整合素在瘢痕疙瘩間質干細胞中的表達研究

宋海峰 王文婷 劉濤 張衍國

整合素在瘢痕疙瘩間質干細胞中的表達研究

宋海峰 王文婷 劉濤 張衍國

目的 了解瘢痕疙瘩間質干細胞中整合素9種亞基mRNA和蛋白的表達。方法 以培養(yǎng)的瘢痕疙瘩間質干細胞為研究對象，以正常皮膚的間質干細胞為對照，運用實時定量PCR和Western印跡法分別檢測其mRNA和蛋白的表達情況。結果 實時定量PCR檢測結果表明，瘢痕疙瘩間質干細胞中整合素α2、α3、α5、αV、α10、α11、β1 mRNA 的表達水平與正常皮膚干細胞相比，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05），α8 mRNA的表達水平顯著低于正常皮膚干細胞，而β3 mRNA的表達水平則顯著增高（均P＜0.01）。Western印跡檢測表明，兩種干細胞α8和β3蛋白表達水平變化與其mRNA變化一致（P＜0.01）。結論 整合素α8和β3可能與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展有關，其組成的相應受體可能與瘢痕疙瘩的發(fā)病機制相關。

瘢痕疙瘩；間質干細胞；整合素β3；整合素α8

瘢痕疙瘩是皮膚細胞外基質分泌過度和降解減少，導致膠原等成分異常沉積所致的病理狀態(tài)，而具有自我更新和高度分化能力、作為發(fā)育早期中胚層來源的間質干細胞（MSC）已成為生物醫(yī)學領域的研究熱點。瘢痕疙瘩MSC的數(shù)量比正常皮膚組織多，但其作用尚不明確［1］。研究表明，瘢痕疙瘩的發(fā)病與局部的機械張力存在很大的關系［2］，而整合素是目前最受關注的機械牽拉感受器之一［3］，是一類廣泛分布于細胞表面的黏附分子受體，由非共價結合的α鏈和β鏈組成異二聚體。在哺乳動物中，目前已發(fā)現(xiàn)18種α亞基和8種β亞基，這些亞基通過不同組合構成至少24種成員的整合素家族［4］。我們參考文獻，選擇可能參與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展過程的 α2、α3、α5、αV、α8、α10、α11、β1、β3 共 9 種整合素亞基，檢測其在瘢痕疙瘩MSC中mRNA和蛋白的表達。

作者單位：710038西安，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科

資料與方法

1.對象及細胞來源：2012年12月至2013年12月，于第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科診斷為瘢痕疙瘩并接受手術治療的3例患者，其中男2例，女1例，年齡 18～31（23.7±6.7）歲，病程 4～9（6.7±2.5）年。瘢痕疙瘩的診斷參照 Darzi等［5］標準，入選標準還包括：患者均為初次就診，此前未接受過其他治療，無全身其他器質性疾病，病變部位均位于前胸及后背。手術切取標本后備用；同時參照Shih等［6］的相關研究選取距離瘢痕疙瘩至少2 cm以上的周邊正常皮膚作為對照。原代分離培養(yǎng)瘢痕疙瘩和周邊正常皮膚的MSC并鑒定［7］，傳至3～6代用于研究。本研究經(jīng)過第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

表1 整合素引物序列

2.主要試劑及儀器：無血清干細胞培養(yǎng)基（Cell Therapy Systems Stempro MSC SFM CTSTM，美國Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（美國Hyclon公司），RNAiso Plus、PrimeScriptTMReverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTMII（日本Takara公司），整合素α8、β3抗體（美國 Abcam公司），Western印跡配膠試劑盒、ECL發(fā)光液（上海碧云天生物技術有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），MJ Research Option 2實時定量PCR儀（美國MJ Research公司）。

3.MSC培養(yǎng)：試驗分為瘢痕疙瘩MSC（KDMSC）和周邊正常皮膚MSC（NS-MSC）兩組。將兩組細胞均接種于含0.1%的poly-D-賴氨酸的無血清干細胞培養(yǎng)基［含低糖DMEM∶Hams F12（1∶1），B27，抗生素，20 μg/L 表皮生長因子，10 μg/L 成纖維細胞生長因子2，10 μg/L白血病抑制因子］中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中以5%CO2飽和濕度條件孵育，每兩天換液1次，直到兩組細胞都達到80%以上融合后，倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗3次，加入適量RNAiso Plus裂解細胞，提取兩組細胞的總RNA，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.實時定量PCR檢測整合素各亞基mRNA表達：將提取的KD-MSC和NS-MSC總RNA通過PrimeScriptTMReverse Transcriptase反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。同時通過primer prime 5.0生物軟件設計整合素 α2、α3、α5、αV、α8、α10、α11、β1、β3 共9對引物，均由寶生物工程（大連）有限公司合成，各引物序列見表1。按照SYBR Premix Ex TaqTMII實時定量PCR試劑盒要求，將反轉錄產(chǎn)物cDNA作為模板進行兩步法PCR反應：95℃預變性30 s；循環(huán)時95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。β肌動蛋白作為內(nèi)參照。按照2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量。

