pfs基因原核表達載體的構(gòu)建、表達及蛋白純化

孟祥晨，楊　杰，趙日紅，胡子毅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

pfs基因原核表達載體的構(gòu)建、表達及蛋白純化

孟祥晨，楊杰，趙日紅，胡子毅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

以植物乳桿菌KLDS1.0391的基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增得到pfs基因，與GenBank中的序列對比發(fā)現(xiàn)同源性為99%。將目的基因與表達載體pQE-30連接，并將重組質(zhì)粒pQE-30-pfs轉(zhuǎn)化到E.coli M15中。異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，在全菌體蛋白中含有一條明顯的特異性蛋白條帶，大小約為27.4ku。經(jīng)Ni-NTA純化系統(tǒng)純化后，在SDS-PAGE凝膠電泳圖上獲得純化產(chǎn)物的條帶。結(jié)果表明，原核表達載體pQE-30-pfs構(gòu)建成功，且Pfs蛋白在大腸桿菌中成功表達，采用Ni-NTA純化系統(tǒng)成功純化了重組蛋白Pfs，為體外合成AI-2（Autoinducer-2）奠定了基礎(chǔ)。

pfs基因，重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達，重組蛋白Pfs

細菌中存在各種小分子物質(zhì)介導(dǎo)的胞內(nèi)、胞外信號傳遞，細菌通過各種小分子物質(zhì)感知胞外的環(huán)境和胞內(nèi)的生理狀態(tài)，進而對感知到的變化做出針對性的反應(yīng)［1］。群體感應(yīng)是細菌胞外信號傳遞的主要方式之一，是細菌之間信息交流機制的一種。細菌可以產(chǎn)生一種被稱為自誘導(dǎo)物（autoinducers，AI）的信號分子，信號分子從胞內(nèi)擴散到胞外，其濃度隨菌體密度而改變，細菌通過檢測信號分子的濃度來監(jiān)測環(huán)境中種間、種內(nèi)的細菌群體密度以及所處的環(huán)境狀況，并調(diào)控相對基因的表達［2-3］。根據(jù)細菌合成的信號分子和感應(yīng)機制不同，群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing system，QS系統(tǒng)）主要分為三種：革蘭氏陰性菌的AHL-LuxI/LuxR系統(tǒng)，革蘭氏陽性菌的寡肽類信號分子介導(dǎo)的雙組份系統(tǒng)，以及存在于革蘭氏陽性和陰性菌中的LuxS/AI-2依賴性QS系統(tǒng)［4-6］。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均可以產(chǎn)生AI-2，并且細菌對其他種屬細菌產(chǎn)生的AI-2同樣可以感知，因此AI-2是一種用于種間信息交流的主要小分子物質(zhì)［7-9］。

AI-2信號分子最先在哈氏弧菌（V.harveyi）中被發(fā)現(xiàn)，其分子結(jié)構(gòu)是一種呋喃酰硼酸二酯類化合物［10］。目前發(fā)現(xiàn)，所有的產(chǎn)AI-2菌中的AI-2合成途徑都是相同的，都是來源于S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）代謝［11-12］。合成過程中SAM作為一種甲基供體產(chǎn)生有毒的中間產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），SAH隨即被Pfs水解為S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH），LuxS催化SRH產(chǎn)生4，5-二羥基-2，3-戊二酮（4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，DPD），DPD自動分子重排，形成具有一定特異性且具有活性的AI-2分子［13］。

pfs基因是合成AI-2信號分子的重要基因，所表達的Pfs蛋白是AI-2合成途徑中不可缺少的催化劑，它可以催化SAH產(chǎn)生SRH，為合成AI-2提供物質(zhì)基礎(chǔ)。Schauder［14］、Sperandio等［15］擴增E.coli MG1655的luxS基因和pfs基因，并與表達載體連接，在大腸桿菌中成功表達LuxS蛋白和Pfs蛋白，并體外合成AI-2。以上文獻說明，Pfs蛋白可以外源表達，并能夠保持其原有的生物活性。pfs基因具有保守性，本研究擬根據(jù)文獻和GenBank中已登錄的植物乳桿菌JDM1中的pfs基因的全序列設(shè)計引物，對植物乳桿菌KLDS1.0391中的pfs基因進行克隆，并構(gòu)建原核表達載體pQE-30-pfs。利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達Pfs蛋白，并對其進行純化，為體外合成AI-2奠定基礎(chǔ)。同時為進一步研究AI-2對植物乳桿菌KLDS1.0391產(chǎn)細菌素的影響，以及AI-2對植物乳桿菌的其他生理功能調(diào)節(jié)的研究提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

