接種發酵和自然發酵大頭菜揮發性成分比較

洪　冰，曾許珍，蔣和體，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.重慶市威利農業開發有限公司，重慶404700）

接種發酵和自然發酵大頭菜揮發性成分比較

洪冰1，曾許珍2，蔣和體1，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶400715；2.重慶市威利農業開發有限公司，重慶404700）

對大頭菜分別進行接種發酵和自然發酵，運用同時蒸餾萃取和氣相色譜-質譜聯用技術對發酵大頭菜揮發性成分進行分析。接種發酵和自然發酵大頭菜中揮發性成分有酯類、醇類、酸類、腈類、酮類、醛類、硫化物、雜環化合物等，其中酯類比例最高。2種發酵的大頭菜中共檢測出揮發性成分48種，接種發酵和自然發酵大頭菜中分別檢測出47、35種揮發性成分，其中相同的成分有34種。與自然發酵相比，接種發酵產生的揮發性物質種類更多。

接種發酵，自然發酵，大頭菜，同時蒸餾萃取（SDE），氣相色譜-質譜（GC-MS），揮發性成分

大頭菜（Brassica rapa Linn.Var.rapa）學名芥菜，又稱辣疙瘩，為一二年生草本植物，是一種含豐富維生素C、礦物質、糖類和蛋白質，營養價值很高的根用芥菜［1-2］。目前大頭菜多用于制成腌制品，而腌制品在腌制過程中的發酵作用，都是借助天然附著在蔬菜表面上多種微生物的作用來進行的［3］，其中乳酸菌發酵為主要發酵過程。

目前，國外關于大頭菜的研究主要集中在新鮮大頭菜的品質和硫代葡萄糖苷等方面，V.H.Escalona等［4］對鮮切大頭菜的保藏和微生物的控制進行研究，Glesni Macleod等［5］認為大頭菜中的硫代葡萄糖苷產生的異硫氰酸酯是大頭菜的重要香氣物質。國內的研究主要集中在大頭菜的脫鹽工藝及對傳統腌制發酵大頭菜的揮發性成分分析［2-3，6］，曾凡坤等［2］認為脫鹽工藝會導致大頭菜的香氣成分損失，鄧靜等［6］對大頭菜腌制過程的揮發性成分進行分析，得出大頭菜的主要揮發性物質為酯類及硫化物等，而對乳酸菌接種發酵的大頭菜揮發性風味物質的研究很少。本文通過對乳酸菌接種發酵大頭菜和自然發酵大頭菜揮發性香氣成分的比較研究，以期進一步了解大頭菜的揮發性風味成分，為接種發酵大頭菜香氣特征研究提供科學依據，對縮短發酵周期、提高產量與感官品質具有一定的參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大頭菜（三峽蕪菁） 取自重慶市威利農業開發有限公司巫山大頭菜基地；鼠李糖乳桿菌（6001）、短乳桿菌（6042）、腸膜明串珠菌（6055）分別編號為A、B、C來自中國工業微生物菌種保藏管理中心；二氯甲烷（色譜純） 成都市科龍化工試劑廠；食鹽（食用級） 購于重慶市北碚區永輝超市；正構烷烴混合對照品C7～C22美國AccuStandard公司；其他均為分析純。

QP2010氣相色譜-質譜聯用儀日本島津公司；RE-52A旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；同時蒸餾萃取裝置重慶新興玻璃儀器廠；KDM型調溫電熱套天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1大頭菜的發酵工藝流程［7-10］

工藝要點：將原料清洗、切塊后進行第一次和第二次加鹽，使大頭菜的鹽度分別控制在6%左右和8%左右，將加鹽完成的大頭菜均分，一份加入二次擴大培養后的菌液進行接種發酵，一份做對照進行自然發酵。

1.2.2理化指標的測定還原糖和總酸（以乳酸計）的測定：分別參照GB/T5009.7-2008《食品中還原糖的測定》和GB/T12456-2008《食品總酸度及有效酸度的測定》。

