全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯對氧化應激導致黑素細胞損傷的保護作用研究

寧維翾 王遂泉 洪為松 劉東銀 許愛娥

全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯對氧化應激導致黑素細胞損傷的保護作用研究

寧維翾 王遂泉 洪為松 劉東銀 許愛娥

目的 研究全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）對H2O2誘導的人表皮黑素細胞損傷的保護作用，探討其可能的作用機制。方法 體外培養人表皮黑素細胞，采用H2O2誘導細胞損傷模型。實驗分對照組、H2O2組、不同濃度表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）組和AcEGCG組。MTS法測定細胞存活率，LDH測試盒檢測乳酸脫氫酶（LDH）的漏出量，流式細胞儀檢測細胞內活性氧（ROS）的表達水平；Western印跡法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表達情況。多個樣本均數比較采用單因素方差分析，各樣本間多重比較采用SNK-q檢驗。結果 與對照組相比，H2O2處理組黑素細胞存活率明顯降低（22.99%±0.53%，P＜0.01），細胞內LDH漏出量增加（36.58%±0.73%，P＜0.01），細胞內ROS水平明顯升高（19.08±0.57，P＜0.01），caspase-9和caspase-3表達升高（分別為2.65±0.079和2.36±0.057，均 P ＜ 0.01）。與 H2O2組相比，細胞存活率在 10、20、40 μmol/L AcEGCG 組（79.50% ± 3.62%、86.52% ±5.13%、97.81%±5.21%）及EGCG組（43.19%±1.68%、63.34%±3.60%、70.82%±2.1%）明顯增加（均P＜0.01），caspase-9分別降低為 1.44±0.067、1.26±0.059、1.10±0.072及 2.31±0.085、2.13±0.091、1.35±0.064，caspase-3分別降低為1.70±0.053、1.57±0.057、1.24±0.068及2.09±0.076、1.98±0.093、1.79±0.056，差異均有統計學意義（P＜0.05）；LDH含量均明顯下降（P＜0.01）；40 μmol/L AcEGCG或EGCG處理后，ROS含量明顯下降（均P＜0.01）。結論 AcEGCG對H2O2誘導的黑素細胞氧化應激損傷有顯著的保護作用，且顯著優于EGCG，可能通過清除自由基、抗氧化、降低caspase-9及caspase-3表達等途徑發揮作用。

黑素細胞；氧化性應激；白癜風；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；表沒食子兒茶素沒食子酸酯

研究發現，白癜風患者表皮局部微環境中存在大量的氧自由基，能引起氧化應激，損傷黑素細胞，導致黑素細胞凋亡［1］。因此，抗氧化治療是防治白癜風的一個有效途徑［2］。茶多酚是天然高效能的抗氧化劑和自由基凈化劑，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是其中含量最高、最重要的生理活性物質［3-4］。全乙酰化 EGCG（AcEGCG）是 EGCG 經乙酰基修飾后的衍生物，其穩定性增強，生物利用度和生理活性提高，被認為是一種更具潛力的抗氧化劑［5］。本實驗以體外培養的人表皮黑素細胞為對象，建立H2O2誘導的黑素細胞損傷模型，觀察AcEGCG和EGCG抗H2O2誘導的黑素細胞損傷及其作用機制，為AcEGCG在臨床用于防治白癜風提供理論依據。

材料與方法

一、主要材料與試劑

1.試劑與儀器：F12培養液、胎牛血清、慶大霉素、谷氨酰胺、0.25%胰酶-EDTA和基因素均為美國Gibco公司產品；霍亂毒素、EGCG、二甲基亞砜（DMSO）、異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）均為美國Sigma公司產品；人重組堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）為美國Pepro-Tech公司產品；AcEGCG由浙江大學藥學院合成；乳酸脫氫酶（LDH）測試盒為美國Biovision公司產品；MTS細胞增殖測試盒為美國Promega產品；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）抗體均為美國SAB公司產品；DCFH-DA為美國Invitrogen公司產品。SPECTRAmax190酶標儀（美國MultiSciences公司），流式細胞儀Facscalibur（美國BD公司），Odyssey雙色紅外熒光成像系統（美國LI-COR公司）。AcEGCG由浙江大學藥學院胡永洲教授合成。

2.藥物制備：EGCG和 AcEGCG分別溶于DMSO，各藥物組DMSO的終濃度體積分數小于0.1%，對照組加終濃度為0.1%的DMSO。EGCG和AcEGCG 終濃度分別為 0、10、20、40 和 80 μmol/L。

