灰兜巴蛋白超聲提取及其對α-葡萄糖苷酶的抑制

許　　偉，李　　錦，，邵　　榮，顏秀花，韋　　萍

（1.鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城224051；2.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京210009）

灰兜巴蛋白超聲提取及其對α-葡萄糖苷酶的抑制

許偉1，李錦1，2，邵榮1，顏秀花1，韋萍2

（1.鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城224051；2.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京210009）

以藏藥灰兜巴為原料，首次采用超聲波輔助提取灰兜巴蛋白。在單因素實驗的基礎上，用響應曲面法優化灰兜巴蛋白的提取工藝。結果表明提取蛋白的最佳工藝參數為：超聲功率800W、超聲時間52min、溫度57℃、pH7.5和液料比54∶1mL/g，此時灰兜巴蛋白的得率是52.66%，與理論值52.59%僅相差0.07%。對蛋白提取液進行離心、微濾和透析等處理，得到的灰兜巴粗蛋白的純度為56.75%。通過實驗，確定灰兜巴粗蛋白對α-葡萄糖苷酶（AGD）有一定的抑制作用，其AGD抑制活性IC50值約為18mg/mL。

灰兜巴蛋白，超聲，提取，α-葡萄糖苷酶，抑制

藏藥灰兜巴為峨眉山所特有，新疆地區少量生產，是一種洞穴紅蜘蛛用自己的絲作為原材料而建成的巢穴，這種紅蜘蛛生活在海拔1000m以上的老茶樹林里，它建成的巢穴外形像一個灰色的布袋，穴處依附于老茶樹的枝干上，在其上端開口處偶見蜘蛛尸體，底端則埋藏于洞穴中，整個巢穴混雜泥土和枯枝敗葉。生長在灰色土壤中的灰兜巴其表面顏色呈灰黃色，具有較長、較粗等特點；生長在紅色壤中的灰兜巴則表面顏色偏紅，具有較細的特點。其中以粘附灰黃色泥土品質最佳?；叶蛋途哂邢⒕徑馓悄虿“Y狀、益氣健脾、糾正代謝絮亂，防止糖尿病并發癥的功能，主要用于治療Ⅱ型糖尿病，因此被大家認為是民間治療糖尿病的最佳偏方［1］。近年來，由于糖尿病患者的持續增加，越來越多的研究人員開始關注灰兜巴活性成分研究。伍艷等［2］對灰兜巴的活性成分進行研究，發現治療Ⅱ型糖尿病主要有效成分為蛋白質成分，并且對AGD抑制率為46.84%。經研究發現，很多蛋白質對α-葡萄糖苷酶都具有一定的抑制作用［3-4］，何穎敏［5］發現用50%飽和度的硫酸銨沉淀出的蛋白組份對α-葡萄糖苷酶抑制活性最大，其半抑制濃度為69.87mg/mL。用常規的方法：堿溶酸沉法［6］、有機溶劑提取法［7］等提取蛋白，存在得率低、提取時間長等缺點。而采用超聲輔助提取灰兜巴蛋白，可以有效地提高蛋白的得率，具有成本低、易操作［8］等優點，且無需有機溶劑。Ma Hai-Le等［8］使用超聲輔助提取米糠蛋白，米糠蛋白的得率為48.3%，與堿提取法和酶提取法相比，超聲輔助提取更容易進行，米糠蛋白的得率超過堿提取法，略低于酶提取法。本文采用超聲輔助水溶劑提取方法，對灰色土壤品質的灰兜巴進行研究，并測定其對α-葡萄糖苷酶（AGD）的抑制作用，為高效開發利用灰兜巴蛋白奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

灰兜巴成都張坤成中藥材行（原裝帶土灰兜巴）；考馬斯亮藍G250、葡萄糖（AR）、苯酚（AR） 國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸（AR）、磷酸（AR）、硫酸銨（AR） 江蘇彤晟化學試劑有限公司；磷酸二氫鈉（AR）、磷酸氫二鈉（AR）、無水乙醇（AR） 南京化學試劑有限公司；α-葡萄糖苷酶（BR）上海紀寧實業有限公司；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（99%） 上海研域生物科技有限公司；去離子水實驗室自制。

