沙眼衣原體感染血清學篩查候選蛋白組合的優化

高西波 肖萌 張新美 馬璟玥 王敬 劉全忠 齊蔓莉

沙眼衣原體感染血清學篩查候選蛋白組合的優化

高西波 肖萌 張新美 馬璟玥 王敬 劉全忠 齊蔓莉

目的 優化適用于沙眼衣原體感染血清學篩查的候選抗原蛋白組合。方法 收集天津醫科大學總醫院性病門診經膠體金法檢測沙眼衣原體感染者的血清和泌尿生殖道分泌物拭子各50份，膠體金法檢測沙眼衣原體未感染者的血清和泌尿生殖道分泌物拭子各30份，此30份血清微量免疫熒光（MIF）法檢測為陰性。以沙眼衣原體蛋白 Hsp60 和 MOMP 為參照，選擇沙眼衣原體 Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813、IncA共8種免疫優勢蛋白為抗原，檢測血清中的相應抗體，將該結果與血清MIF檢測和泌尿生殖道分泌物沙眼衣原體細胞培養兩種傳統金標準作比較，確定具有最高敏感性和特異性的抗原蛋白組合。結果 50份膠體金法陽性標本中，MIF檢測陽性44份，陰性6份；細胞培養陽性14份，陰性36份。沙眼衣原體Pgp3、CT694和CT875這3種免疫優勢蛋白組合的血清學實驗結果與MIF陽性符合率達到97.73%（43/44）。30份膠體金法檢測沙眼衣原體陰性標本中，30份血清標本經MIF檢測全為陰性，也未檢出上述3種蛋白抗體。結論 Pgp3、CT694與CT875免疫優勢蛋白組合用于沙眼衣原體感染的血清學初篩具有很好的敏感性和特異性，且操作簡單，易于推廣。

沙眼衣原體；免疫顯性表位；血清學試驗；熒光免疫測定

作者單位：300052天津醫科大學總醫院皮膚性病科

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,C.t）所致的泌尿生殖道感染已成為目前世界范圍內最常見的性傳播疾病，其感染引起的盆腔炎、異位妊娠、輸卵管不孕及流產死胎等并發癥受到越來越多的關注［1］。C.t感染者常因癥狀隱匿［2］而成為傳染源，是導致C.t廣泛流行的主要原因。為了尋找適合于C.t感染血清學篩查的抗原蛋白，我們收集臨床經膠體金法檢測C.t感染者和未感染者的血清及泌尿生殖道分泌物拭子，選擇近年來報道的8種C.t免疫優勢蛋白：Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813 和IncA［3］，以 MOMP 和 Hsp60 為參照蛋白，檢測血清中相應抗體，與血清微量免疫熒光（MIF）檢測傳統金標準作比較，尋找C.t免疫優勢蛋白最佳組合，為開展C.t感染的血清學篩查提供依據。

材料和方法

一、臨床標本選擇

收集2013年3-12月天津醫科大學總醫院性病門診就診者泌尿生殖道分泌物拭子經C.t膠體金試劑盒檢測陽性定為C.t感染者，陰性定為C.t未感染者。收集感染者泌尿生殖道拭子50份和未感染者泌尿生殖道拭子30份，同時收集相應感染者血清50份和未感染者血清30份，此30份陰性血清MIF檢測同為陰性。本研究經天津醫科大學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、試劑

