皮毛企業重金屬污染調查及Cr還原菌還原能力的測定

張信聰 魏淑珍

皮毛企業重金屬污染調查及Cr還原菌還原能力的測定

張信聰 魏淑珍

本文通過對棗強、辛集皮毛企業周圍土壤重金屬污染狀況調查，了解了皮毛企業重金屬污染的現狀及原因。通過對篩選到的Cr還原菌YGD8還原能力的測定，以期為重金屬Cr污染土壤及其他環境重金屬污染生物修復提供科學依據，同時豐富了微生物細胞表面展示技術基因工程菌菌種資源。

皮毛加工過程中要排放含Cr的廢水，重金屬Cr在環境中不容易還原。重金屬污染很難自然清除，常采用的物理、生物、化學等手段進行修復。生物修復包括微生物修復、動物修復、植物修復。微生物修復是利用微生物對重金屬的沉淀、吸收、氧化還原等作用來降低其毒性。微生物活動通過影響植物根系分泌吸收進而影響土壤對重金屬的價態和吸附，以降低重金屬的生物有效性。微生物修復處理效果好，費用低，操作簡單，可以就地進行處理，對環境影響低。因此，通過生物技術培育修復效率高、適應能力強的微生物，對污染的治理有重要意義。隨著世界經濟逐步發展，人類活動也逐步增強，采礦、印染、化工等工業帶來的三廢排放超標，農用化學品使用過量也造成環境的嚴重污染，特別是重金屬的污染愈發嚴重。目前最引人關注、污染最廣、毒性最大的有汞、鎘、Cr、鉛、砷等。農業部調查顯示，在約140萬 hm2的污水灌區域中，受重金屬污染的土地面積占污水灌面積的64.8％，對人類健康造成極大危害。因此，對重金屬污染的調查及脫污修復，對保護生態環境、呵護人類健康意義重大。

試驗與方法

采樣點的選擇

選擇棗強、辛集代表性皮毛企業周圍為采樣點。每個地點以S形分別選擇三個樣點，在各樣點上用鐵鏟取5～15 cm深的土壤，約500 g。在塑料薄膜上將各樣點土壤均勻混合，最后將樣品裝入樣袋，貼好標簽，帶回實驗室。

土樣的預處理

將樣品在室內自然晾干，并不斷翻拌、壓碎，揀出沙礫、植物殘體及碎石等雜質。然后進行樣品細磨，先過20 目尼龍篩，再進一步研碎后通過100 目尼龍篩。將經過細磨的樣品，分裝于樣品袋，貼好標簽，備用。

重金屬含量測定

土壤消化方法如下：準確稱取 0.1 g土壤放入聚四氟乙烯消解罐中，用1 mL蒸餾水濕潤后，加入5 mL鹽酸，加熱至120℃使樣品初步分解，當蒸發至2 mL時，冷卻至常溫，加入2 mL HF和5 mL HNO3，2 mL HClO4加熱至120℃保持1 h，直至樣品完全消解，加熱至150℃趕酸，直至剩余約為1 mL，冷卻，去離子水定容備測。

用火焰原子吸收光譜法進行重金屬含量的檢測。每個樣品做三個重復，取平均值，作為最終檢測結果。

土壤重金屬測定：質量標準參照《土壤環境監測技術規范》，使用GBW-07427標準土壤作為標準物質，測定重金屬回收率，并將回收率控制在90％～105％之間。每批消化樣品均帶2個空白樣品及20％的平行樣，使批次內相對標準偏差小于25％，批次間質控樣品各元素相對偏差小于30％。

培養基的配置

根據重金屬污染調查結果，對重金屬超標相對嚴重的作為目的物，配制相應培養基。

還原Cr的培養基配制：牛肉膏蛋白胨固體培養基：蛋白胨10.0 g，NaCl 2.0 g，酵母浸膏5.0 g，葡萄糖4.0 g，H2O 1000 mL，調節pH值至7.6。分別加入不同量的10％重鉻酸鉀，使Cr濃度達到50～1000 mg/L，然后用水浴將其加熱到80℃左右，其間要不斷用玻璃棒攪拌，直至瓊脂全部溶解，再分裝于三角瓶和試管中，在121℃下滅菌30 min。