測序載體pMD18-Tsimple、植物乳桿菌KLDS1.0391、大腸桿菌JM109本實驗室保存；表達質(zhì)粒pQE-30黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)郭東華老師惠贈；大腸桿菌M15感受態(tài)細胞上海顯益化學(xué)科技有限公司；Taq DNA polymerase、Prime STARTM HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ、T4DNA Ligase、低分子量蛋白Marker、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒TaKaRa公司；細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA片段純化試劑盒天根生化科技有限公司。

UVP凝膠成像系統(tǒng)儀美國UVP公司；蛋白質(zhì)電泳儀美國Bio-Rad公司；CHB-100恒溫金屬浴杭州博日科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1pfs基因的克隆及純化根據(jù)文獻和GenBank中已登錄的植物乳桿菌JDM1中的pfs基因的全序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物。pfs-1：5′-ATGAAATTTGG AATTATTTGTGCGA-3′，pfs-2：5′-CTAATTTTGCGC CGCAAATAATGCA-3′。以植物乳桿菌KLDS1.0391的基因組DNA為模板，用引物pfs-1和pfs-2擴增pfs基因。PCR擴增體系為50μL，反應(yīng)體系為：上下游引物（10μmol/L）分別2μL，DNA模板1μL，Taq DNA polymerase（2.5U/μL）0.5μL，10×Taq DNA polymerase Buffer（含Mg2＋）5μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，ddH2O 35.5μL。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒回收純化目的片段。將純化的目的片段與克隆載體pMD 18-T simple連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-1，并轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中。在含有60μg/mL Amp（氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上挑取陽性克隆菌落，用引物pfs-1和pfs-2進行菌落PCR驗證，退火溫度為54℃。將鑒定正確的陽性克隆菌液送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，并進行同源性分析。

1.2.2重組質(zhì)粒pMD18-T simple-pfs-2的構(gòu)建及鑒定根據(jù)測序得出的植物乳桿菌KLDS1.0391的pfs基因序列和表達質(zhì)粒pQE-30酶切位點的選取，在pfs基因上下游分別加入BamHⅠ和KpnⅠ兩個限制性酶切位點，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物。pfs-3：5′-CGGGATCCATGAAATTTGGAATTATTTGTGCGA-3′，pfs-4：5′-GGGGTACCCTAATTTT GCGCCGCAAATA ATGCA-3′。參照1.2.1中PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，采用Prime STARTMHS DNA Polymerase（2.5U/μL），退火溫度65℃，以植物乳桿菌KLDS1.0391基因組DNA為模板，用引物pfs-3和pfs-4擴增pfs基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒回收純化目的片段。將得到的pfs片段3′端加A并純化回收，將其與克隆載體pMD 18-T simple連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2，并轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中。在含有60μg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基上挑取陽性克隆菌落，用引物pfs-3和pfs-4進行菌落PCR驗證，退火溫度為65℃。提取重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2用BamHⅠ和KpnⅠ進行分步酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆菌液送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.2.3重組表達質(zhì)粒pQE-30-pfs的構(gòu)建及鑒定提取重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2，分別對重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2和質(zhì)粒載體pQE-30，用BamHⅠ和KpnⅠ進行分步酶切，采用瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒回收pfs基因和pQE-30質(zhì)粒片段。將回收的pfs基因與pQE-30質(zhì)粒片段連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pQE-30-pfs，并轉(zhuǎn)化到E.coli M 15中。在含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana（卡那霉素）的LB固體培養(yǎng)基上挑取陽性克隆菌落，用引物pfs-3和pfs-4進行菌落PCR驗證，退火溫度為65℃。提取重組質(zhì)粒pQE-30-pfs用BamHⅠ和KpnⅠ進行分步酶切鑒定。將鑒定正確的陽性克隆菌液送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.2.4重組蛋白Pfs的誘導(dǎo)表達及存在形式的檢測