二、方法

1.AcEGCG和EGCG細胞毒性實驗：分別參照文獻［6］與［7］分離培養人表皮黑素細胞。選擇對數生長期表皮黑素細胞，調整細胞數目為1×104個/孔，接種于96孔板，每孔加100 μl Hu16培養液。待細胞貼壁，吸棄培養液，對照組僅加入培養液及0.1%DMSO，AcEGCG 組和 EGCG 組分別加入 10、20、40和80 μmol/L的AcEGCG和EGCG共同培養24 h，然后加入MTS，37℃培養2 h，用酶標儀測定吸光度（A490值）。本試驗設3個復孔，重復6次。

2.MTS法測定黑素細胞存活率：對照組僅加入培養液及濃度為0.1%的DMSO；實驗組分為H2O2組和 10、20、40 μmol/L AcEGCG 組及 10、20、40 μmol/L EGCG組，分別加入0、10、20、40μmol/L的AcEGCG和EGCG預處理1h，Hu16培養液洗滌，每孔加1mmol/L H2O2培養1 h，用Hu16培養液輕輕洗滌3次，加入Hu16培養液繼續培養24 h。然后加入MTS，37℃培養2 h，用酶標儀測定A490值。

3.LDH 檢測［8］：處理同上，用不同濃度 AcEGCG或EGCG預處理1 h，Hu16培養液洗滌，再加入含1 mmol/L H2O2培養1 h，用Hu16培養液輕輕洗滌3次后，加入Hu16培養液繼續培養24 h。按試劑盒說明書分別檢測細胞培養上清液中的LDH含量，根據說明書設裂解液全裂解組，并設定該組的LDH含量為100%。

4.流式細胞儀測定細胞內活性氧（ROS）水平：調整細胞為3×105個/孔，接種于6孔板。待細胞貼壁后，用40 μmol/L AcEGCG或EGCG分別處理0.5、1、2、4 h，去除培養液，每孔加 1 ml含 10 mmol/L DCFH-DA 的培養液，37℃、5%CO2孵育 20 min，去除培養液，洗滌3次，加入1mmol/LH2O2處理30min，用溫磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，消化細胞，PBS復懸后用流式細胞儀檢測，測定熒光強度。

5.Western印跡法：3×105個/孔細胞接種于6孔板，各藥物濃度（分別為 10、20、40μmol/L）預處理 2h，培養液洗滌后，加入1 mmol/L H2O2處理1 h，用培養液清洗3遍，加培養液繼續培養16 h，收集并裂解細胞，提取蛋白。以等量蛋白上樣進行SDS-PAGE。電泳結束后將蛋白轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，4℃過夜孵育，洗膜后，加入IRDye800標記的二抗，室溫孵育1 h，Odyssey紅外熒光掃描成像系統掃描。應用生物圖像分析軟件Bandscan V5.0分析各處理組蛋白表達水平。實驗以β肌動蛋白為內參。獨立重復3次。

6.統計學處理：采用SPSS 11.0統計軟件分析處理數據，計量資料用±s表示。多個樣本均數比較采用單因素方差分析，各樣本間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 不同濃度全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對黑素細胞活力的影響 不同濃度AcEGCG和EGCG培養黑素細胞24 h，除80 μmol/L EGCG對黑素細胞活力有明顯的影響外，其他濃度AcEGCG和EGCG均未表現出對黑素細胞的毒性作用。以對照組為100%，a：與對照組相比，P＜0.05

圖2 不同濃度全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對H2O2誘導的黑素細胞形態的影響（×100） 2A：對照組，黑素細胞形態呈樹突狀，具有多個細長的突起，相互連接成網狀；2B：H2O2組，H2O2處理后，黑素細胞樹突明顯縮短消失，部分細胞變圓，貼壁細胞數量減少；2C ～ 2H：分別為 10、20、40 μmol/L EGCG 組及 10、20、40 μmol/L AcEGCG 組，存活細胞數目明顯增多，樹突無明顯回縮，隨EGCG和AcEGCG濃度增加，細胞形態漸好，且AcEGCG的保護效果優于EGCG

