循環逆流提取發芽糙米γ-氨基丁酸工藝條件優化

馬　濤，劉利霞，趙　旭，王　勃，劉　賀，惠麗娟，何余堂

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866；3.遼寧省糧食科學研究所，遼寧沈陽110866）

循環逆流提取發芽糙米γ-氨基丁酸工藝條件優化

馬濤1，劉利霞2，趙旭3，王勃1，劉賀1，惠麗娟1，何余堂1

（1.渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866；3.遼寧省糧食科學研究所，遼寧沈陽110866）

以水為提取溶劑，采用實驗室模擬動態逆流提取工藝，并通過響應面實驗設計方法對發芽糙米γ-氨基丁酸（GABA）的提取工藝條件進行優化。結果表明：提取溫度51℃、單級提取時間59min、液料比5.9∶1（mL/g），提取級數3級，在此條件下，發芽糙米GABA提取率可達到89.35%。

發芽糙米，γ-氨基丁酸，逆流提取，條件優化

γ-氨基丁酸（GABA）是廣泛分布于動植物中的一種非蛋白質氨基酸，糙米在發芽過程中谷氨酸在內源谷氨酸脫羧酶作用下會轉化為GABA，其含量成倍增加［1］。GABA具有改善腦機能、調整血壓、促進生長激素分泌，以及保護肝臟等功能［2］。同時，GABA作為一種天然的食品加工原料被廣泛應用［3］，因此，發芽糙米及其生理活性物GABA受到國內外廣泛的關注。

連續循環逆流提取技術是一種集萃取、重滲透、動態、逆流為一體的新型提取技術［4］。動態逆流提取逐漸取代了傳統的分批提取過程，其優勢在于降低溶劑消耗、縮短處理時間、減少成本［5-7］；與傳統的提取方法相比，具有經濟、安全等特點［8］。本實驗采用實驗室模擬工業生產中連續式逆流提取方法，以水為提取溶劑，并通過Box-Behnken響應面法對發芽糙米提取GABA工藝條件進行了優化，為實現GABA提取工業化提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

糙米市購，經發芽［9］干燥、微粉碎后備用；γ-氨基丁酸（GABA）標品（純度＞99%） Sigma公司；次氯酸鈉分析純，有效氯為9%，天津市致遠化學試劑有限公司；重蒸苯酚分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；硼酸、無水乙醇分析純，國藥集團化學試劑有限公司；谷氨酸鈉（味精）谷氨酸鈉＞99%，無鹽，北京市朝陽區中聯化工試劑廠。

HH-601A型超級恒溫水浴鍋江蘇省金壇市醫療儀器廠；HPX-9082ME型電熱恒溫培養箱、DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；RRH-A500型高速多功能粉碎機海緣沃工貿有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計日本島津Shimadzu公司；SC-279GA型海爾冰柜海爾公司；AR224CN型電子天平上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1循環逆流法提取發芽糙米GABA工藝

圖1　實驗室模擬動態逆流提取GABA示意圖Fig.1　The schematic diagram of GABA extraction using laboratory simulation dynamic countercurrent method

由圖1可見，逆流法提取發芽糙米GABA工藝流程是：新鮮溶劑水從第一級進入逆流體系，對第2級排出的渣2進行提取，提取后的渣1排出體系；去除沉淀后的水1進入第2級，對第3級排出的渣3進行提取；分離得到的水2進入第3級，對第4級的渣4進行提取；以此類推，最后水相N-1進入N級對原料進行提取，排出的渣N-1進入N-1級，而去除沉淀后的水相N即為所需的發芽糙米GABA提取液［10］。

1.2.2發芽糙米的制備精選顆粒飽滿、成熟高的糙米原料，每份稱取10g，并用20mL蒸餾水清洗3遍，然后用1%的次氯酸鈉溶液浸泡5min（加入量以剛好淹沒糙米為宜），消毒之后每份用20mL清水清洗3遍，然后用20mL蒸餾水清洗3遍，于30℃水浴鍋中浸泡12h，30℃恒溫培養箱中培養發芽28h，發芽結束后，用去離子水清洗，于55℃烘箱中終止活性、干燥5h，于4℃冰箱保存備用［9］。

