白地霉發酵過程中菌體量檢測方法的研究

張良雨，趙強強，郝靈珍，劉祝兵，管　　斌，*，孔　青，范金石

（1．中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2．青島科技大學化工學院，山東青島266042）

白地霉發酵過程中菌體量檢測方法的研究

張良雨1，趙強強1，郝靈珍1，劉祝兵2，管斌1，*，孔青1，范金石2

（1．中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2．青島科技大學化工學院，山東青島266042）

探討了白地霉發酵過程中菌體量的檢測方法，對白地霉的細胞組分麥角固醇和氨基葡萄糖，能否作為菌體量檢測指標的可行性進行了比較分析。結果表明：氨基葡萄糖在白地霉細胞中的含量較為穩定，在不同的培養時間、培養條件和培養基中都有較好的穩定性，可以作為白地霉菌體量的檢測指標；麥角固醇受培養時間和培養基成分的影響較大，含量不穩定，不太適合作為白地霉菌體量的檢測指標。用氨基葡萄糖法測得的白地霉生長曲線與用干重法測得的生長曲線變化一致，能夠較為準確地反映白地霉菌體量變化。將此方法應用到白地霉固態發酵中，可快速得到白地霉固態發酵過程中的菌體量變化，為以后固態發酵菌體量的測定提供了依據。

白地霉，菌體量，麥角固醇，氨基葡萄糖

白地霉（Geotrichum candidum）是一種常見真菌，形態特征介于酵母菌和霉菌之間，繁殖方式以裂殖為主，少數菌株間有芽生孢子。菌落呈絨毛狀或粉狀，韌或易碎，具有真菌絲，芽孢子單個或連接成鏈，長筒狀，也有些呈橢圓形［1］。白地霉生長適應性強，生長快，在多種介質中均能生長，菌體蛋白含量豐富，可用于優質的蛋白飼料及脂肪酶的發酵生產等。

菌體量是反映微生物生長情況的一項基本參數，通過測定其菌體量可了解發酵過程中微生物的生長及發酵狀況。與液態發酵相比，固態發酵具有投資少，易操作，后處理簡單，污染少，生長粗放，產量高等優點，因此受到國內外人士的廣泛青睞，成為發酵行業中廣泛應用的工藝類型之一。但白地霉，在固態基質中生長時，菌絲會深入培養基內部，與培養基緊密纏繞在一起，不易從底物中分離出來，所以很難直接測定其菌體量。為解決這一難題，通常采用間接法來進行微生物菌體量的測定。固態發酵中測定微生物菌體量的方法大致可分為以下4大類：a.直接從固態培養基中將菌體分離出來進行測定，如：直接計數［2］等；b.檢測細胞的代謝成分變化，如測定O2和CO2的代謝量［3-4］、測定胞外酶的活性［5］、測定ATP［6］、免疫活性等；c.測定營養物質的消耗，如干重損失法［7］等；d.測定細胞中的某些特殊組分，如幾丁質［8］、核酸［9］和蛋白質等。

目前國內外有關白地霉液態以及固態發酵菌體量的測定方法報道較少，綜合對液態和固態發酵生物量的研究結果，選用文獻中較為準確且易行的幾種方法：測定細胞中的特殊物質如麥角固醇［10］、氨基葡萄糖［11］等組分含量來推測微生物菌體量。麥角固醇，是存在于真菌細胞膜中的甾類化合物，是真菌中主要的固醇類物質，專一性很強。幾丁質是真菌細胞壁的主要成分，是一種由N-乙酰氨基葡萄糖通過α-1，4糖苷鍵連接而成的直鏈高分子聚合物。本文通過研究白地霉菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖含量與菌體量之間的關系，考察了培養時間、培養條件、培養基成分對其含量的影響，力求確定一種操作簡便、快速準確的測定白地霉菌體量或反映白地霉生長狀況的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白地霉（編號：2.0498 Geotrichum candidum） 中國微生物菌種保藏中心；菌種保藏培養基10°Brix麥芽汁1000mL，瓊脂20g，pH6.0；液態發酵培養基培養基Ⅰ：葡萄糖10g，MgSO4·7H2O 1g，KH2PO45g，酵母浸膏2g，尿素1g，加水定容至1L，pH6.0；培養基Ⅱ：10°Brix麥芽汁1000mL，pH6.0；固態發酵培養基處理秸稈∶麩皮∶豆粕=6∶3∶1，固液比1∶1.5；麥角固醇標準溶液、氨基葡萄糖標準溶液用Sigma公司提供的標準品配制；醇堿溶液50%KOH：無水乙醇（體積比2∶3）；正庚烷分析純；乙酰丙酮試劑3.5mL乙酰丙酮溶于50mL 1.2mol/L碳酸鈉溶液中，現用現配；對二甲氨基苯甲醛試劑1.333g對二甲氨基苯甲醛溶于25mL無水乙醇及25mL濃鹽酸的混合液中，棕色瓶保存，現用現配。

