板栗花黃酮的抗氧化作用及其對Hela細胞活力的影響

陳亞藍，王雪青，*，李月嬌，宋文軍，王素英，趙國強，付慶偉

（1.天津市食品與生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.唐山遷西縣板栗產業研究發展中心，河北唐山064300）

板栗花黃酮的抗氧化作用及其對Hela細胞活力的影響

陳亞藍1，王雪青1，*，李月嬌1，宋文軍1，王素英1，趙國強2，付慶偉2

（1.天津市食品與生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.唐山遷西縣板栗產業研究發展中心，河北唐山064300）

采用水楊酸法、鄰苯三酚自氧化法和三價鐵離子法分別測定板栗花黃酮清除羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的能力及其總還原力，以研究板栗花黃酮的抗氧化作用；采用MTT法測定純化板栗花黃酮對Hela細胞活性的影響。結果表明：板栗花黃酮具有較強的還原力并能有效清除·OH，其總還原力和·OH清除率顯著高于VC對照組（p＜0.05），可達0.605和94.97%；純化后板栗花黃酮的總還原力和清除·OH能力較純化前明顯增強。但板栗花黃酮對O2-·的清除率明顯低于VC對照組。同時純化后板栗花黃酮能顯著抑制Hela的細胞活力，在實驗濃度范圍內，抑制率最高至81%，呈劑量-效應性。因此，板栗花黃酮具有較強的抗氧化活性和抑制Hela細胞活力的作用，本文為板栗花的綜合利用與開發提供了一定的數據支持。

板栗花，黃酮，抗氧化活性，Hela，細胞活力

板栗花，殼斗科栗屬植物板栗的雄花序，性甘、平、無毒。據《本草綱目》記載，板栗花可治療喉炎腫毒、瘰病和赤白痢疾。現代研究顯示板栗花含有黃酮、雌二醇、多糖等多種活性物質［1］，特別是黃酮類物質含量高達9.08g/100g，為報道花中含量之首［2］。板栗屬于雌雄同株果樹，雌雄花比例在1∶2400～1∶4000之間［3］，因此會產生大量的雄花，特別是近年來隨著板栗種植面積不斷增加，每年有大量板栗花產生，對其進行研究與開發具有重要的社會意義與經濟效益。

黃酮類化合物是植物中廣泛存在的以2-苯基色原酮為母核的一類化合物，由于母核上的羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基不同，表現的活性也不同［4］。據報道黃酮類化合物，如銀杏黃酮，葛根黃酮等，具有很好的清除自由基、抗氧化作用，對于與機體的氧化損傷密切相關的人類一些慢性疾病，如高血壓、心臟病和癌癥等，黃酮類化合物在抗炎癥、防癌等方面具很好的應用［4-7］。黃酮類化合物是植物的一大類次生代謝產物，其種類多，結構各異，表現在生物利用率、抗氧化性及對人體的影響也有差異，因此從天然植物中篩選高活性的黃酮類化合物，是目前食品與營養等領域的研究熱點之一。一些天然產物，如白藜蘆醇及其衍生物等［7-8］，均具有清除自由基的抗氧化作用，從而保護DNA、蛋白質等機體生物大分子免受氧化損害，起到預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病和抑制腫瘤細胞生長的作用［7-9］。關于板栗花黃酮的抗氧化活性近幾年有研究報道［10］，但其對腫瘤細胞的作用目前尚未見相關研究。因此，本實驗從板栗花中提取黃酮，研究其體外抗氧化活性及對Hela細胞的影響，為板栗花黃酮的開發應用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

板栗花河北省唐山遷西鮮板栗花，自然風干后粉碎；Hela細胞天津商業大學實驗室提供；96孔板、MTT試劑、DMEM/HIGH GLUCOSE培養基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購于life公司；蘆丁標準品上海永葉生物科技有限公司，98%；二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、磷酸氫二鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、抗壞血酸、鄰苯三酚、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀天津市光復科技發展有限公司，均為分析純。

T6新世紀紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；3-18K高速離心機美國SIGMA公司；FHC-1200A超凈工作臺北京國儀合信商貿有限公司；240i細胞培養箱美國Thermo公司；SPECTRAMAX-M5酶聯免疫檢測儀美國MD公司；Ti-u倒置熒光顯微鏡日本尼康公司。