1.2.3GABA檢測方法

1.2.3.1GABA標準曲線的制作準確稱取濃度為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mg/mL的γ-氨基丁酸標準溶液分別取0.5mL，加入0.2mL硼酸緩沖溶液（pH9.0），1mL濃度為6g/100mL的重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量10%的次氯酸鈉溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即冰浴20min，并不斷振蕩，待出現藍綠色后加入2mL體積分數60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長處測定其吸光度，以濃度為橫坐標x，吸光度為縱坐標y，繪制標準曲線。

1.2.3.2樣品GABA含量的檢測將干燥后的發芽糙米粉碎過60目篩，稱取10g發芽糙米粉，用水進行逆流提取，過濾后，取濾液，即GABA粗提液。取上清液0.5mL，加入0.2mL硼酸緩沖溶液（pH9.0），1mL濃度為6g/100mL的重蒸苯酚溶液，0.4mL有效氯含量10%的次氯酸鈉溶液，充分振蕩，置于沸水浴10min，再立即冰浴20min，并不斷振蕩，待出現藍綠色后加入2mL體積分數60%的乙醇溶液，再次振蕩均勻，靜置后于645nm波長處測定其吸光度［11］。

1.2.3.3GABA提取率的計算方法

GABA提取率（%）=WE/WO×100

式中：WE為原料浸出的可溶性固形物量（g）；WO為原料中可溶性固形物含量（g）。

1.2.4單因素實驗以水為提取溶劑，準確稱取10g/份發芽糙米粉，考察提取溫度、提取時間、液料比以及提取級數四個因素對發芽糙米GABA提取率的影響，每次實驗均重復3次。

以水為提取溶劑，設定液料比為6∶1，提取級數為3級，分別在20、30、40、50、60、70℃條件下逆流提取60min，以GABA提取率為響應值，重復3次。

以水為提取溶劑，設定液料比為6∶1，提取級數為3級，分別在50℃條件下逆流提取30、60、90、120、150min，以GABA提取率為響應值，重復3次。

以水為提取溶劑，按液料比為4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、10∶1mL/g，在50℃條件下逆流提取60min，提取級數為3級，以GABA提取率為響應值，重復3次。

以水為提取溶劑，設定液料比為6∶1，在50℃逆流提取60min，對發芽糙米GABA分別進行了5級提取，以GABA提取率為響應值，重復3次。

1.2.5響應面法優化逆流提取發芽糙米GABA工藝條件在單因素實驗基礎上，利用Design-Expert（version 8.0.6）軟件以提取溫度、提取時間、液料比及提取級數為考察變量，分別以A、B、C、D表示，以γ-氨基丁酸提取率Y為響應值，其中以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平［12］，各因素及水平編碼如表1所示。

表1　Box-Behnken實驗因素及水平編碼Table 1　Four main induction conditions and their levels for Box-Behnken design

1.2.6數據分析運用Design-Expert軟件（Version 8.0.6）對響應面實驗所得數據進行線性回歸和方差分析，模型和因素的顯著性以F值進行考察（p＜0.05），每次實驗均重復3次。

2　結果與討論

2.1GABA標準曲線結果

根據1.2.3.1方法繪制GABA標準曲線如圖2所示，得到的GABA標準曲線的回歸方程為y=0.4154x+ 0.1020，R2=0.9987。

圖2　γ-氨基丁酸的標準曲線Fig.2　Standard curve of γ-aminobutyric acid

2.2單因素實驗結果

2.2.1提取溫度對發芽糙米GABA提取率的影響由圖3可知，隨著提取溫度的升高，發芽糙米GABA提取率呈現先上升后下降的趨勢，溫度升高，溶劑的傳質動力增加，使得物質的提取率上升，在50℃時提取率達到最大；之后隨著提取溫度的增加，發芽糙米發生糊化現象，而且高溫會破壞熱敏性物質的結構，本實驗取50℃為最佳提取溫度。