1.2.3大頭菜感官評分標準采用選擇實驗法和二一三點差別檢驗法［11］，將接種發酵和自然發酵大頭菜樣品放置于一次性塑料碗中，由經過專業感官評價訓練的評審員對大頭菜的色澤（10分）、香氣（40分）、滋味（40分）、脆性（10分）進行感官評分，共計100分。最后根據評分結果來確定大頭菜質量，具體大頭菜感官評分標準見表1。

表1　大頭菜感官評分標準［3，12］Table 1　The criterion of turnip’s sensory evaluation［3，12］

1.2.4樣品制備方法［13］采用同時蒸餾萃取法（SDE），取接種發酵與自然發酵大頭菜樣品各100g，切碎后置于1000mL圓底蒸餾燒瓶中，加入300mL超純水，放入KDM型調溫電熱套加熱并接至同時蒸餾萃取裝置的一端，并保持微沸。另取50mL二氯甲烷置于250mL單頸圓底燒瓶中，接在SDE裝置的另一端，以恒溫水浴加熱燒瓶，在48℃下連續萃取120min。二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉脫水，密封保存于-20℃冰箱中24h后快速過濾，濾液用旋轉蒸發儀在室溫、真空泵壓力0.05MPa條件下濃縮至1.0mL，備用。

1.2.5大頭菜接種發酵與自然發酵的揮發性風味物質分析

1.2.5.1氣相色譜條件色譜柱為DB-5MS（30mm× 0.25mm，0.25μm）；進樣口溫度220℃；升溫程序：35℃保持4min，以10℃/min升至110℃，保持6min，再以5℃/min升至150℃，保持2min，最后以 7℃/min升至230℃，保持6min；載氣（He）：流速1.00mL/min，壓力47.7kPa，進樣量1μL；進樣口不分流。

1.2.5.2質譜條件電離方式EI；電子能量70eV；離子源溫度230℃；接口溫度230℃；數據采集方式Scan；質量掃描范圍m/z50～550。

1.2.6揮發性成分的定性分析取樣品1μL，用氣相色譜質譜聯用儀進行分析鑒定。對檢測結果的定性分析，通過儀器所配制的NIST05.LIB和NIST 05s.LIB譜庫進行自動檢索，并結合計算保留指數和相關文獻共同確定。

質譜鑒定（用MS表示）：對檢測的揮發性成分通過譜庫進行檢索，僅當匹配度大于80的鑒定結果才予以確認。保留指數鑒定（用RI表示）：采用相同的升溫程序，以C7～C22正構烷烴作為標準，以其保留時間計算測試樣品中化合物保留指數，并與其他文獻中相同（DB-5MS）或相似（HP-5MS）色譜柱所測定的保留指數進行比較對化合物進行確認。

1.2.7數據分析方法采用Origin（Version 8.6）軟件對結果進行統計分析。

2　結果與分析

2.1大頭菜接種發酵與自然發酵過程中還原糖及總酸的變化

大頭菜接種發酵與自然發酵過程中還原糖和總酸的變化分別見圖1和圖2。

圖1　接種發酵和自然發酵大頭菜還原糖的變化Fig.1　Changes of reducing sugar in turnips during inoculated fermentation and natural fermentation

由圖1可知，接種發酵大頭菜的還原糖含量隨著發酵時間先增加后降低，在發酵30d時達到最高峰5.21g/100g，可能是因為接種微生物將大頭菜中的蔗糖和多糖轉化為還原糖，轉化的還原糖量大于微生物利用還原糖的量，導致其含量增加，之后在發酵90d和120d時分別降為3.88g/100g和3.20g/100g。自然發酵大頭菜的還原糖含量隨著發酵時間逐漸下降，在發酵120d時為2.52g/100g。