將含有重組質(zhì)粒pQE-30-pfs的E.coli M15單菌落接種到5mL含100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基中，37℃、150r/min搖床培養(yǎng)12h；將培養(yǎng)12h的菌液按1%接種量接種至LB培養(yǎng)基（添加100μg/mL Amp和25μg/mL Kana）中，37℃、150r/min培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～0.8，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導(dǎo)表達，37℃、150r/min誘導(dǎo)12h后，6000r/min離心10min收集菌體，用PBS緩沖液漂洗菌體2次，將菌體重懸于1/10原體積的PBS緩沖液中，加入溶菌酶（終濃度為1mg/mL）、苯甲基磺酰氟（PMSF，終濃度為100μg/mL），于37℃、150r/min振蕩孵育1h，然后液氮反復(fù)凍融3次裂解菌體（每次在液氮中冷凍3min后，置于37℃水浴融化）；14000r/min、4℃離心10min，分別收集上清和沉淀，沉淀用PBS緩沖液漂洗2次后重懸于原體積的PBS緩沖液中，將上清和沉淀進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。

1.2.5重組蛋白Pfs的純化按1.2.4所述方法收集重組蛋白溶液，參照Ni-NTA Purification System說明書對重組蛋白Pfs進行純化，用4mL含250mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH8.0）洗脫Pfs蛋白。將洗脫液密封于透析袋（截留分子量3500u）中，置于10mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）中透析過夜，期間更換幾次透析液。將透析過的蛋白溶液用超濾管（截留分子量3ku，Millipore）進行濃縮5～10倍，采用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。在10mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH7.5）中添加1mmol/L的SAH、1mg/mL的Pfs蛋白和1mg/mL的LuxS蛋白［16］，37℃水浴1h，用超濾管（截留分子量3ku，Millipore）濾除蛋白，收集濾液，用哈氏弧菌BB170報告菌株檢測AI-2生物活性［17］，以哈氏弧菌BB120無細胞培養(yǎng)上清作為陽性對照，10mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）作為陰性對照，將陽性對照中AI-2活性定義為100%。

2　結(jié)果與分析

2.1pfs基因的克隆及純化

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出的DNA片段在約700bp處形成單一條帶（圖1）。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-1，經(jīng)含有60μg/mL Amp的LB抗性平板篩選，得到少量成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-1的陽性克隆菌落。挑取陽性克隆菌落，進行菌落PCR驗證，正確克隆的PCR產(chǎn)物大小與目的基因一致，約為700bp（圖2泳道5和泳道8）。選取正確的陽性克隆菌液送至華大基因進行測序，測序結(jié)果為693bp（GenBank序列號為KC894518），與GenBank中提交的植物乳桿菌的pfs基因進行Blast分析，結(jié)果表明，植物乳桿菌KLDS1.0391與植物乳桿菌JDM1（GenBank序列號為CP001617.1）和植物乳桿菌WCFS1（GenBank序列號為AL935263.2）中的pfs基因的相似性高達99%。

圖1　pfs基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1　PCR production of pfs gene

圖2　陽性克隆的PCR鑒定Fig.2　PCR identification of positive clones

圖3　pfs基因的PCR擴增結(jié)果（A）和目的基因PCR產(chǎn)物的純化（B）Fig.3　PCR production of pfs gene（A）and Purification of PCR products of the target gene（B）

圖4　陽性克隆的PCR鑒定Fig.4　PCR identification of positive clones

圖5　重組質(zhì)粒pMD18-T simple-pfs-2雙酶切鑒定結(jié)果Fig.5RecombinantpMD18-Tsimple-pfs-2byBamHⅠandKpnⅠ