牛血清白蛋白（BSA）、大腸桿菌感受態BL-21（北京鼎國生物技術有限公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人IgG、羊抗鼠IgG抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的綠色熒光羊抗鼠IgG、四甲基羅丹明（Cy3）標記的紅色熒光羊抗人IgG抗體（北京奧博森生物技術有限公司），單組份顯色劑2,2-氮基-二銨鹽（ABTS）（上海生唐生物科技有限公司），谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）標記的磁珠（美國GenScript公司），谷胱甘肽預包被的ELISA 96孔板（美國 Pierce公司），10種免疫優勢蛋白的pGEX-6P-2載體重組質粒與GST空質粒、純化的C.t原體 （EB）、Pgp3、主要外膜蛋白（MOMP）和OmcBc（抗外膜蛋白復合物B蛋白C端肽）的小鼠源性單克隆抗體由美國德克薩斯安東尼奧健康科學中心微生物免疫學系鐘光明教授提供，DNA質粒提取試劑盒及DNA Maker 2000（北京天根生化科技有限公司），PCR擴增儀（德國Biometra公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），重組質粒序列測定由北京賽諾基因有限公司完成。

三、C.t免疫優勢蛋白的純化和血清抗體檢測

1.重組質粒的轉化及融合蛋白的表達、純化和鑒定［3-4］：重組質粒 pGEX-6P-2-Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813、MOMP、IncA、Hsp60和空質粒GST轉入E.coli BL-21感受態細菌，接種于氨芐西林瓊脂糖平板，挑取單菌落增殖培養，誘導表達。對融合蛋白和空質粒GST蛋白進行蛋白純化和鑒定。

2.包被酶標板：取制備好的融合蛋白裂解液與磷酸鹽緩沖液（PBS）3∶7混合，加入谷胱甘肽預包被的ELISA 96孔酶標板，4℃過夜。PBS洗滌酶標板，2.5%BSA常溫封閉1 h。每個蛋白均設1個復孔，每個酶標板設2個陽性對照孔，分別包被Pgp3和OmcBc蛋白，以其單克隆抗體作為一抗。

3.血清的處理：待測血清分別與空質粒誘導表達的蛋白裂解液和1%BSA按照1∶30∶250的比例混合后常溫振蕩2 h，向ELISA酶標板中加上述C.t感染者血清作為一抗，用含Tween-200的PBS（PBST）洗滌后加入HRP標記的羊抗人IgG作二抗，37℃放置30 min，或常溫（18～25℃）放置1 h后，PBS洗滌3次，蒸餾水洗滌1次。每孔加ABTS 100 μl，顯色30 min。酶標儀讀取吸光度A405值。

4.結果判斷［3-4］：計算各份血清 Pgp3、CPAF、CT143、CT101、CT694、CT875、CT813、MOMP、IncA、Hsp60抗體孔A值的標準差（s）。若A值大于自身陰性對照孔A+2s則判斷為陽性，否則為陰性。

四、MIF檢測血清抗C.t特異性IgG抗體［5］

純化的EB用PBS以1∶100比例稀釋，按照每抗原10 μl滴在高壓滅菌后的圓形蓋玻片上，自然干燥后用1%多聚甲醛固定。自然晾干后加一抗，本步驟用到兩種一抗，先把MOMP單抗用PBS稀釋后取8μl覆蓋在C.t斑點抗原上，濕盒中37℃溫育1h，然后取PBS稀釋過的C.t感染者的血清8 μl再次覆蓋于C.t斑點抗原上，放入濕盒中37℃溫育1 h。PBS洗滌3次，用蒸餾水洗滌1次自然晾干，同時加兩種二抗，FITC標記（綠色熒光）的羊抗鼠IgG抗體稀釋液和Cy3標記（紅色熒光）的羊抗人IgG抗體稀釋液各10 μl，放入濕盒中37℃溫育1 h，PBS和蒸餾水分別洗滌3次后自然晾干。封片，避光干燥，4℃暗盒保存。熒光顯微鏡油鏡觀察，每視野中重合的綠色和紅色熒光亮點＞10個判斷為陽性。