圖2　接種發酵和自然發酵大頭菜總酸的變化Fig.2　Changes of total acids in turnips during inoculated fermentation and natural fermentation

由圖2可知，當水分、鹽度、溫度適宜及厭氧條件下，乳酸菌開始發酵產生乳酸。接種發酵與自然發酵大頭菜的總酸含量均隨著發酵時間的延長而增加，接種發酵在發酵90d和120d時分別為5.80g/kg和6.28g/kg。自然發酵在發酵120d時為5.44g/kg。

綜上，接種發酵大頭菜90d時與自然發酵大頭菜120d時均達到出壇標準，因此下文對此兩種發酵大頭菜進行研究。

2.2接種發酵和自然發酵大頭菜感官評價結果

參照表1進行感官評價，感官評價結果見表2。接種發酵大頭菜90d時，表面呈金黃色，香氣純正，具有大頭菜特有香味，酸咸適口且脆性好。自然發酵大頭菜在120d時，表面呈金黃色，具有大頭菜特有香味，酸咸較適口且脆性好，分別達到出壇標準。相比自然發酵，接種發酵大頭菜感官評分高，產酸快，時間短。

2.3大頭菜接種發酵和自然發酵揮發性成分分析

對接種發酵90d和自然發酵120d的大頭菜進行GC-MS測定分析，其揮發性成分的GC-MS總離子流圖見圖3～圖4，各揮發性成分定性分析結果見表3。

表2　接種發酵和自然發酵大頭菜感官評價結果Table 2　The result of sensory evaluation in turnips of inoculated fermentation and natural fermentation

圖3　接種發酵大頭菜揮發性成分GC-MS總離子流圖Fig.3　Total ion current chromatogram of volatiles in turnip of inoculated fermentation

圖4　自然發酵大頭菜揮發性成分GC-MS總離子流圖Fig.4　Total ion current chromatogram of volatiles in turnip of natural fermentation

從表3可以看出，采用SDE和GC-MS技術檢測并經過計算機譜庫（NIST）進行初步檢索，結合計算保留指數和相關文獻可定性接種發酵和自然發酵大頭菜樣品中共鑒定出48種揮發性物質，這些成分主要是酯類14種、醇類8種、酸類1種、腈類1種、酮類1種、醛類13種、硫化物6種以及雜環化合物類4種，其中共有的有34種。

表3　接種發酵和自然發酵大頭菜的揮發性成分Table 3　Volatiles in turnips of inoculated fermentation and natural fermentation

續表

在接種發酵的大頭菜樣品中，共檢測出47種揮發性物質，占總峰面積的91.80%。主要為酯類、醛類、醇類及硫化物等，總相對含量為78.59%。其主要揮發性成分為：棕櫚酸乙酯、異硫氰酸烯丙酯、苯乙醛和二甲基三硫，相對含量分別為：10.29%、9.76%、6.69%和5.44%。

在自然發酵的大頭菜樣品中，共檢測出35種揮發性物質，占總峰面積的95.11%。主要為酯類、醛類、醇類及硫化物等，總相對含量為87.27%。其主要揮發性成分為：異硫氰酸苯乙酯、二甲基三硫、異硫氰酸烯丙酯和苯乙醛，相對含量分別為：16.00%、14.58%、10.90%和6.36%。

2.4接種發酵和自然發酵大頭菜中主要揮發性物質分類比較

接種發酵和自然發酵大頭菜中各類揮發性成分的數量及相對含量分別見圖5和圖6。從圖5可看出，接種發酵中酯類、醛類、醇類和雜環類的種類數比自然發酵的高，其他化合物種類的數量差別不明顯。從圖6可看出，在接種發酵和自然發酵大頭菜中，酯類、醛類、醇類及硫化物的相對含量較高，為兩種發酵大頭菜香氣的重要組成成分。接種發酵大頭菜中酯類、酮類、醛類、雜環化合物的相對含量比自然發酵大頭菜中高，自然發酵大頭菜中硫化物和醇類的相對含量比接種發酵大頭菜中高，其他種類差別不明顯。