Cr還原菌的篩選

對采集到的樣本，每個樣本用電子天平稱取10.0 g，然后分別放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在旋轉式搖床上150 r/min， 30℃振蕩培養30 min，使細菌充分懸浮出來。在無菌條件下，將吸取1.0 mL土壤稀釋液注入盛有9.0 mL無菌水的試管中，反復三次，充分混勻。然后再從該試管中吸取1.0 mL溶液，注入另一支盛有9.0 mL無菌水的試管中，并依次制成10-1，10-2，10-3，不同濃度的稀釋液。

無菌條件下，分別吸取10-2、10-3兩稀釋度的土壤懸液0.2 mL涂布于Cr（Ⅵ）濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的牛肉膏蛋白胨固體培養基，用涂布棒涂布均勻。每種濃度的平板分別做三個重復，并同時做空白對照，在30℃恒溫箱中倒置培養，直至長出菌落并對菌落生長情況進行觀察。

菌種純化及馴化篩選

將篩選出長勢較好的菌株經Cr（Ⅵ）在液體培養基中梯度壓力式馴化法馴化，Cr（Ⅵ）濃度梯度依次為2～60 mmol/L，于30℃條件下培養，并對生長情況進行觀察，將在含有高濃度重金屬離子的培養基中生長的單菌落挑取出來，在液體培養基中進行富集培養，然后在固體培養基上劃線分離，重復2～3遍，直至獲得對Cr（Ⅵ）具有高抗性的目的菌株。

Cr還原菌分子生物學鑒定

選出對Cr抗性最強的菌株，對其進行分子生物學鑒定。

依據細菌16S rDNA中最保守序列設計并合成一對引物，引物序列分別為：正向引物（5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’）；反向引物（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）。其中100 μL的PCR反應體系為：引物3 μL、dNTP 10 μL和Taq酶0.5 μL、10×PCR緩沖液5 μL、模板2 μL、ddH2O 80μL。所選擇的PCR程序為：預變性：94℃，3 min；變性：94℃，30 s；退火：56℃，1 min；延伸：72℃，2 min。循環次數為35次，最后再進行72℃延伸10 min。16S rDNA PCR擴增的產物首先要利用瓊脂糖凝膠進行回收，然后將回收到的產物用T4連接酶連接到pMD18-T載體（由大連寶生物公司提供）上，并在適宜的條件下轉化感受態細胞DH5a，經PCR鑒定陽性的送樣到北京三博遠志生物技術有限公司完成測序。最后將測定得到的相關序列提交到NCBI的GenBank數據庫中，與數據庫中已有的16S rDNA序列進行同源性比較分析。

Cr還原菌生理生化特性研究

用生化試劑盒對Cr還原能力強的菌株進行相關生理生化試驗。

Cr還原菌生長曲線測定

將對數生長期的Cr還原菌的菌懸液按1％的接種量分別接種到不含Cr（Ⅵ）以及含有5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L牛肉膏蛋白胨培養基中中，30℃震蕩培養，分別在0、6、12、18、24、36、48 h后取樣，用分光光度計于600 nm處測定OD值。

Cr細菌對Cr（Ⅵ）還原能力的測定

將菌株接種到不含重金屬離子的培養液中，培養48 h后（穩定期），在YGD8的菌懸液中加入Cr（Ⅵ）使其終濃度為10 mmol/L，繼續培養并在0、6、12、18、24 h后取樣，經10000 r/min離心2 min后取上清液，并使用原子吸收光譜測定金屬離子含量。

試驗結果與分析

土壤重金屬污染分析

土壤評價標準采用國家《土壤重金屬污染評價標準》（GB 15618-1995）中的標準，國家土壤環境質量標準。

圖1～圖5為一年內棗強和辛集不同企業Cr、Zn、Pb、Cu、Cd五種金屬隨時間變化的曲線，每個值為各縣三個企業的平均值。綜合以上數據可知，在12個月份中，各種重金屬含量變化并不大，但在雨季，如7～9月份，重金屬含量有下降趨勢，主要是夏季溫度適合Cr還原菌的生長，少量Cr被還原，雨水的增多使含Cr區域面積不斷增大，土壤Cr含量相對降低。