結 果

一、不同濃度AcEGCG和EGCG對黑素細胞活力的影響

AcEGCG和EGCG細胞毒性實驗結果見圖1。各組間黑素細胞活力比較，差異有統計學意義（F=9.892，P＜0.05）。與對照組（100%）相比，10～80μmol/L AcEGCG及10～40μmol/LEGCG培養黑素細胞24h，均未發現其對黑素細胞有明顯的毒性作用（P＞0.05）；而80 μmol/L EGCG處理黑素細胞24 h后，細胞活力下降為87.5%±5.2%，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此本實驗選擇10～40μmol/L作為以下實驗濃度。

二、不同濃度AcEGCG和EGCG對H2O2誘導的黑素細胞氧化應激的保護作用

倒置顯微鏡下觀察黑素細胞形態和數量，與正常黑素細胞相比，H2O2處理后細胞樹突明顯縮短消失，部分細胞變圓，貼壁細胞數量減少；EGCG和AcEGCG預處理后，存活細胞數目明顯增多，樹突無明顯回縮，隨EGCG和AcEGCG濃度的增加，細胞形態越好，呈現劑量依賴性，且AcEGCG的保護效果優于EGCG。見圖2。

各組黑素細胞存活率（圖3）差異有統計學意義（F=267.8，P＜ 0.01）。與對照組比較，H2O2誘導黑素細胞損傷后，其存活率下降到22.99%±0.53%，差異有統計學意義（P＜ 0.01）。10、20、40 μmol/L AcEGCG組的細胞存活率分別為79.50%±3.62%、86.52%±5.13%、97.81%±5.21%，明顯高于H2O2組（均P＜0.01），而 40 μmol/L AcEGCG 組與對照組相比，差異無統計學意義（P=0.14）；10、20、40 μmol/L EGCG組的細胞存活率分別為43.19%±1.68%、63.34%±3.60%、70.82%±2.1%，也明顯高于H2O2組（均P＜0.05）；與同濃度EGCG組相比，AcEGCG組細胞存活率均高于EGCG組（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對H2O2誘導黑素細胞損傷的保護作用 a：與對照組相比，P＜0.01；b：與H2O2組相比，P＜0.01；c：與同濃度EGCG組相比，P＜0.05

圖4 不同濃度全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對H2O2誘導黑素細胞內LDH釋放的影響 a：與對照組相比，P＜0.01；b：與H2O2組相比，P＜0.01；c：與同濃度EGCG組相比，P＜0.05

圖5 40 μmol/L全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對H2O2誘導的黑素細胞內ROS水平（熒光強度）的影響 以對照組細胞內ROS水平為 1，a：與對照組相比，P ＜ 0.01；b：與 H2O2組相比，P ＜ 0.01；c：與同濃度EGCG組相比，P＜0.01

圖6 Western印跡法檢測不同濃度全乙酰化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（AcEGCG）及表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對H2O2誘導的黑素細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）水平影響的電泳圖 1：對照組；2：H2O2組；3 ～ 8：分別為 10、20、40 μmol/L AcEGCG 組和 10、20、40 μmol/L EGCG組。經H2O2干預后，黑素細胞表達剪切形式的caspase-9和caspase-3明顯增加，經不同濃度AcEGCG或EGCG預處理后，caspase-9和caspase-3表達均降低，且同濃度AcEGCG組均低于EGCG組

三、不同濃度AcEGCG和EGCG對LDH水平的影響

各組LDH水平（圖4）的差異有統計學意義（F=237.66，P＜0.01）。以全裂解組細胞釋放LDH水平為100%，對照的LDH的相對水平為6.95%±0.71%。H2O2干預后，LDH水平升高到36.58%±0.73%，明顯高于對照組（P＜0.01）。10、20、40μmol/LAcEGCG 和 EGCG處理后，與H2O2組相比，LDH含量明顯下降（均P＜0.01）。40μmol/LAcEGCG組和EGCG組LDH水平分別低于10 μmol/L AcEGCG組和EGCG組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。同一濃度AcEGCG組的LDH水平均低于EGCG組（均P＜0.05）。見圖4。

四、AcEGCG和EGCG不同處理時間對黑素細胞內ROS表達的影響

各組ROS表達水平（圖5）的差異有統計學意義（F=750.9，P＜0.01）。設定對照組細胞內ROS水平為1，H2O2干預后，黑素細胞內的ROS水平升高到19.08±0.57，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）；經40 μmol/L AcEGCG或EGCG處理后，與H2O2組相比，ROS含量明顯下降（均P＜0.01）。AcEGCG和EGCG預處理4 h組ROS水平分別低于預處理0.5、1 h組，差異均有統計學意義（P＜0.05），AcEGCG和EGCG作用時間延長，黑素細胞內ROS表達水平降低；同一作用時間AcEGCG組ROS水平均低于EGCG組（均P＜0.01）。見圖5。