SPS202F型電子分析天平梅特勒-托利多稱重設備有限公司；ZDX-35BI型高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；DH4000AB型電熱恒溫培養箱、DL-I-15型高級臺式封閉電爐天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-C型水浴恒溫振蕩器上海躍進醫療器械廠；HWS-250型恒溫恒濕箱、DZF-6020型真空干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠；PHS-2F型pH計、722N型可見分光光度計上海精科電子有限公司；BCM-1000型超凈工作臺蘇凈集團安泰公司；LD5-10B型低速離心機北京雷勃爾離心機有限公司；UV-2802PC型紫外分光光度計尤尼克儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種培養方法斜面種子培養：將保存的白地霉菌種接入斜面麥芽汁培養基上，28℃下培養至菌苔長滿斜面，置冰箱中保存備用。

液態發酵培養：用生理鹽水沖洗斜面，并稀釋至孢子濃度為106～107cfu/mL（血球計數板計數）。在300mL三角瓶中加入100mL液體培養基Ⅰ，115℃滅菌30min后，接入白地霉孢子懸浮液5mL，30℃、180r/min恒溫振蕩培養48h。

固態發酵培養：在500mL三角瓶中加入固態培養基20g，滅菌后接入白地霉液體種子液2mL，30℃下恒溫靜置培養，每天搖動三角瓶以防止結塊。

1.2.2純菌絲體的獲得培養結束后，將發酵液抽濾，并用蒸餾水充分洗滌濾紙上的濾出物，收集濾出物，然后置60℃真空干燥箱內烘干至恒重，研缽研碎，置于干燥處保存備用。

1.2.3標準曲線的繪制

1.2.3.1麥角固醇標準曲線的繪制準確配制濃度為100μg/mL的麥角固醇標準溶液，稀釋成梯度溶液，用紫外分光光度計測其282nm處吸光值，繪制麥角固醇濃度與吸光值的標準曲線。

1.2.3.2氨基葡萄糖標準曲線的繪制準確配制濃度為100μg/mL的氨基葡萄糖標準溶液，稀釋成梯度溶液，各取2mL樣液（空白為蒸餾水），分別加入1mL乙酰丙酮試劑，沸水浴30min，冷卻后加入2mL無水乙醇、1mL對二甲氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4mL無水乙醇，60℃保溫1h，用可見分光光度計測其530nm處吸光值［12］，繪制氨基葡萄糖濃度與吸光值的標準曲線。

1.2.4微生物菌體量與麥角固醇以及氨基葡萄糖含量的關系

1.2.4.1菌體中麥角固醇含量與菌體量的關系準確稱取在同一培養條件下培養相同時間所得到的純菌體0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g，提取菌體中的麥角固醇并測其吸光值，計算不同質量菌體中麥角固醇的含量。

1.2.4.2菌體中氨基葡萄糖含量與菌體量的關系準確稱取在同一培養條件下培養相同時間所得到的純菌體0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g，提取菌體中的氨基葡萄糖并測其吸光值，計算不同質量菌體中氨基葡萄糖的含量。

1.2.5培養條件對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響

1.2.5.1培養時間對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響將白地霉接種于液體培養基Ⅰ中，30℃，180r/min下培養，每12h進行取樣分析，測定不同菌齡下白地霉單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.5.2搖床轉速對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響在液體發酵中，影響微生物生長的主要因素為培養過程中的溶氧量（與搖床轉速相關）［8］。為研究培養條件對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響，在此選擇不同的搖床轉速作為改變的培養條件進行實驗。在培養基Ⅰ中接種白地霉，選擇搖床轉速為160、180、200r/min，30℃培養48h后獲得純菌體，測定單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.5.3培養基對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響分別在培養基Ⅰ、培養基Ⅱ中接種等量的白地霉，30℃，180r/min下培養48h后獲得純菌絲體，測定單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖的含量。