五、聚合酶鏈反應（PCR）［6-8］

取50份感染者血清中MIF法檢測C.t陰性的6份血清標本所對應的泌尿生殖道分泌物標本，提取C.t質粒，獲取基因組DNA存放于-20℃備用。針對C.t內源性質粒序列的1 368～1 884位堿基設計引物，上游 5′-GGACAAATCGTATCTCGG-3′；下游5′-GAAACCAACTCTACGCTG-3′，預擴增片段長度517 bp。PCR 擴增反應體系（10 μl）：上下游引物各0.5 μl，終濃度均為 0.3 μmol/L；2 倍 Taq PCR Master Mix 5 μl，終濃度為 1 倍；模板 DNA 2 μl，終質量濃度為100～200 ng/L；加雙蒸水補足至總體積10 μl。擴增條件：94℃預變性 3 min，94℃變性 45 s，52℃退火45 s，72℃延伸50 s，共35個循環，最后延伸5 min。取5 μl PCR產物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統下觀察結果。

結 果

一、融合蛋白的純化與鑒定

GST Magbeads 純化后的 GST-Pgp3、GSTCPAF、GST-CT143、GST-CT101、GST-CT694、GSTCT875、GST-CT813、GST-MOMP、GST-IncA、GSTHsp60和空質粒表達的GST蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳和考馬斯亮藍染色，均可以看到清晰的目的條帶，見圖1。

二、血清中10種重組C.t蛋白的抗體檢出情況

50份C.t感染者血清中，Pgp3抗體陽性44份（88%），CPAF抗體陽性38份（76%），CT143抗體陽性37份（74%），CT101抗體陽性36份（72%），CT694抗體陽性 33份（66%），CT875抗體陽性 31份（62%），CT813抗體陽性30份（60%），MOMP抗體陽性26份（52%），IncA抗體陽性24份（48%），HSP60抗體陽性17份（34%）。30份C.t未感染者血清中10種重組C.t蛋白的抗體陽性檢出情況:CT143抗體陽性8份（26.7%）、CT101抗體陽性5份（16.7%），其余8種抗體均未檢出。

三、MIF和PCR檢測結果

50份C.t感染者血清中，MIF檢測陽性44份（88%），陰性6份（12%）；MIF法檢測C.t陰性的6份血清所對應的泌尿生殖道分泌物標本經PCR檢測全為陽性。30份C.t未感染者血清MIF檢測均為陰性，未進行PCR檢測。見圖2。

圖1 11種融合沙眼衣原體蛋白純化后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE） 每 張電泳圖中的第1條帶均為標準參照物，第2、3條帶為目的蛋白。圖中數據為相對分子質量

四、血清學篩查抗原蛋白組合的優化

比對血清抗體檢測和MIF檢測結果，選擇C.t特異性蛋白和優勢蛋白中檢測陽性率最高的蛋白，即Pgp3、CT694和CT875（注：CPAF和CT143不是C.t特異性蛋白）。這3種蛋白的抗體檢測結果陽性率與MIF檢測結果陽性的符合率達到97.73%（43/44）。以MIF法為標準，3種蛋白組合抗體檢測的特異度和敏感度分別為100%（30/30）和97.72%（43/44）。50份感染者血清經MIF法檢測為陰性的6份標本對應的泌尿生殖道分泌物標本C.t質粒PCR擴增結果均為陽性，這6份陰性標本均能檢出上述3種蛋白的1～3種抗體。

討 論

開展C.t感染的篩查對于早期發現并治療無癥狀C.t感染者，控制C.t的傳播和流行具有非常重要的意義。傳統認為MIF法檢測C.t是C.t感染血清學診斷的金標準，具有敏感性高和特異性好的優勢；但該法操作繁瑣，抗原制備復雜，判斷結果時，在一定程度上受主觀因素影響，抗體熒光易淬滅，不適于臨床常規開展，更不適于檢測大量標本［9］。C.t細胞培養法是檢測感染局部存在活C.t的金標準，該方法陽性率低，操作復雜，耗時長，需要較為昂貴的細胞培養箱，成本高，因此也不適合常規開展，更難以進行大規模篩查。