圖1 各地區各月份Cr含量平均變化值

圖2 各地區各月份Zn含量平均變化值

圖3 各地區各月份Cd含量平均變化值

圖4 各地區各月份Cu含量平均變化值

圖5 各地區各月份Pb含量平均變化值

由圖1可知，棗強和辛集Cr含量嚴重超標，其含量遠遠超過三級土壤的標準；由圖2知，辛集Zn含量已經超標。出現此種狀況的原因，是棗強和辛集制革企業較多，特別是棗強大營為世界裘皮之都，裘皮生產量很高，含Cr廢水的排放造成了土壤中重金屬的污染，而對于辛集，隨著辛集市暖氣企業規模不斷擴大，鍍Zn的大量使用，是造成土壤Zn污染的主要原因，另外，有機肥、化肥和Cr的大量使用也是土壤中Zn污染的重要途徑。

重金屬細菌篩選

經過多次傳代馴化，反復平板涂布，分離純化到1株對重金屬Cr具較高還原能力的菌株，命名為YGD8，對Cr的耐受性為20 mmol/L。

YGD8菌株16S rDNA測序結果

通過對菌株YGD8的16S rDNA進行測序和同源性比較，發現它與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescnes）的同源性達到99％，該菌株被鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescnes）。

YGD8生理生化特性

表1為該菌生理生化鑒定結果，生長溫度范圍為4～37℃，最適生長溫度為25～30℃，能夠利用L-阿拉伯糖、蔗糖、精氨酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、山梨醇和阿東醇，而不可利用丙二醇和乙醇。

表1 YGD8菌株的生理生化特性

圖6 Cr（Ⅵ）生長曲線

圖7 Cr（Ⅵ）還原曲線

YGD8生長曲線測定

在30℃條件下，將對數生長期的YGD8菌株分別接種到不含Cr（Ⅵ）以及含有5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L牛肉膏蛋白胨培養基中中，然后分別在0、6、12、18、24 h、36、48 h后取樣，用分光光度計于600 nm處測定OD值，繪制生長曲線如圖6所示。發現低濃度的Cr（Ⅵ）對YGD8的生長具有促進作用，而高濃度則抑制菌株的生長，并且在添加Cr（Ⅵ）10 mmol/L，YGD8生長效果最好，見圖6。

YGD8還原能力的測定

將YGD8菌株接種到不含重鉻酸鉀的培養液中，培養48 h后（穩定期），加入重鉻酸鉀使其終濃度為10 mmol/L，繼續培養0、6、12、24、36、48 h后取樣，經10000 r/min離心2 min后取上清液，原子吸收法測定培養液中Cr的含量，其還原率為86.2％，結果見圖7

結語

本文以河北省衡水市棗強及石家莊市辛集代表性皮毛企業周圍土壤為試驗材料，利用2014年12個月的時間分別在棗強、辛集兩個地點典型工業區附近采集土壤樣本，每個地點選擇三個企業，每個企業選擇三個樣點進行采集。利用火焰原子吸收光譜法測定土壤樣品中重金屬元素Pb、Cd、Cu、Cr、Zn的含量。從衡水棗強、石家莊辛集采集到的重金屬污染土壤中篩選重金屬Cr的還原菌，對抗性強的菌株，鑒定其在分類學上的地位，進行還原能力的測定，分別繪制其生長曲線和還原曲線。得出以下結論：（1）一年12個月內，7～9月，棗強重金屬Cr含量有下降的趨勢，其他月份重金屬Cr含量變化幅度不是很大。（2）棗強地區Cr含量超標相對嚴重，辛集Cr含量超標，Zn含量略高，棗強、辛集其余重金屬不超標。（3）分離純化到1株對重金屬Cr具較高抗性的菌株，經鑒定為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescnes），命名為YGD8，實驗室條件下YGD8對Cr的還原率為86.2％。該株菌是理想的重金屬修復的受體工程菌，可應用于水體和土壤的重金屬Cr污染的修復。特別是作為土著菌株對河北皮毛等企業的重金屬Cr污染的治理更具有針對性。

隨著城市化進程的加速，土壤重金屬污染在加劇，從廣大城鎮居民的生活飲食健康考慮，加強城市周邊土壤污染調查和從土壤污染的預防和治理的角度進行土地規劃和利用勢在必行。各工業區應繼續嚴格執行國家頒布的工業“三廢”排放標準和推廣清潔生產，并盡可能采用生物還原的方法，使污染控制在國家排放標準以內。同時對已經污染的土壤利用生物恢復技術及時治理，重金屬還原菌的篩選能為土壤生物恢復提供菌種資源，提高微生物對重金屬的吸附作用，是重金屬污染微生物修復的關鍵技術之一。

10.3969/j.issn.1001-8972.2015.23.003