2.2重組質(zhì)粒pMD18-T simple-pfs-2的構(gòu)建及鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，擴增出的DNA片段在約700bp處形成單一條帶（圖3A），與理論大小相符。PCR產(chǎn)物割膠回收純化后，在3′端加A并純化，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得與PCR產(chǎn)物大小一致的單一目的條帶（圖3B）。構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2，經(jīng)含有60μg/mL Amp的LB抗性平板篩選，得到少量成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2的陽性克隆菌落。挑取陽性克隆菌落，進行菌落PCR驗證，正確克隆的PCR產(chǎn)物大小與目的基因一致，約為700bp（圖4泳道1和泳道2）。重組質(zhì)粒pMD 18-T simple-pfs-2經(jīng)BamHⅠ第一步酶切后得到約3400bp的片段（圖5A），經(jīng)KpnⅠ第二步酶切后得到約2700bp的線性pMD 18-T simple和約700bp的目的基因片段（圖5B），結(jié)果與理論相符。選取正確的陽性克隆菌液送至華大基因進行測序（結(jié)果略），測序結(jié)果與前期結(jié)果一致。

2.3重組表達質(zhì)粒pQE-30-pfs的構(gòu)建及鑒定

將回收的pQE-30片段和pfs基因連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pQE-30-pfs，并轉(zhuǎn)化到E.coli M15中。經(jīng)含有100μg/mL Amp和25μg/mL Kana的LB抗性平板篩選，得到少量陽性克隆菌落。挑取陽性克隆菌落，進行菌落PCR驗證，獲得3個擴增出約700bp特異性條帶的陽性克隆（圖6泳道1、2和4）。重組表達質(zhì)粒pQE-30-pfs經(jīng)BamHⅠ第一步酶切后得到約4200bp的片段（圖7A），經(jīng)KpnⅠ第二步酶切后得到約3500bp的線性pQE-30和約700bp的pfs基因片段（圖7B），結(jié)果與理論相符。將鑒定正確的陽性克隆菌液送至華大基因進行測序（結(jié)果略），測序結(jié)果與前期結(jié)果一致。

2.4重組蛋白Pfs的誘導(dǎo)表達及存在形式的檢測

SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果顯示（圖8），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體蛋白在約27.4ku處出現(xiàn)一條蛋白條帶（泳道2），與預(yù)計大小吻合，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空白對照沒有此條帶，說明重組蛋白Pfs成功表達。同時菌體裂解上清出現(xiàn)清晰的目的蛋白條帶（泳道4），沉淀中只有少量目的蛋白殘留（泳道3），表明重組蛋白Pfs以可溶性蛋白形式存在。

圖6　菌落PCR鑒定陽性克隆Fig.6　Colony PCR identification of positive clones

圖7　重組質(zhì)粒pQE-30-pfs雙酶切鑒定結(jié)果Fig.7　Recombinant pQE-30-pfs by BamHⅠand KpnⅠ

圖8　重組蛋白Pfs存在形式的檢測Fig.8　Detection of the form of recombinant protein Pfs

2.5重組蛋白Pfs的純化

采用Ni-NTA Purification System對重組蛋白Pfs進行純化，用4mL含250mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH8.0）洗脫Pfs蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果（圖9）顯示，誘導(dǎo)表達并純化得到重組蛋白Pfs，經(jīng)透析、濃縮后對Pfs蛋白濃度進行測定，獲得的重組蛋白濃度為6.71mg/mL。

圖9　重組蛋白Pfs的誘導(dǎo)表達與純化Fig.9　Inducted expression and purification of the recombinant protein Pfs

2.6重組蛋白Pfs的活性檢測

以SAH為底物，經(jīng)Pfs和LuxS蛋白催化，合成了具有生物活性的AI-2（圖10），體外合成的AI-2活性約為陽性對照的6倍，說明純化得到的重組蛋白Pfs具有生物活性。

