and differentiated over time,and gradually formed skin grafts giving the appearance of verrucous hyperplasia.HE staining showed that the cocultured HPV6.hTERT cells could form typical stratified structure of skin after 7 days of cultivation,and histopathologic features of HPV infection,including obvious papillomatous hyperplasia,presence of vesicular cells,hyperkeratosis and parakeratosis,could be observed after 21 days.The immunohistochemical assay showed the expression of HPV6 L1 protein in the upper portion of skin grafts,and electron microscopy revealed the presence of HPV6 virus particles in skin grafts.Conclusions The established model for preparation of tissue-engineered skin grafts using HPV 6 genome-carrying cells provides a basis for biological studies of HPV,but its application is limited to some degree.

Human papillomavirus 6;Culture techniques;Pathology;Viral envelope proteins;Raft culture

Wang Fei,Email:ffwangfei@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.006

江蘇省自然科學基金（BK2012748）；教育部留學回國人員科研啟動基金（20121707）；南京市科技發展項目（201104028）

王飛，Email：ffwangfei@163.com

2014-05-15）

（本文編輯：吳曉初）