5.Western印跡檢測整合素α8和β3蛋白的表達：根據(jù)實時定量PCR結果，選擇兩種MSC mRNA有差異表達的整合素α8和β3進行Western印跡檢測，待兩組細胞達到80%～90%融合時，倒掉培養(yǎng)液，加入含PMSF的細胞裂解液1 ml，冰上裂解30 min，12 000×g4℃離心5 min，取上清液分裝置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ砣?0 μl上清液，BCA法蛋白定量。調節(jié)每份樣品的濃度，以每孔20 μl體積上樣，樣品加入1/5體積的5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳。積層膠與分離膠分別為5%和10%。應用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)進行垂直電泳，待溴酚藍指示劑跑到分離膠底部，取下凝膠，用轉移緩沖液浸泡數(shù)分鐘，用蛋白濕轉移裝置將蛋白轉移到PVDF膜上，奶粉封閉后加入一抗4℃過夜，漂洗后1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗37℃孵育2 h，以β肌動蛋白為內(nèi)參照，ECL化學發(fā)光法顯影定影。

6.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 瘢痕疙瘩組與正常皮膚組間質干細胞中各整合素mRNA表達水平（2-△△Ct）

結 果

1.KD-MSC與NS-MSC中整合素各亞基mRNA表達情況：KD-MSC與NS-MSC中整合素受體亞基 mRNA 表達水平見表 2。α2、α3、α5、αV、α10、α11和β1 mRNA表達在兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而α8 mRNA表達降低（P＜0.01），β3 mRNA 表達增高（P＜0.001）。

2.KD-MSC與NS-MSC中整合素α8和β3蛋白表達：見圖1。KD-MSC中，α8的表達（0.47±0.05）明顯低于 NS-MSC（1.07 ± 0.13），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.35，P＜0.01）；β3的表達（1.37±0.15）高于 NS-MSC（0.62±0.04），差異有統(tǒng)計學意義（t=9.07，P＜ 0.01）。

圖1 瘢痕疙瘩與正常皮膚間質干細胞整合素α8和β3的Western印跡檢測結果

討 論

瘢痕疙瘩是遺傳易感性患者皮膚損傷后組織異常修復的結果，以成纖維細胞過度增殖和膠原等細胞外基質大量合成和沉積為組織學特點［8］。我們通過對臨床表現(xiàn)、組織病理及文獻分析發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩無深部組織侵襲性，具有不斷增生和中央趨于萎縮、增生的組織向皮膚的特定方向拓展的臨床特征。產(chǎn)生牽張力的方向是瘢痕疙瘩組織拓展方向，因此，我們推測牽張力的產(chǎn)生引發(fā)瘢痕疙瘩組織的持續(xù)增生，牽張力很可能在瘢痕疙瘩的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。而整合素作為黏附分子的一類，分布于細胞表面，參與完成多種細胞功能，如：介導細胞黏附、信號傳導、腫瘤的分化、轉移、細胞凋亡等。機械刺激可誘導整合素發(fā)生構象改變，從而改變整合素與細胞外基質配體及細胞骨架連接蛋白的親和力［9］。

本實驗以KD-MSC為研究對象，在檢測的9種整合素亞基中，只有α8和β3 mRNA及蛋白表達有差異，α8 的表達降低，而β3 的表達增高。Gerber等［10］對系統(tǒng)性硬化病的研究發(fā)現(xiàn)，從原纖維蛋白1（FBN1）突變的僵硬性皮膚綜合征小鼠真皮分離的細胞高表達活化結構的整合素β3，單劑量不足或徹底敲除整合素β3基因的僵硬性皮膚綜合征小鼠于3月齡時，皮膚僵硬、膠原沉積現(xiàn)象恢復正常；于5月齡時，部分小鼠出現(xiàn)灶性真皮和表皮增厚，提示整合素β3參與了纖維化過程。Balasubramanian等［11］發(fā)現(xiàn)，對于野生型小鼠，整合素β3基因敲除型小鼠的心肌層間質纖維連接蛋白和膠原顯著降低，β3介導的Pyk2信號通路在張力相關的心肌纖維化中發(fā)揮關鍵作用，表明牽張力很可能通過整合素β3參與組織纖維化過程。Soldi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，αVβ3 介導的內(nèi)皮細胞與細胞外基質之間的黏附對血管內(nèi)皮生長因子受體2的激活至關重要，αVβ3協(xié)同強化了血管內(nèi)皮生長因子A165引起的血管內(nèi)皮生長因子受體2的磷酸化及促有絲分裂作用，參與了血管內(nèi)皮生長因子A165對血管內(nèi)皮生長因子受體2的完全激活，從而促進血管的生成。我們推測，β3在瘢痕疙瘩的形成中可能發(fā)揮著作用。