RE-2000B型旋轉蒸發器上海雅榮生化設備儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計上海佑科儀器有限公司；XO-SM50型超聲波微波組合反應系統南京先歐生物科技有限公司；AUY220型電子天平日本島津公司；DFY-500型搖擺式藥材粉碎機江陰市Y勻機械制造有限公司；TGLL-18K型高速冷凍離心機太倉市華美生化儀器廠；冷凍干燥機北京博醫康實驗設備有限公司；K9860型全自動凱式定氮儀、SH220型石墨消解儀濟南海能儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1總蛋白的測定根據國標GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》，采用全自動凱氏定氮儀測定灰兜巴的總蛋白含量。總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖配制標準溶液。

1.2.2標準曲線的繪制蛋白標準曲線參考李志西等［9］中的方法，以牛血清標準蛋白的濃度為橫坐標，OD值（595nm）為縱坐標，繪制標準曲線；糖標準曲線參考任保國［10］中的方法并略做修改，以葡萄糖的濃度為橫坐標，OD值（490nm）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3硫酸銨濃度的確定離心后的灰兜巴蛋白提取液用硫酸銨分級沉淀蛋白［11］，硫酸銨的濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃靜置12h，離心（10000r/min，4℃，15min），測定上清液殘留蛋白含量。

1.2.4工藝流程去土灰兜巴粉碎（粉碎1min）→緩沖液配制灰兜巴溶液→超聲輔助提?。ǔ暪β?00W、超聲時間50min、溫度50℃、pH7.0和液料比60∶1mL/g）→離心（10000r/min，4℃，30min）→上清液4℃過0.45μm濾膜［12］→硫酸銨4℃沉淀蛋白→離心（4000r/min，4℃，10min）→4℃下透析沉淀36h→透析液濃縮冷凍干燥→灰兜巴粗蛋白→α-葡萄糖苷酶的抑制。

1.2.5單因素實驗精確稱取1g已粉碎的去土灰兜巴，分別研究不同的超聲功率、pH、料液比、溫度和時間對灰兜巴蛋白得率的影響。固定提取的初始條件為超聲功率800W、超聲時間50min、溫度50℃、pH7.0和液料比60∶1mL/g。單因素實驗中變化因素水平為：pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；液料比30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1mL/g；超聲時間30、40、50、60、70min；溫度30、40、50、60、70℃；功率為700、750、800、850、900W。

1.2.6響應面法優化實驗設計

1.2.6.1Plackett-Burman（PB）篩選實驗［13］對上述5個因素用PB進行全面考察，實驗設計選用5因素、N= 12，并設空白項作為誤差分析項。每個因素取高低兩個水平，考察各因素的效應，選擇置信度大于95%的因素作為顯著因素作進一步考察。

1.2.6.2最陡爬坡實驗設計根據PB實驗結果，以及各個顯著因素效應的大小設定步長及變化方向進行實驗，找出峰值，在峰值的臨近區域建立有效的擬合方程以快速尋找最佳的響應區域。

1.2.6.3響應面優化［14］由PB實驗和最陡爬坡實驗確定的實驗因素與水平，采用Box-Behnken實驗設計對超聲輔助提取灰兜巴蛋白進行3因素3水平的研究，見表1，以得到最優灰兜巴蛋白的提取條件。

表1　響應面因素設計水平表Table 1　Factors and levels of response surface methodology

1.2.7灰兜巴蛋白得率的計算公式如下：

式中：η為灰兜巴蛋白得率，%；C為依據標準曲線計算出的待測蛋白質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為樣品的質量，g；y為灰兜巴總蛋白含量，%。

1.2.8灰兜巴粗蛋白對α-葡萄糖苷酶的抑制參考李國榮［15］的方法，略作修改。1000μL pH為6.8的磷酸緩沖溶液（0.1mol/L），200μL粗蛋白樣品，50μL還原性谷胱甘肽（0.5mg/mL），50μL α-葡萄糖苷酶（2.5U/mL），混勻，37℃條件下反應10min，加入20μL pNPG（0.5mg/mL），混勻，37℃條件下水浴15min，加入1000μL碳酸鈉溶液（0.1mol/L）終止反應，在405nm處測定溶液吸光度值，記作為A樣品。以磷酸緩沖液代替樣品，其他條件同A樣品，吸光度值記作A對照；以磷酸緩沖液代替酶，其他條件同A樣品，記作A空白?；叶蛋痛值鞍讟悠穼Ζ?葡萄糖苷酶的抑制率計算公式如下所示：