圖3　提取溫度對發芽糙米GABA提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on extraction rate of GABA

2.2.2提取時間對發芽糙米GABA提取率的影響由圖4可知，發芽糙米GABA提取率隨著提取時間的延長先增加后降低，在60min內提取率最大，原因是隨著提取時間的增加，溶劑粘度下降，析出的物質含量降低。從操作費用和能源消耗上考慮，60min為發芽糙米GABA最佳提取時間。

圖4　提取時間對發芽糙米GABA提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on extraction rate of GABA

2.2.3液料比對發芽糙米GABA提取率的影響從圖5可知，隨著液料比的增加，GABA的提取量在不斷的增高，這是因為增加液料比，傳質動力增加，GABA就更容易溶出，損失減少［13］，考慮經濟效益，本實驗選取最佳提取液料比為6∶1。

2.2.4提取級數對發芽糙米GABA提取率的影響由圖6可知，GABA提取率在3級時達到最大值，之后提取率趨于平緩，原因是新物料的加入會大量的吸水，當達到一定級數時，提取液中GABA含量達到飽和，提取率下降，本實驗發芽糙米逆流提取GABA最佳提取級數確定為3級。

圖5　液料比對發芽糙米GABA提取率的影響Fig.5　Effect of liquid/material ratio on extraction rate of GABA

圖6　提取級數對發芽糙米GABA提取率的影響Fig.6　Effect of extraction numbers on extraction rate of GABA

2.3響應面分析法優化發芽糙米GABA提取工藝結果分析

2.3.1實驗因素水平編碼與實驗結果采用Design-Expert軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設計，依次進行提取實驗，以發芽糙米中GABA提取率為響應值（Y）進行響應面實驗，實驗設計及結果如表2所示。

2.3.2二次多項式回歸模型建立及統計分析應用Design-Expert 8.0軟件，對表2中的GABA提取率實驗數據進行多元回歸擬合分析，擬合后得到的關于提取溫度（A）、單級提取時間（B）、液料比（C）及提取級數（D）二次多項回歸方程為：

Y=88.24+3.44A+1.62B-2.47C-3.66D-2.57AB+ 3.69AC+2.28AD-5.16BC+7.12BD-1.51CD-9.13A2-11.21B2-8.35C2-5.40D2

方程中各項系數絕對值大小直接反映各因素對響應值的影響程度，系數的正、負反映影響的方向。由表3回歸方程的顯著性檢驗中可知，p值說明影響提取發芽糙米GABA的提取溫度、單級提取時間、液料比及提取級數各因素存在顯著性影響。因素提取溫度、料液比、提取級數的影響極顯著（p＜0.01）；交互項AB、AD影響顯著（p＜0.05），且交互項AC、BC、BD影響極顯著（p＜0.01）。綜合上述分析得知，各個因素對響應值的影響程度為：D（提取級數）＞A（提取溫度）＞C（液料比）＞B（單級提取時間）。

對回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗的結果見表4。由表4可知，該回歸整體模型顯著（Pr＞F值＜0.0001），失擬項不顯著（Pr＞F值=0.1064＞0.05），說明模型與實際擬合較好，能反應各因素對發芽糙米GABA逆流提取的影響效果，因此所得方程能夠預測響應值隨各參數的變化規律［14］，可用作發芽糙米提取GABA提取評定的理論基礎。

2.3.3響應面水平的分析與優化利用Design-Expert8.0軟件對回歸方程構建響應面分析圖，響應面分析圖是響應值對各實驗因子所構成的三維空間的曲面圖，從響應面分析圖上可以形象的看出最佳參數和各個參數之間的相互影響作用［15］。依回歸方程繪制的響應曲面和等高線圖如圖7～圖9所示。