一般情況下，整合素α8和β1組成α8β1的異二聚體，它是纖維連接蛋白、玻璃黏連蛋白、腱糖蛋白C、骨橋蛋白、腎連蛋白和原纖維蛋白1的受體。整合素α8在瘢痕中的研究尚未見報道，但在其他組織中的研究卻存在爭議，可能α8的表達存在組織特異性。Hartner等［13］研究發(fā)現(xiàn)，敲除整合素 α8 鏈的小鼠比野生型小鼠更容易造成腎小管間質的損傷，因此，在單側輸尿管梗阻中，α8與其配體的相互作用似乎并不能促進腎小管間質纖維化的發(fā)生發(fā)展。而 Bouzeghrane 等［14］在研究整合素 α8β1 在小鼠的心肌組織的定位和表達時發(fā)現(xiàn)，其正向調節(jié)肌成纖維細胞和心內(nèi)膜的纖維化。本研究在KD-MSC中發(fā)現(xiàn)α8亞基的表達降低，可能α8在瘢痕疙瘩中負反饋調節(jié)瘢痕組織的纖維化，具體的作用機制尚需研究。

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全國皮膚病理培訓班及蘇魯浙病理年會通知

中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所定于2015年10月在南京舉辦國家級繼續(xù)醫(yī)學教育項目全國皮膚病理培訓班，內(nèi)容如下。

全國皮膚病理初級培訓班：2015年10月17-20日。主要講授皮膚病理基礎知識，從臨床角度著手了解常見炎癥性皮膚病和皮膚腫瘤的組織病理特點，內(nèi)容包括淺表血管周圍浸潤性皮炎、肉芽腫、血管炎、水皰病、脂膜炎、表皮腫瘤、黑素瘤和淋巴瘤的組織病理，并配合大量閱片和臨床病例解析，是往皮膚病理方向發(fā)展的入門培訓，并幫助皮膚科醫(yī)生提高臨床診斷能力。結業(yè)者授予國家繼續(xù)醫(yī)學教育學分8分。

全國皮膚病理高級培訓班：2015年10月21-23日，重點講授皮膚淋巴瘤和附屬器腫瘤的組織病理診斷和鑒別診斷，并對歷屆皮膚病理年會的疑難病例進行回顧和討論。歡迎學員自帶病例和組織切片，有知名專家為你答疑解惑。結業(yè)者授予國家繼續(xù)醫(yī)學教育學分6分。

蘇魯浙皮膚病理年會：2015年10月24-25日在南京召開。對疑難皮膚病的病理診斷問題進行討論和交流，歡迎相關單位送片參會，會議授予Ⅰ類省級繼續(xù)教育學分。

咨詢和聯(lián)系方式：210042，南京市玄武區(qū)蔣王廟街12號皮膚病研究所病理科姜祎群、邵雪寶，電話：025－85478016，Email：pysblk@sina.cn或yiqunjiang@qq.com。

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Expressions of integrin in human keloid-derived mesenchymal stem cells

Song Haifeng,Wang Wenting,Liu Tao,Zhang Yanguo.
Department of Dermatology,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710038,China Corresponding authors:Liu Tao,Email:Morlab2@fmmu.edu.cn;Zhang Yanguo,Email:zhangya3341@163.com

Objective To investigate the mRNA and protein expressions of nine integrin subunits in human keloid-derived mesenchymal stem cells （KD-MSCs）.Methods Cultured KD-MSCs and normal skin-derived MSCs（NS-MSCs）served as the experiment group and control group respectively.Real-time quantitative PCR and Western blot were performed to measure the mRNA and protein expressions of nine integrin subunits in the two groups respectively.Statistical analysis was carried out byttest.Results Real-time quantitative PCR showed no significant difference in the mRNA expression level of any of the integrin units α2,α3,α5,αV,α10,α11 or β1 between KD-MSCs and NS-MSCs（allP ＞ 0.05）.The mRNA expression level of integrin α8 was decreased,while that of integrin β3 was significantly increased in KD-MSCs compared with NS-MSCs（bothP＜0.01）.Western blot revealed that the changes in protein expression levels of integrin units α8 and β3 were consistent with those in their mRNA expression levels in both KDMSCs and NS-MSCs （bothP ＜ 0.01）.ConclusionsIntegrin units α8 and β3 may be involved in the occurrence and development of keloid,and the receptors made up of them may play important roles in the pathogenesis of keloid.

Keloid;Mesenchymal stem cells;Integrin beta3;Integrin alpha8

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.005

國家自然科學基金（30900772）

劉濤，Email：Morlab2@fmmu.edu.cn；張衍國，Email：zhangya3341@163.com

2014-09-16）

（本文編輯：吳曉初）