五、AcEGCG和EGCG對黑素細胞caspase-9和caspase-3表達的影響

正常黑素細胞僅少量表達caspase-9及caspase-3，經H2O2干預后，剪切形式的caspase-9及caspase-3表達明顯增加。經不同濃度AcEGCG或EGCG預處理后，caspase-9和caspase-3表達均較H2O2組降低，且以AcEGCG組明顯。見圖6。

各組caspase-9和caspase-3表達水平的差異有統計學意義（F=255.69、201.2，均P＜0.01）。設對照組caspase-9和caspase-3的表達量均為1，經H2O2干預后，黑素細胞 caspase-9（2.65 ± 0.079）和 caspase-3（2.36±0.057）的表達與對照組相比明顯增加（均P＜0.01）。10、20、40μmol/LAcEGCG或EGCG干預黑素細胞后，caspase-9分別降低為1.44±0.067、1.26±0.059、1.10±0.072及2.31±0.085、2.13±0.091、1.35±0.064，caspase-3 分別降低為 1.70 ± 0.053、1.57 ±0.057、1.24±0.068及2.09±0.076、1.98±0.093、1.79±0.056，分別與H2O2組比較，差異均有統計學意義（均P ＜ 0.05）。 除 10 μmol/L 與 20 μmol/L EGCG 組caspase-9的表達量差異無統計學意義（P=0.39），其他各濃度AcEGCG和EGCG組caspase-9和caspase-3表達水平差異均有統計學意義（均P＜0.05）。同一濃度AcEGCG組的caspase-9和caspase-3表達水平均低于EGCG組（均P＜0.05）。

討 論

很多具有抗氧化能力的藥物具有防治白癜風作用［9］。LDH是廣泛存在于細胞中參與能量代謝的一類重要的酶，LDH的過度釋放是細胞受損的一個重要指標。ROS水平可反映細胞的氧化應激水平，ROS增加是造成細胞凋亡的重要環節，高濃度ROS可以導致蛋白、脂類過氧化以及DNA不可逆性損傷而引起細胞死亡［10］，而抗氧化劑如EGCG等在預防ROS引起的細胞損傷方面可以發揮有益的作用［11］。

AcEGCG是一種EGCG前體藥物，由于其脂溶性高，在生物體內通透性良好，而且其生物活性、穩定性及抗氧化活性也都較EGCG高［2］。

本實驗發現，與正常對照組相比，H2O2模型組細胞存活率顯著降低，黑素細胞LDH的漏出量及細胞內的ROS水平明顯升高。而AcEGCG和EGCG均具有抑制H2O2的損傷作用，提高細胞存活率，使LDH漏出量和胞內ROS水平降低，并且AcEGCG的保護作用更加明顯，提示AcEGCG和EGCG可以拮抗氧化應激誘導的黑素細胞損傷。在檢測細胞內ROS水平的實驗中，用相同濃度AcEGCG和EGCG預處理0.5、1、2和4 h后，黑素細胞內的ROS水平隨著預處理時間的延長而降低，并且AcEGCG組細胞內ROS水平顯著低于等時間EGCG組，提示AcEGCG生物透膜性更好，能以更快的速度被黑素細胞所利用。

氧化應激可以誘發caspase-9、caspase-3等的活化，活化的caspase-3能剪切底物使凋亡得以進行，其在介導細胞凋亡中起著中心作用。有研究表明，caspase-9和caspase-3的活化與H2O2誘導的細胞凋亡相關［12］。本實驗中，H2O2組 caspase-9和caspase-3表達顯著增加，導致黑素細胞凋亡。而AcEGCG和EGCG預處理后，H2O2誘導的caspase-9和caspase-3活化明顯降低，具有劑量依賴性，且AcEGCG組的效果更明顯。說明AcEGCG和EGCG可能通過抑制caspase-9和caspase-3的活化而抑制細胞凋亡，AcEGCG作用更明顯，提示其生物活性及抗氧化能力更強。

本實驗結果表明，H2O2可誘導人表皮黑素細胞發生凋亡，而AcEGCG和EGCG均可以抑制細胞凋亡，保護黑素細胞，發揮防治白癜風的作用。它們的保護作用可能與增強體內抗氧化能力、降低細胞內ROS水平、降低caspase-9和caspase-3表達而阻斷細胞凋亡信號傳導通路有關。另外，AcEGCG的抗氧化能力、生物體內通透性、生物活性均優于EGCG。