1.2實驗方法

1.2.1板栗花黃酮含量的測定以蘆丁作為標準品，參照文獻方法［11］并加以改進。具體操作如下，采用亞硝酸鋁比色法測定，精密稱取蘆丁對照品并用95%乙醇溶液溶解，精確配制成0.016、0.032、0.048、0.064、0.08mg/mL，分別精確吸取1mL置于50mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液2mL，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液2mL，放置6min，加4%NaOH溶液20mL，加水至刻度，搖勻，放置15min，于510nm處測吸光值，繪制標準曲線。純化前后的板栗花黃酮含量，分別將提取物在510nm處測其吸光值。

1.2.2粗提板栗花黃酮準確稱取一定質量經粉碎、過篩（80目）、干燥（100℃）的板栗花粉末置于1000mL的圓底燒瓶中，加入10倍量的石油醚進行脫脂，待脫脂完全后過濾，棄去石油醚溶液，用70%的乙醇按固液比1∶30，回流提取兩次，合并兩次提取液，真空過濾，濾液經旋轉蒸發濃縮，得到的粗提液經冷凍干燥得粉末，并測定其黃酮含量。

1.2.3純化板栗花黃酮以板栗花黃酮粗提液為原料，用D-101大孔樹脂分離純化。上樣液質量濃度2mg/mL、上樣速率為2mL/min，過柱完后用5倍樹脂體積量（5BV）的蒸餾水以2mL/min的速度洗柱至出水無色，再用70%的乙醇以2mL/min的洗脫速度洗脫至無色透明，收集70%的乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥，稱重，測定總黃酮含量。

1.2.4板栗花黃酮對羥基自由基清除率的測定參照高麗威報道的方法進行［12］。在10mL具塞試管中加入樣液2mL，1mL 6mmol/L的FeSO4，1mL 6mmol/L的H2O2，混勻后靜置10min，隨后加入6mmol/L水楊酸1mL，搖勻放置30min于510nm處測吸光值，并設空白對照計算清除率。其清除率公式如下：

式中：A0表示空白對照的吸光度；Ax表示樣液的吸光度；Ai表示等體積蒸餾水代替水楊酸時吸光度值。

1.2.5板栗花黃酮對超氧陰離子清除率的測定超氧陰離子清除率的測定采用鄰苯三酚自氧化法［13-14］。具體操作如下：取4.5mL pH8.0的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液置于25℃水浴中加熱20min，隨后加入1mL樣液和25mmol/L鄰苯三酚溶液0.4mL，混勻后于25℃水浴中反應5min，最后加入80mmol/L的HCl溶液1mL搖勻，靜置3min以終止反應，在420nm處測定吸光度值。超氧陰離子清除率計算公式如下：

式中：A1表示樣液的吸光值；A2表示等體積蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的吸光值；A3表示空白對照組的吸光值。

1.2.6板栗花黃酮總還原力的測定參照文獻方法［13］并加以改進。具體操作如下：取10mL具塞試管，加入2mL樣液，pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻置于50℃恒溫水浴鍋上水浴20min，加入10%（v/v）的三氯乙酸溶液2.5mL，取5mL混勻液和0.1%FeCl3溶液1mL定容50mL，在700nm處平行三次測吸光值。計算還原能力的公式如下：

還原力（A）=Ai-A0

式中：Ai表示樣液吸光值；A0表示空白對照組的吸光值。

1.2.7板栗花黃酮對Hela細胞活力的影響采用MTT法測細胞活力［15］。Hela細胞以DMEM/HIGH GLUCOSE培養基（含10%FBS及1%雙抗）培養，置于37℃，5% CO2的恒溫培養箱中，每2～3d傳代一次，取生長對數期細胞進行實驗。將培養48h的對數期細胞制成單細胞懸液，按1×105個/200μL接種于96孔板，培養24h后，分為不添加純化板栗花黃酮的對照組和加入純化板栗花黃酮，使其終濃度分別為0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/mL五個實驗組，每組設5個復孔，同時，設無細胞的培養基為空白組，用于測定時調零。藥物作用24h后加入MTT溶液（終濃度為5mg/mL），孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，PBS洗滌3次。每孔加入150μL DMSO，振蕩使結晶物充分溶解，在酶聯免疫檢測儀上以波長490nm測各孔吸光度（OD值），計算細胞生長抑制率。公式如下：

式中：OD1表示實驗組吸光度值；OD2表對照組吸收光度值。

2　結果與分析

2.1標準曲線的確定及純化前后板栗花黃酮的純度

蘆丁標準曲線如圖1所示，得線性回歸方程：y= 10.169x+0.0158，其中R2=0.9971。根據曲線得到粗提板栗花黃酮與純化后板栗花黃酮純度分別為14.36%，33.1%。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　Standard curve of rutin