表2　Box-Behnken實驗設計優化方案及結果Table 2　Optimization project design and experimental results of Box-Behnken design

表3　回歸方程的顯著性檢驗Table 3　Test of significance for regression equation

表4　逆流提取GABA提取率回歸模型的方差分析結果Table 4　Analysis of variance for regression equation of extraction rate of countercurrent extraction on GABA

圖7　提取溫度與液料比對GABA提取率影響的響應面圖Fig.7　Response surface plots of extraction temperature and liquid/material ratio on the GABA content

圖8　提取級數與單級提取時間對GABA提取率影響的響應面圖Fig.8　Response surface plots of extraction numbers and single stage extraction time on the GABA content

通過上述響應面圖可即可對任何兩個因素交互影響發芽糙米GABA提取率效應進行分析和評價。響應面坡度相對平緩，表示可以接受處理條件的變化［16］。圖7表示固定單級提取時間和提取級數，提取溫度與液料比對提取率的影響，在提取溫度為40～60℃，液料比為5∶1～7∶1時，提取率與單級提取時間和提取級數的增加而提高。根據圖8得知，提取率隨著單級提取時間與提取級數的增加而增加。圖9表示提取溫度50℃，提取級數3級時，發芽糙米GABA提取率逐漸的提高。由響應面的分析圖可知，回歸模型存在最大值，最高點位于實驗設計范圍內，結合回歸模型的數學分析，對回歸方程進行一階偏導并令等于零，得到響應曲面的最大值點［17］，整理得出最佳條件參數為A=51.4，B=59.3，C=5.9∶1，D=3。為檢驗RSM法的可靠性，采用上述最優提取條件對發芽糙米GABA進行提取實驗，考慮到實際操作簡便，將GABA的最佳提取工藝調整為提取溫度51℃，單級提取時間59min，液料比為5.9∶1，提取級數3級，在此最佳參數條件下進行3次驗證實驗，循環逆流法提取發芽糙米GABA平均提取率達到89.35%，與理論值89.47%接近，說明回歸方程能夠真實的反應各參數對提取率的影響，對發芽糙米GABA提取工藝具有指導意義。

圖9　提取溫度與提取級數對GABA提取率影響的響應面圖Fig.9　Response surface plots of extraction temperature and extraction numbers on the GABA content

3　結論

采用Box-Behnken響應面法建立影響因素的二次回歸模型，對數據進行分析，得到發芽糙米GABA最佳逆流提取工藝為提取溫度51℃、單級提取時間59min、液料比5.9∶1、提取級數3級，此條件下GABA提取率達到89.35%，實驗擬合誤差小，可用來實際預測和評價發芽糙米GABA提取量，該方法是一種值得參考的高效、節能的提取工藝方法，采用逆流提取技術具有一定的可行性［18］。

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Process optimization of γ-aminobutyric acid from germinated brown rice by circulating countercurrent extraction method

MA Tao1，LIU Li-xia2，ZHAO Xu3，WANG Bo1，LIU He1，HUI Li-juan1，HE Yu-tang1
（1.College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China；2.College of Food Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；3.Grain Science Research Institute of Liaoning Province，Shenyang 110866，China）

By using water as extraction solvent，the laboratory simulation of dynamic countercurrent extraction method and response surface experimental design method were used for optimizing process conditions of γ-aminobutyric acid from germinated brown rice.The experimental results showed that the optimal extraction conditions were single stage extraction time for 59min at 51℃，a liquid material ratio 5.9∶1（mL/g）and extracted from the series 3.Under this conditions，the average extraction rate of GABA could reach 89.35%。

germinated brown rice；γ-aminobutyric acid；countercurrent extraction；condition optimization

TS210.4

B

1002-0306（2015）14-0249-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.043

2014－09－01

馬濤（1962-），男，博士，教授，研究方向：食品科學，生物材料科學。