1.2.6氨基葡萄糖含量與微生物菌體量的變化曲線

將白地霉接種于液體培養基Ⅰ中，30℃，180r/min下培養，每隔4h取樣，先通過抽濾烘干測其菌體干重，再檢測干燥后菌體中的氨基葡萄糖含量，根據氨基葡萄糖與菌體量的關系進而推算出白地霉的菌體干重，每組實驗做三次平行，取其平均值，通過兩種方法繪制生長曲線并比較兩條曲線的變化情況。

1.2.7白地霉固態發酵過程中菌體量的變化按10%的接種量，將液態培養24h的白地霉種子液接入固體培養基中，30℃恒溫靜置培養，每天提取固體培養基中的氨基葡萄糖含量，并計算白地霉菌體量，繪制白地霉固態發酵菌體量隨時間的變化曲線。

1.3測定方法

1.3.1麥角固醇的提取和測定按照張博潤等［13］的方法，并作出適當修改。準確稱取干菌體0.1g（空白不加）置于100mL磨口三角瓶中，加入20mL醇堿溶液，85～90℃水浴中皂化3h，室溫下冷卻，加入20mL正庚烷進行萃取，加瓶塞振蕩30s，靜置30min分層。取上清液0.5mL，加4.5mL 95%乙醇稀釋10倍，用紫外分光光度計測定282nm處的吸光值。其單位干菌體細胞中麥角固醇的含量計算公式如下：

式中：c—根據樣品在282nm處的吸收值，從標準曲線中獲得麥角固醇的濃度（μg/mL）；N—稀釋倍數；V—萃取液的體積（mL）；w—菌體干重（g）。

1.3.2氨基葡萄糖的提取和測定

1.3.2.1樣品預處理［14］準確稱取干菌體0.3g（干固態培養基0.6g），加2mL 60%H2SO4，25℃浸泡24h，稀釋至1mol/L H2SO4，置于250mL三角瓶中，9.8×104Pa高壓加熱1h，冷卻后用1mol/L NaOH中和至pH7，定容到100mL。

1.3.2.2測定方法［12］Elson-Morgan法用于測定游離的氨基糖，氨基糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原——2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原再與對二甲氨基苯甲醛在濃鹽酸乙醇溶液中生色，在530nm處有最大吸收值。取2mL樣液（空白為蒸餾水），加1mL乙酰丙酮試劑，沸水浴加熱30min，冷卻后加入2mL無水乙醇、1mL對二甲氨基苯甲醛試劑振蕩，再加入4mL無水乙醇，60℃保溫1h，530nm處測定吸光值。其單位干菌體細胞中氨基葡萄糖的含量為：

式中：c—根據樣品在530nm處的吸收值，從標準曲線中獲得氨基葡萄糖的濃度（μg/mL）；V—樣液的總體積（mL）；w—菌體干重（g）。

1.4數據統計分析

每組實驗做三個平行，結果均以均值±標準差表示，采用SPSS軟件對實驗數據進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），比較數據間的差異性是否顯著，顯著水平為p＜0.05。

2　結果與分析

2.1麥角固醇與氨基葡萄糖的標準曲線

麥角固醇含量的標準曲線如圖1所示。由此得到麥角固醇含量與光吸收值的函數關系：麥角固醇含量（μg/mL）=35.84×A282。

圖1　麥角固醇標準曲線Fig.1　Standard curve of ergosterol

氨基葡萄糖含量的標準曲線如圖2所示。由此得到氨基葡萄糖含量與光吸收值的函數關系：氨基葡萄糖含量（μg/mL）=113.64×A530。

圖2　氨基葡萄糖標準曲線Fig.2　Standard curve of glucosamine

2.2微生物菌體量與麥角固醇以及氨基葡萄糖含量的關系

一種細胞組分能否作為微生物菌體量的檢測指標，首要的條件就是其在細胞中的含量應與菌體量具有良好的線性關系。因此，首先對細胞中麥角固醇、氨基葡萄糖含量與菌體量的關系進行考察。

2.2.1菌體中麥角固醇含量與菌體量的關系由圖3可知，在同一培養條件下培養相同時間所得到的不同質量的白地霉菌體中，麥角固醇含量與菌體量之間呈現良好的線性關系，所得線性回歸方程為y= 3.106x-0.0314，相關系數R2=0.9962。