2.2板栗花黃酮純化前后對羥基自由基清除能力

圖2是純化前后的板栗花黃酮對·OH清除能力的影響。從圖2可知，在實驗濃度范圍內，隨著黃酮濃度的增加，清除·OH的能力逐漸增大，與濃度呈正相關。在0.15～0.4mg/mL范圍內，純化后板栗花黃酮的·OH清除能力明顯高于總黃酮濃度相同的粗提板栗花黃酮（p＜0.05）。當黃酮濃度為0.05mg/mL時，粗提板栗花黃酮和純化板栗花黃酮的·OH清除能力均達到50%以上，在濃度為0.1～0.4mg/mL范圍內純化后的板栗花黃酮的·OH清除能力與同濃度的VC溶液相比有顯著性差異（p＜0.05），且純化后板栗花黃酮在濃度為0.4mg/mL時其清除能力高達94.97%，明顯高于VC對照組，說明板栗花黃酮有較好的·OH清除能力。

圖2　板栗花黃酮對·OH的清除能力Fig.2　Scavenging·OH activity of the flavonoids from chestnut flower

2.3板栗花黃酮純化前后對超氧陰離子自由基的清除能力

O2-·是機體內壽命最長的自由基，其作為自由基鏈式反應的引發劑，一旦自由基鏈式反應啟動，會給機體造成進一步的危害。由圖3可知，純化前后板栗花黃酮對超O2-·的清除能力隨溶液濃度增加而增強，在0.05～1mg/mL范圍內，VC的清除能力明顯強于純化前后板栗花黃酮（p＜0.05）。在相同濃度時，純化前后板栗花黃酮對O2-·的清除能力無顯著性差異（p＞0.05）。

圖3　板栗花黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3　Scavenging O2-·activity of the flavonoids from chestnut flower

2.4板栗花黃酮純化前后總還原力

圖4　板栗花黃酮總還原能力Fig.4　Total reducing power of the flavonoids from chestnut flower

板栗花黃酮的總還原力見圖4。由圖4可知，純化前后板栗花黃酮的總還原力明顯強于VC（p＜0.05），且隨板栗花黃酮濃度的增加而增加，表現出良好的劑量-效應關系，是較好的電子供應者。當板栗花黃酮濃度在0.05～0.3mg/mL范圍內時，同濃度的純化前后的板栗花黃酮總還原力明顯高于VC的總還原力，差異顯著（p＜0.05），且純化板栗花黃酮總還原力強于粗提板栗花黃酮（p＜0.05），最高可達0.605。在黃酮含量為0.1mg/mL時純化后板栗花黃酮總還原力高出板栗花黃酮粗提液80.07%，說明純化后板栗花黃酮還原力效果升高顯著（p＜0.05）。

2.5板栗花黃酮對Hela細胞活性的影響

純化板栗花黃酮對Hela細胞活性影響見表1，從表1可知，隨著黃酮濃度的增加，細胞的抑制率也隨之增大，表現出與黃酮的濃度呈正相關。當黃酮濃度由0.01～1mg/mL，抑制率由40%增加到81%，呈劑量依賴性作用方式，其對Hela細胞的IC50為100.38μg/mL。

表1　板栗花黃酮對Hela細胞活力的影響（±s）Table 1　Effect of the flavonoids-purified from chestnut flower on Hela cellular viability（±s）

表1　板栗花黃酮對Hela細胞活力的影響（±s）Table 1　Effect of the flavonoids-purified from chestnut flower on Hela cellular viability（±s）

注：*與對照組比較，p＜0.05。

實驗組　　濃度（mg/mL）　OD值　　抑制率（%）空白組　0　0　-對照組　0　0.39±0.005　-實驗組1　0.0001　0.32±0.013　18±0.027實驗組2　0.001　0.29±0.013　27±0.037實驗組3　0.01　0.23±0.003*　40±0.135實驗組4　0.1　0.19±0.008*　53±0.017實驗組5　1　0.07±0.008*　81±0.019

3　討論

本研究中板栗花黃酮同樣顯示出有很強的還原能力，純化后的板栗花黃酮還原力大于純化前，而且二者均大于VC對照，且呈劑量依賴性的特點（圖4），與文獻［16］報道結果相近。在清除羥基自由基能力方面，純化后板栗花黃酮的羥基自由基清除能力高于純化前，而二者明顯高于VC對照組，特別是純化后的板栗花黃酮在0.4mg/mL濃度時羥基自由基清除率高達94.97%，顯示出超強的清除羥自由基的能力，該結果優于文獻［17］的報道。這可能是因為提取和純化工藝不同導致的結果，通過對黃酮類物質的分離與純化，改變了黃酮的圖譜，從而顯示出了清除能力差異。黃酮類化合物通過本身含有的多酚羥基與羥自由基反應，形成穩定的半醌式自由基結構，從而中斷自由基的鏈式反應，以發揮清除自由基的抗氧化作用，而且不同的黃酮類化合物，由于酚羥基活性基團數量與位點不同，導致不同來源的黃酮化合物清除自由基能力的差異［18］。而在超氧陰離子自由基的清除過程中，純化前后板栗花黃酮都明顯弱于抗壞血酸的作用效果，反映出黃酮類物質不能與超氧陰離子有效的結合，這與文獻［19］中芒萁黃酮的體外抗氧化趨勢一致。