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Protective effect of acetylated epigallocatechin gallate on melanocytes from oxidative stress-induced damage

Ning Weixuan*,Wang Suiquan,Hong Weisong,Liu Dongyin,Xu Ai′e.
*Department of Dermatology,Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China

Xu Ai′e,Email:xuaiehz@msn.com

Objective To investigate the protective effect of acetylated epigallocatechin gallate（AcEGCG）against H2O2-induced oxidative damage to human epidermal melanocytes,and to explore its possible mechanism.Methods Human epidermal melanocytes were isolated and culturedin vitro.Some melanocytes were classified into a H2O2group induced by H2O2only,EGCG groups and AcEGCG groups induced by H2O2after pretreatment with different concentrations of EGCG and AcEGCG,respectively.Three concentrations（10,20 and 40 μmol/L）of EGCG or AcEGCG were used to treat melanocytes for 1 hour in MTS assay and lactate dehydrogenase（LDH）leakage assay and for 2 hours in Western blot assay,while only one concentration （40 μmol/L）was used to treat melanocytes for 0.5,1,2 and 4 hours respectively in flow cytometry assay.Some melanocytes treated with only culture medium and 0.1%dimethyl sulphoxide（DMSO）served as the control group.After additional culture,MTS assay was performed to determine cell survival rate,flow cytometry to detect the level of reactive oxygen species （ROS）in melanocytes,Western blot to measure the expressions of caspase-9 and caspase-3 proteins.Lactate dehydrogenase（LDH）kit was used to detect the leakage of LDH to culture medium.Statistical analysis was carried out by using one-way analysis of variance for comparisons of multiple group means followed by Student-Newman-Keuls-q（SNK-q）test for multiple comparisons.Results Compared with the control group,the H2O2group showed significantly decreased cell survival rate（22.99% ±0.53%,P＜0.01）,but increased LDH leakage level（36.58% ± 0.73%,P ＜ 0.01）,intracellular ROS level（19.08 ± 0.57,P ＜ 0.01）,as well as caspase-9（2.65±0.079,P＜0.01）and caspase-3（2.36±0.057,P＜0.01）expressions.In comparison with the H2O2group,the cell survival rate was significantly higher in the 10-,20-and 40-μmol/L AcEGCG groups（79.50% ±3.62%,86.52%±5.13%,97.81%±5.21%,respectively,allP＜0.01）and EGCG groups（43.19%±1.68%,63.34%±3.60%,70.82% ±2.1%,respectively,allP＜0.01）.However,the 10-,20-and 40-μmol/L AcEGCG groups and EGCG groups all showed a significant decrease in the expression levels of caspase-9 （AcEGCG groups:1.44±0.067,1.26±0.059 and 1.10±0.072 respectively;EGCG groups:2.31±0.085,2.13±0.091 and 1.35±0.064 respectively,allP＜0.05）and caspase-3（AcEGCG groups:1.70±0.053,1.57±0.057 and 1.24±0.068 respectively,allP＜0.05;EGCG groups:2.09±0.076,1.98±0.093 and 1.79±0.056 respectively,allP＜0.05）compared with the H2O2group.Similarly,a significant reductionwasobservedintheleakagelevelofLDHintheseAcEGCGandEGCGgroups（allP＜0.01）andinROSlevelsin the 40-μmol/L AcEGCG and EGCG groups when compared with the H2O2group.Conclusions AcEGCG has a stronger protective effectagainstH2O2-inducedoxidative damage to human epidermalmelanocytes compared with EGCG,which may berealizedthroughclearanceoffreeradicals,antioxidanteffects,anddecreaseofcaspase-9andcaspase-3expressions.

Melanocytes;Oxidative stress;Vitiligo;Caspase 3;Caspase 9;Epigallocatechin gallate

作者單位：310053杭州，浙江中醫藥大學附屬廣興醫院皮膚科（寧維翾）；杭州市第三人民醫院皮膚科（王遂泉、洪為松、劉東銀、許愛娥）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.07.010

國家自然科學基金（81071294）；浙江省自然科學基金（LY13H11001）；杭州市重大科技專項創新項目（20122513A02）

許愛娥，Email：xuaiehz@msn.com

2014-09-02）

（本文編輯：周良佳 顏艷）