圖10　AI-2生物活性的測定Fig.10　Determination of AI-2 activity

3　討論

AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)同時存在于革蘭氏陽性和陰性菌中。目前認為，AI-2在細菌種群間交流中起通用信號分子的作用，其介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)參與細菌的多種代謝調(diào)節(jié)。Barrios等［18］研究發(fā)現(xiàn)Escherichia coli的生物膜形成與AI-2有關(guān)；Lyon［19］、Ohtani等［20］研究發(fā)現(xiàn)LuxS/AI-2系統(tǒng)對Streptococcus pyogenes、Clostridium perfringens中的毒素和毒性起到調(diào)節(jié)作用。但是這些研究多集中在致病菌方向，而對乳酸菌中的AI-2系統(tǒng)研究相對較少。為研究AI-2系統(tǒng)對植物乳桿菌KLDS1.0391中細菌素產(chǎn)量的調(diào)節(jié)作用，本研究根據(jù)植物乳桿菌JDM1中pfs基因全序列設(shè)計引物，成功擴增出植物乳桿菌KLDS1.0391的pfs基因，Blast比對分析顯示了pfs基因與其他植物乳桿菌中pfs基因的高度同源性。

考慮植物乳桿菌KLDS1.0391的pfs基因序列和載體上存在的酶切位點，最終選擇表達載體為pQE-30，且載體宿主細胞為E.coli M15，成功表達了重組蛋白Pfs。外源蛋白質(zhì)在宿主菌中進行表達時多以包涵體的形式存在［21］，而本研究中的重組Pfs蛋白則以可溶性蛋白形式存在，這可能與Pfs蛋白的結(jié)構(gòu)以及結(jié)合了6×His標(biāo)簽有關(guān)，因為研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源融合蛋白與特定的標(biāo)簽相結(jié)合，可以有效地增加重組蛋白的表達量，且融合標(biāo)簽可增強重組蛋白質(zhì)的可溶性［22］。本研究中菌體裂解后的沉淀中仍有少量目的蛋白殘留，這可能是有少量菌體未裂解完全所致。S-腺苷高半胱氨酸（SAH）經(jīng)Pfs和LuxS催化生成DPD，進而DPD分子重排形成具有生物活性的AI-2信號分子。Han等［12］單獨用Pfs蛋白或LuxS蛋白催化SAH體外合成AI-2，未檢測到具有生物活性的AI-2；使用Pfs和LuxS蛋白催化SAH體外合成AI-2，檢測到具有活性的AI-2。這些研究表明Pfs蛋白和LuxS蛋白是以SAH為底物合成AI-2的所必需的關(guān)鍵酶。本研究中采用純化得到的重組蛋白Pfs和LuxS蛋白成功合成了具有生物活性的AI-2，表明了本研究得到的重組蛋白Pfs具有生物活性。重組蛋白Pfs的成功表達及純化為體外合成AI-2奠定了基礎(chǔ)，為進一步研究AI-2對植物乳桿菌KLDS1.0391細菌素產(chǎn)量的調(diào)控以及其他生理功能的調(diào)節(jié)提供了技術(shù)支撐。

4　結(jié)論

成功構(gòu)建了pQE-30-pfs原核表達載體，并成功誘導(dǎo)表達了重組蛋白Pfs。采用Ni-NTA Purification System對重組蛋白純化，得到純化的Pfs蛋白。重組蛋白Pfs分子量為27.4ku。

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Construction and expression on prokaryotic expression vector of pfs gene together with recombinant protein purification

MENG Xiang-chen，YANG Jie，ZHAO Ri-hong，HU Zi-yi
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The pfs gene was amplified by polymerase chain reaction（PCR）using the DNA of Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 as template in this study.The nucleotide sequence of the cloned DNA shared 99% homology with pfs gene from Lactobacillus plantarum JDM1 and WCFS1.The target gene was connected with expression vector pQE-30 and the recombinant plasmid pQE-30-pfs was transformed into E.coli M15.The recombinant expressed proteins induced by IPTG were analyzed and identified with SDS-PAGE.SDS-PAGE results showed that there was one main protein band with molecular weight 27.4ku in the total protein.The recombinant protein was purified using Ni-NTA Purification System and identified with SDS-PAGE.The results showed that the prokaryotic expression vector pQE-30-pfs was constructed successfully.Pfs protein was expressed successfully in E.coli M15.Recombinant protein Pfs was purified successfully using Ni-NTA Purification System.This results will be helpful for the synthesis of AI-2 in vitro.

pfs gene；recombinant plasmid；induced expression；recombinant protein Pfs

TS201.3

A

1002-0306（2015）14-0239-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.041

2014－10－31

孟祥晨（1970-），女，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（重點）項目計劃（12521Z002）。