許多研究報道，黃酮類物質具有抑制腫瘤細胞增生的能力。如甘草黃酮對Hela細胞的增殖具有顯著的抑制及誘導細胞凋亡的效果，200μg/mL劑量的甘草黃酮抑制腫瘤細胞增殖的效果最佳［20］；大薊黃酮能誘導人子宮癌Hela細胞的凋亡，其對Hela細胞的IC50為85.12μg/mL［21］。本實驗證實純化后的板栗花黃酮能顯著抑制Hela細胞毒活性，其對Hela細胞的IC50為100.38μg/mL，說明板栗花黃酮同其他植物黃酮一樣，具有較好的抗腫瘤效果。

黃酮類物質的抗腫瘤作用機制與其抗氧化、清除自由基的作用密切相關。而黃酮類化合物清除自由基作用強弱受其結構影響，如C2，C3位雙鍵，酚羥基取代模式及數目和羥基甲氧基取代以及B環上存在鄰二酚羥基等，從而影響其抗癌效果［22］。現有研究表明，黃酮類化合物對腫瘤細胞有細胞毒作用，而對正常細胞無毒性和致突作用，反而有抗氧化和正向的免疫調節作用［23］。松樹皮中提取的黃酮類化合物能誘導MCF27細胞凋亡，但對正常細胞無作用［24］；圣草酚對Vero細胞毒性很小卻能有效地抑制皮膚癌細胞A375、喉癌細胞HEp2、乳腺癌細胞MCF27、肝癌細胞HepG2和宮頸癌細胞Hela的增殖［25］。因此，黃酮類化合物這種選擇性毒性對于研究和開發板栗花黃酮有重要作用。

4　結論

板栗花資源豐富，板栗花黃酮具有強的還原能力和清除·OH能力，可顯著抑制Hela細胞的生長，并呈劑量依賴性的特點。因此，板栗花黃酮具有抗氧化和抑制腫瘤細胞增生的功效，本研究結果為板栗花的綜合利用與開發提供了很好的應用前景。然而關于板栗花黃酮的精細結構解析，構效關系以及其抗腫瘤作用機制有待進一步探究。

［1］李英華，胡福良.我國花粉化學成分的研究進展［J］.養蜂科技，2005（4）：7-16.

［2］俞秀玲.花粉的活性成分［J］.食品工業科技，2007，28（4）：236-238.

［3］王家玉.板栗增雌花減雄花的技術措施［J］.林業科技開發，1995（1）：48-49.

［4］裴凌鵬，惠伯棣，金宗濂.黃酮類化合物的生理活性及其制備技術研究進展［J］.食品科學，2004，25（2）：203-207.

［5］郎娜，羅紅霞.黃菜花中黃酮類物質抗氧化性的研究［J］.食品研究與開發，2007，28（3）：74-76.

［6］焦士蓉，黃承鈺.柑橘屬類黃酮生物活性的研究進展［J］.西華大學學報：自然科學版，2008，27（1）：32-35.

［7］陳波，俞惠新，譚成，等.白藜蘆醇及其衍生物抗氧化抗腫瘤活性研究［J］.食品與機械，2007，23（4）：52-55.

［8］王衛東，趙志鴻，張小俊，等.陳皮提取物中黃酮類化合物及抗氧化的研究［J］.食品工業科技，2007，28（9）：98-103.

［9］Lin J K，Tsai S H.Chemoprevention of cancer and cardiovascular disease by resveratrol［J］.Procceeding of the National Science Council，Republic of China.Part B，Life Sciences，1999，23（3）：99-106.

［10］吳雪輝，張喜梅，李延群，等.板栗花粗提物的抗氧化活性研究［J］.現代食品科技，2008，24（1）：14-19.

［11］王曉波，李金芳，王梅，等.山竹殼總黃酮抗氧化及抑制亞硝化作用研究［J］.食品研究與開發，2013，34（6）：9-13.