2.4.1酯類揮發性物質比較由表3和圖5可知，接種發酵和自然發酵大頭菜中共檢測出酯類物質14種，兩種發酵大頭菜共有的有10種，相對含量較高的棕櫚酸乙酯為兩種大頭菜樣品所共有，研究表明，大分子質量的不飽和單羧酸與低級的脂肪醇所形成的酯類，大都具有愉快的水果香氣［15-16］，對發酵大頭菜的香氣質量貢獻較大，如：棕櫚酸乙酯呈微弱蠟香和奶油香氣，亞油酸乙酯有特殊的類似臘腸的氣味和輕微的澀味等。

2.4.2硫化物香氣物質比較由表3和圖5可知，接種發酵和自然發酵大頭菜中共檢測出硫化物6種，自然發酵大頭菜中硫化物含量較高，達到了44.82%。兩種發酵大頭菜中相對含量較高的硫化物為異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸苯乙酯、二甲基三硫和二甲基四硫。自然發酵大頭菜中的異硫氰酸苯乙酯的相對含量明顯比接種發酵中的高，說明接種發酵大頭菜中的異硫氰酸苯乙酯在發酵過程中被酶和微生物快速分解。硫代葡萄糖苷廣泛存在于十字花科蔬菜（如卷心菜、大頭菜等）中，在芥子酶的作用下產生異硫氰酸酯［17-18］；相關研究表明：異硫氰酸烯丙酯具有強烈的、類似芥末和辣根的氣味，其風味閾值較低，僅為0.375mg/kg［17］。劉明春等［13］對榨菜的揮發性成分進行分析，認為二甲基三硫是榨菜的揮發性風味的主要成分之一。經斌等［19］對中國黃酒中的重要風味物質二甲基三硫等的嗅覺閾值進行研究，測得國家黃酒評委的覺察閾值和識別閾值分別為0.08μg/L和0.44μg/L。二甲基三硫等含硫化合物閾值低，香氣特征明顯，具有蔥、肉特殊香味，同時也具有較強的殺菌和防腐等作用［20］，是大頭菜的特征性成分。

2.4.3醇類香氣物質比較由表3可知，接種發酵和自然發酵大頭菜中共檢測出醇類物質8種，兩種發酵大頭菜共有的有7種。醇類物質主要是由酵母菌發酵產生的，醇可與有機酸發生酯化反應生成酯類化合物［21］。接種發酵和自然發酵中正己醇和苯乙醇的相對含量均較高，正己醇具有水果芬芳香氣，苯乙醇具有薔薇香氣，楊霄等［22］認為苯乙醇是一些發酵食品的自然風味物質。丁保妹等［23］對采用樹脂吸附原位分離技術生物發酵合成天然苯乙醇進行研究得出其覺察閾值和識別閾值分別為2.71μg/L和3.82μg/L。

2.4.4酸類及腈類揮發性物質比較接種發酵和自然發酵中均檢出了棕櫚酸和苯丙腈，且其相對含量均較高。酸類作為合成酯類的重要前體物質之一，對發酵大頭菜的香氣也有很大的貢獻。腈一般是在低pH環境或有亞鐵離子或其他陽離子存在下形成，葡萄糖苷酯經芥子酶降解生成的配糖體可降解為異硫氰酸酯、硫氰酸酯或脫去硫原子形成腈［2-25］。鄧靜等［6］在對大頭菜腌制過程的揮發性成分進行分析中發現，整個腌制過程中只檢測出1種腈類化合物，即苯丙腈，認為是新鮮大頭菜的主要香氣成分之一。

圖5　接種發酵和自然發酵大頭菜中揮發性成分化合物的構成種類及數量Fig.5　The types and amount of volatiles in turnips of inoculated fermentation and natural fermentation