表1　培養時間對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 1　Effect of culture time on content of ergosterol and glucosamine

圖3　菌體生物量與麥角固醇含量的關系Fig.3　Correlation between mycelia biomass and ergosterol content

2.2.2菌體中氨基葡萄糖含量與菌體量的關系由圖4可知，在同一培養條件下培養相同時間所得到的不同質量的白地霉菌體中，氨基葡萄糖含量與菌體量之間呈現良好的線性關系，所得線性回歸方程為y=37.834x+0.0716，相關系數R2=0.9945。

圖4　菌體生物量與氨基葡萄糖含量的關系Fig.4　Correlation between mycelia biomass and glucosamine content

2.3培養條件對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響

一種細胞組分能否作為微生物菌體量的檢測指標，其在細胞中的含量與微生物菌體量僅有良好的線性關系還不夠，此組分在細胞中的含量還必須在微生物的整個生長周期內基本維持恒定，即與培養時間無關；而且在不同的培養條件下基本保持相同［15］。因此，接下來從培養時間、培養條件、培養基成分三方面對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的穩定性進行了驗證。

2.3.1培養時間對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響由表1可以看出，培養12h的菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量與其他數據相差較大，這可能是因為培養12h時白地霉菌絲體的量很少，通過過濾法收集菌體后烘干稱重所產生的相對誤差較大，故可以將此組數據舍去。將其余數據進行單因素方差分析，結果表明在檢驗水平α=0.05時，不同菌齡的白地霉單位菌體內麥角固醇含量差異顯著（p＜0.05），而單位菌體內氨基葡萄糖含量無顯著差異（p＞0.05），故可認為菌齡對白地霉單位菌體內麥角固醇含量有較大影響，而對單位菌體內氨基葡萄糖含量影響不大。

2.3.2搖床轉速對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響溶氧量是影響微生物生長的主要因素，通過改變搖床轉速來改變溶氧量，探究不同培養條件下單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖含量的變化。將表2數據進行單因素方差分析，結果表明在檢驗水平α=0.05時，不同搖床轉速下，白地霉單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖的含量均無顯著差異（p＞0.05），故可視作單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖含量在不同的搖床轉速下基本保持相同。

表2　搖床轉速對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 2　Effect of shaking speed on content of ergosterol and glucosamine

2.3.3培養基對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響培養基Ⅰ是以葡萄糖為碳源，尿素為氮源，添加營養鹽的合成培養基；培養基Ⅱ所采用的麥芽汁培養基為天然培養基，其主要成分來源于麥芽，兩種培養基的組成顯然不同。將表3數據進行單因素方差分析，結果表明在檢驗水平α=0.05時，對于不同的培養基組成，白地霉單位菌體內麥角固醇含量差異較為顯著（p＜0.05），而單位菌體內氨基葡萄糖含量無顯著差異（p＞0.05），因此可認為培養基成分的不同對單位菌體內氨基葡萄糖的含量幾乎沒有影響，而對單位菌體內麥角固醇含量的影響則相對要大。

綜合以上三個實驗的結果得出：氨基葡萄糖在白地霉菌體中的含量相對穩定，與菌齡、搖床轉速和培養基組成無關，可以作為衡量白地霉菌體量的檢測指標；而麥角固醇雖不受搖床轉速的影響，但受菌齡和培養基成分的影響較大，不適合作為白地霉菌體量測定的指標。

表3　培養基成分對菌體中麥角固醇和氨基葡萄糖含量的影響Table 3　Effect of different mediums on content of ergosterol and glucosamine

2.4氨基葡萄糖含量與微生物菌體量的變化曲線

由圖5可以看出，液體發酵后得到的白地霉純菌體，通過稱量不同培養時間的菌體干重繪制出來的生長曲線，與通過檢測培養不同時間菌體內氨基葡萄糖含量進而推算出的菌體干重變化趨勢一致，最大偏差為0.271g，可以認為，菌體中氨基葡萄糖的含量能夠較為準確地反映白地霉菌體量的變化。

圖5　白地霉實測菌體量和推算菌體量的變化曲線Fig.5　The changed curve of Geotrichum candidum actual biomass and calculated biomass