血清C.t抗體檢測［10］目前尚不能用于臨床C.t感染的診斷，但該方法成本低廉、操作簡便、快速獲得結果的優勢使其可能用于C.t感染的初篩。為了尋找適合于篩查C.t感染的抗原蛋白，提高抗體篩查結果的敏感性和特異性，我們選擇8種C.t免疫優勢蛋白，并將抗體檢測結果與傳統的MIF法結果比對，結果顯示，Pgp3、CT694與CT875的抗原組合和MIF陽性結果一致率達到97.73%。膠體金法檢測陽性而MIF檢測陰性的6份血清中可以檢測出1～3種上述抗原蛋白的抗體，同時分泌物衣原體核酸檢測陽性，支持該6份血清實為陽性標本。因此以該組合作為抗原檢測血清抗體具有很好的敏感性。同時該3種蛋白是 C.t特異性蛋白［5，11-12］，與泌尿生殖道細菌無交叉反應，能夠保證抗體檢測的特異性。在30份MIF法和膠體金法陰性標本中未檢出上述3種蛋白的抗體。

血清抗C.t蛋白抗體檢測陽性只能考慮血樣提供者很可能存在C.t感染，確診還需要采集泌尿生殖道分泌物標本進行免疫熒光、金標法或其他目前可用方法進一步檢測。

圖2 膠體金法檢測沙眼衣原體陽性、微量免疫熒光法檢測陰性的血清標本所對應的泌尿生殖道分泌物標本PCR產物瓊脂糖凝膠電泳 1：標準參照物；2：陰性對照標本，無目的條帶；3：陽性標本，目的條帶為517 bp

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征文截稿時間：2016年1月31日。

評選與獎勵：征文活動結束后，邀請皮膚科專家進行論文評審并頒發獎品。

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投稿方式：請將征文word電子版發至jiangli0828@163.com郵箱，主題標明“益賽普征文”。

上海中信國健藥業股份有限公司有權使用應征稿件，并對本次活動擁有最終解釋權。

Optimization of immunodominant protein combinations for serological screening forChlamydia trachomatis infection

Gao Xibo,Xiao Meng,Zhang Xinmei,Ma Jingyue,
Wang Jing,Liu Quanzhong,Qi Manli.Department of Dermatovenereology,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China

Objective To optimize immunodominant protein combinations for serological screening for Chlamydia trachomatis （Ct）infection.Methods Both serum and genital swab samples were collected from 50 patients with Ct infection confirmed by colloidal gold immunochromatographic assay （GICA）,and 30 GICA-negative clients without Ct infection at a sexually transmitted disease（STD）clinic in Tianjin Medical University General Hospital.The 30 serum samples from GICA-negative clients were also negative for microimmunofluorescence （MIF）assay.Eight Ct immunodominant proteins,including Pgp3,CPAF,CT143,CT101,CT694,CT875,CT813 and IncA,were selected as antigens to detect corresponding antibodies in the serum samples by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）with the Ct proteins Hsp60 and major outer membrane protein （MOMP）as references.The results of ELISA were compared with those of the traditional gold standard method MIF assay to determine the immunodominant protein combination with the highest sensitivity and specificity.Results Of the 50 serum samples from patients with Ct infection,44 were positive and 6 negative by MIF.The results of ELISA with the combination of immunodominant proteins Pgp3,CT694 and CT875 as antigens were 97.73%（43/44）consistent to those of MIF assay.Of the 30 serum samples from GICA-negative clients,all were negative by MIF.Meanwhile,no antibody was detected against any of the immunodominant proteins Pgp3,CT694 and CT875 in any of the serum samples from GICA-negative clients.Conclusions The ELISA with the combination of immunodominant proteins Pgp3,CT694 and CT875 as antigens has good sensitivity and specificity for serological screening for Ct infection,and is simple to operate and easy to popularize.

Chlamydia trachomatis;Immunodominant epitopes;Serologic tests；Fluoroimmunoassay

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.006

國家自然科學基金（81201355）

齊蔓莉，Email：qiml7512@163.com

2014-10-08）

（本文編輯：尚淑賢）