圖6　接種發酵和自然發酵大頭菜中揮發性成分化合物的構成種類及相對含量Fig.6　The category and relative contents of volatiles in turnips of inoculated fermentation and natural fermentation

2.4.5醛類揮發性物質比較由表3可知，接種發酵和自然發酵大頭菜中共檢測出醛類物質13種，兩種發酵大頭菜共有的有7種。相對含量較高的2種醛類物質糠醛和苯乙醛為兩種發酵大頭菜樣品所共有。研究表明，苯乙醛具有蜂蜜香，壬醛有愉快的玫瑰和杏仁香［26］。接種發酵醛類種類和相對含量均高于自然發酵，說明醛類物質使得接種發酵大頭菜的香氣成分更加豐富。

2.4.6雜環化合物類及酮類揮發性物質比較由表3和圖5可知，接種發酵和自然發酵大頭菜中共檢測出雜環化合物類物質4種，接種發酵大頭菜中雜環化合物相對含量較高。在同一萃取條件下，接種發酵大頭菜中2-乙基呋喃和2-正戊基呋喃的相對含量均比自然發酵大頭菜分別高。相關資料顯示，2-乙基呋喃具有焦香、咖啡樣氣味［13］；2-正戊基呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜的香韻，對大頭菜的香氣質量均有一定的貢獻。自然發酵中未檢出酮類物質，脂肪酮通常都具有較強的特殊嗅感。

3　結論

本文接種發酵大頭菜90d時與自然發酵大頭菜120d時均達到出壇標準，經感官綜合評定，接種發酵大頭菜感官評分高于自然發酵大頭菜。接種發酵大頭菜在發酵過程中產酸速度明顯高于自然發酵大頭菜。對接種發酵和自然發酵大頭菜進行GC-MS分析得出：接種發酵和自然發酵大頭菜共檢出48種香氣成分，共有的有34種。

接種發酵大頭菜中相對含量較高的有：棕櫚酸乙酯、異硫氰酸烯丙酯、苯乙醛和二甲基三硫；自然發酵的大頭菜相對含量較高的有：異硫氰酸苯乙酯、二甲基三硫、異硫氰酸烯丙酯和苯乙醛。兩種發酵的大頭菜主要揮發性物質種類均為酯類、醛類、醇類及硫化物等。與自然發酵相比，接種發酵的揮發性物質種類更多。

接種發酵與自然發酵大頭菜中感官評價、物質種類、相對含量及特有香氣成分的差異說明接種乳酸菌發酵對接種發酵大頭菜香氣形成具有重要作用。

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Comparison of volatiles produced from turnips of inoculated and natural fermentation

HONG Bing1，ZENG Xu-zhen2，JIANG He-ti1，*
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Chongqing Willie Agricultural Development Co.，Ltd.，Chongqing 404700，China）

The turnips were exerted inoculated fermentation and natural fermentation respectively，and its volatiles were analyzed by using simultaneous distillation-extraction（SDE）and gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.Volatiles in turnips of the inoculated fermentation and natural fermentation include esters which take the highest percentage，alcohols，acids，nitriles，aldehydes，ketones，sulfide，heterocyclic compounds，etc.48 kinds of volatiles in the two types of fermentation turnips were identified，there were 47，35 kinds of volatiles in the turnip of inoculated fermentation and natural fermentation respectively，34 species among them were found in the two different turnips.Compared with natural fermentation，more volatiles were identified in turnips of inoculated fermentation.

inoculated fermentation；natural fermentation；turnip；simultaneous distillation-extraction（SDE）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；volatiles

TS207.3

A

1002-0306（2015）14-0075-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.006

2014－09－11

洪冰（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質量控制。

蔣和體（1963-），男，博士，教授，研究方向：農產品加工。

重慶市“121”科技支撐示范工程（cstc2013jcsf-jcssX0033）。