2.5白地霉固態發酵過程中菌體量的變化

白地霉在固態發酵過程中由于菌絲體與培養基纏繞在一起不容易直接測定，故在確定了其菌體量檢測方法之后，進行固態發酵時，便可利用氨基葡萄糖法測定其菌體量的變化情況，結果如圖6所示。

圖6　白地霉固態發酵過程中菌體量的變化Fig.6　Mycelia development of Geotrichum candidum during solid state fermentation process

由于氨基葡萄糖是真菌細胞壁的主要成分，固態基質中并不存在氨基葡萄糖，因此通過檢測培養基中的氨基葡萄糖含量，并根據公式來計算菌體量的方法是可行的。由圖6可以看出，在白地霉固態發酵過程中，前3d菌體生物量顯著增加，第3d菌體量達到最大，為0.2702g/g干物質，稍后基本保持恒定變化較小，第6d開始下降，這可能是由于營養物質被大量消耗，營養不足，導致菌體大量死亡，此種方法較好地反映了白地霉固態發酵過程中菌體量的變化，為解決固態發酵菌體量檢測困難的問題提供了依據。

3　結論

本文對白地霉細胞組分中的特殊物質——麥角固醇和氨基葡萄糖含量是否適合作為白地霉菌體量的檢測指標進行了一系列研究，最終得出了較為準確的白地霉菌體量檢測方法。

3.1不同質量的白地霉菌體中，麥角固醇和氨基葡萄糖含量與菌體量呈現良好的線性關系，相關系數均達到0.99以上。

3.2通過檢驗白地霉單位菌體內麥角固醇和氨基葡萄糖含量的穩定性，得到白地霉菌體量的檢測指標。單位菌體內氨基葡萄糖在白地霉生長過程中較為穩定，不受培養時間、培養基成分、搖床轉速的影響，適合作為白地霉菌體量的檢測指標；而單位菌體內麥角固醇受培養時間和培養基成分的影響較大，即不同菌齡和在不同培養基中生長的白地霉，其單位菌體內麥角固醇含量波動較大，不適宜作為白地霉菌體量的檢測指標。

3.3利用氨基葡萄糖法測得的白地霉菌體量與干重法測得的菌體量變化趨勢相同，兩種方法較為一致地顯示了白地霉在生長過程中菌體量的變化情況，因此菌體中氨基葡萄糖含量能夠較好地反映白地霉的生長狀況。

3.4將此方法應用到白地霉固態發酵過程中，通過檢測固體培養基中的氨基葡萄糖含量間接得到微生物菌體量，實驗結果顯示，在第3d菌體量達到最大，

為0.2702g/g干物質，說明氨基葡萄糖法檢測白地霉固態發酵菌體量是可行的。

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Study on Geotrichum candidum biomass detection methods in fermentation process

ZHANG Liang-yu1，ZHAO Qiang-qiang1，HAO Ling-zhen1，LIU Zhu-bing2，GUAN Bin1，*，KONG Qing1，FAN Jin-shi2
（1．College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2．College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science&Technology，Qingdao 266042，China）

The detection methods of Geotrichum candidum biomass in its fermentation process were discussed in this study.The feasibility of whether the cell components in Geotrichum candidum-ergosterol and glucosamine could be used as indicators for biomass estimation in fermentation was examined and analyzed.The experimental results showed that glucosamine could be a good biomass indicator as it remained constant in cells with the changes of culture time，culture condition and medium.Ergosterol amount changed with the different culture time and medium type；therefore，it could not accurately represent the changes of biomass.The growth curve of Geotrichum candidum measured by glucosamine method was in accordance with the growth curve by dry weight，so it could be able to reflect the changes of Geotrichum candidum biomass accurately.This method was also applied to the process of solid-state fermentation，getting the variation of Geotrichum candidum biomass in its process of solid-state fermentation quickly.So in solid-state fermentation，glucosamine could be used as the indicator to calculate Geotrichum candidum biomass indirectly，which provided the basis for biomass detection in solid-state fermentation.

Geotrichum candidum；biomass；ergosterol；glucosamine

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.030

2014－10－13

張良雨（1990-），女，碩士研究生，主要從事發酵工程方面的研究。

管斌（1957-），男，博士，教授，主要從事發酵工程方面的研究。

“十二五”農村領域國家科技計劃（2013BAD10B02-06）；青島市公共領域科技支撐計劃項目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物發酵工程國家重點實驗室開放課題（K2012002）。