［12］高麗威.紫心甘薯黃酮類化合物的提取純化及抗氧化活性研究［D］.杭州：浙江大學，2010.

［13］汪璇.黃粉蟲黃酮提取、分離及抗氧化性研究［D］.楊陵：西北農林科技大學，2013.

［14］張燕平，張虹.羊棲菜提取物體外自由基清除能力的研究［J］.鄭州工程學院學報，2003，24（1）：50-54.

［15］Stockert J C，Blazquez-Castro A，Canete M，et al.MTT assay for cell viability：intracellular localization of the formazan productis in lipid droplets［J］.Acta Histochemca，2012，114（8）：785-796.

［16］張利燕，常虹，趙麗芹，等.提取方式對板栗雄花序總黃酮抗氧化活性的影響研究［J］.食品工業科技，2013，34（4）：97-100.

［17］吳雪輝，張喜梅，李廷群，等.板栗花粗提物的抗氧化活性研究［J］.現代食品科技，2008，24（1）：14-19.

［18］Chen J W，Zhu Z Q.Structure-activity relationship of natural flavonoidsinhydroxylradical-scavengingeffects［J］.Acta Pharmacologica Sinica，2002，23（7）：667-672.

［19］曾偉.芒萁黃酮的純化分離及抗氧化活性研究［D］.廣州：廣東工業大學，2013.

［20］馬淼，周旭莉，戶元林，等.烏拉甘草有效成分對人體4種腫瘤細胞增殖與凋亡的影響［J］.時珍國醫國藥，2009，20（5）：9-11.

［21］劉素君，郭紅，潘明，等.大薊總黃酮誘導腫瘤細胞凋亡作用的研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（2）：294-295.

［22］Joyeux M，Lobatein A，Autom R.Comparative antilipoperoxidant，antinecrotic and scravenging properties of terpanes and biaflavones from Ginkgo and flavonoids［J］.Planta Medica，1994，61（2）：66-69.

［23］Huang H Y，Zha X L.Development in research of antitumor effect of flavones compounds［J］.Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies，2002，21（7）：428-433.

［24］Huynh H T，Teel R W.Selective induction of apoptosis in human mammary cancer cells by pycnogenol［J］.Anticancer Research，2000，20（4）：2417-2420.

［25］楊志峰，朱英，李珊珊.植物黃酮的抗腫瘤作用及構效關系的研究進展［J］.四川中醫，2011，29（9）：35-38.

Effect of the flavonoids from chestnut flower on antioxidant activity and cellular viability of Hela line

CHEN Ya-lan1，WANG Xue-qing1，*，LI Yue-jiao1，SONG Wen-jun1，WANG Su-ying1，ZHAO Guo-qiang2，FU Qing-wei2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Qianxi Chestnut Industry Research and Development Center，Tangshan 064300，China）

Antioxidant activity of the flavonoids from chestnut flower was studied by determining free radicals scavenging abilities including superoxide anion free radicals（O2-·）and hydroxyl free radicals（·OH），and total inducing power using the salicylic acid assay，pyrogallol autoxidation assay and ferric reducing antioxidant assay，respectively.And the influence of flavonoids-purified on the Hela cellular viability was also investigated by MTT assays.The results showed that the scavenging·OH ability and total reducing power of flavonoids from chestnut flower were obviously stronger than those of the VCcontrol，and the flavonoids-purified sample exhibited the better scavenging·OH ability and total reducing power compared to the flavonoids-cruded sample.The highest scavenging ability on·OH and the strongest total reducing power were 0.605 and 94.97%，respectively.However，the scavenging ability of before or after flavonoids-purified samples on O2-· was less effective than that of VCcontrol.Furthermore，MTT data suggested that the purified flavonoids sample exhibited the powerful cytotoxic activity on Hela cells which appeared to be concentration dependent，and the highest inhibitory cellular viability was 81%within the experimental concentration.Therefore，the flavonoids from chestnut flower had the stronger antioxidant activity and inhibit the growth of Hela cells，and those findings provided the data to support for the comprehensively utilizating and developing chestnut flower.

chestnut flower；flavonoids；antioxidant activity；Hela；cellular viability

TS255.1

A

1002-0306（2015）14-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.026

2014－09－26

陳亞藍（1991-），女，碩士研究生，研究方向：天然活性物質的研究與開發。

王雪青（1964-），女，博士，教授，研究方向：天然活性物質的研究與開發。

天津市高等學校創新團隊建設規劃資助項目（TD12-5049）；天津市高校科技發展基金資助項目（20120603）；唐山遷西縣板栗產業研究發展中心資助項目（G11034）。