1.2.9數據統計分析采用Design Expert 8.0對響應面數據進行分析處理。

2　結果與討論

2.1總蛋白含量

經測定，灰兜巴總蛋白含量約為23.03%。

2.2標準曲線

牛血清蛋白的標準曲線回歸方程為Y=0.00567X+ 0.05956，相關系數R2為0.99878，線性相關度較好。葡萄糖標準曲線回歸方程為Y=0.01619X+0.00586，相關系數R2為0.99798，線性相關度較好。

2.3硫酸銨濃度的確定

圖1　蛋白殘留量與硫酸銨關系圖Fig.1　The relationship between residual amount of protein and ammonium sulfate

由圖1可知當硫酸銨濃度為70%時，沉淀出的灰兜巴蛋白最多，此時離心后上清液中殘留的蛋白含量為11.47%。

2.4單因素實驗結果

2.4.1pH對灰兜巴蛋白得率的影響由圖2可知，當pH小于7.5時，隨著pH的增加，灰兜巴蛋白的得率顯著增高，當pH為7.5時得率最大，這與周紅霞［16］研究大豆蛋白質的提取工藝研究中，提取蛋白的最佳pH為7.0相似。當pH繼續增加，得率下降，這可能是因為灰兜巴蛋白在pH7.5時已達到最大溶解度，之后隨著pH增大溶液過堿，蛋白會發生變性從而導致得率下降。因此pH定為7.5。

圖2　pH對蛋白得率的影響Fig.2　Effect of pH on the rate of protein extraction

2.4.2液料比對灰兜巴蛋白得率的影響由圖3可知，當液料比小于50∶1mL/g時，隨著液料比的增大，灰兜巴蛋白得率迅速增大，當液料比為50∶1mL/g時，得率達到最大值，這與張文英等［17］對超聲波輔助提取菜籽粕中蛋白的工藝研究中，提取蛋白時最佳液料比50∶1mL/g相同。此后灰兜巴蛋白的得率隨著液料比的增大有略微下降?？赡苁且欢康木彌_溶液浸提蛋白質的能力有限，溶液不足會導致蛋白質無法完全浸提，增加溶液可以提高水溶性蛋白的溶解量，從而提高得率。而之后提取率略微減小可能是因為溶劑用量增加，溶解的雜質增加，從而影響了蛋白的得率。因此將液料比定為50∶1mL/g。

圖3　液料比對蛋白得率的影響Fig.3　Effect of liquid-solid ratio to material on the ratio of protein extraction

2.4.3超聲時間對灰兜巴蛋白得率的影響由圖4可知，當超聲時間小于50min時，蛋白得率逐漸增高，而超過50min蛋白得率隨時間的變化趨于平緩，可能是因為隨著提取時間的不斷延長，環境溫度不斷上升，促進了溶質的浸出。當超聲時間大于50min時，得率又開始降低，這也許是因為隨著超聲的時間延長，蛋白質變性程度加深，水溶性蛋白的含量降低。超聲時間如果很短，導致提取不充分，而超聲時間過長會使蛋白質的損傷增加，因此將超聲的時間定為50min，這與黃國平等［18］對超聲波法提取玉米醇溶蛋白最佳超聲時間50min相同。

圖4　超聲時間對蛋白得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic time on the ratio of protein extraction

2.4.4溫度對灰兜巴蛋白得率的影響由圖5可知，溫度對灰兜巴蛋白得率有明顯的影響，當溫度小于60℃時，隨著溫度的升高，蛋白的得率增加，在60℃時得率最高；超過60℃得率下降，這可能是因為溫度過高，溶液揮發較快，蛋白質變性程度增加。因此，采用超聲提取溫度為60℃，這與張慧娟等［19］在應面法優化脫脂米糠蛋白提取工藝中，提取蛋白的最佳溫度60℃相同。

圖5　溫度對蛋白得率的影響Fig.5　Effect of temperature on the rate of protein extraction

2.4.5超聲功率對灰兜巴蛋白得率的影響由圖6可知，當超聲功率小于800W時，隨著超聲功率的提高，灰兜巴蛋白的得率上升，當超聲功率800W時得率達到最大值，可能是隨著功率增加，熱效應增強，提取液的溫度升高，增加了料液擴散的速度，提高了得率。這與張曉云等［20］在超聲波輔助堿法提取芡實蛋白工藝中，提取蛋白的最佳超聲功率800W相同，并且蛋白的得率是未進行超聲處理的2倍多。但是當超聲功率進一步增加，得率逐漸下降，可能是由于功率太大，超聲時瞬間熱效應明顯，使得蛋白變性，造成蛋白難以溶出，且功率增加會增加能耗。因此將超聲功率設定為800W。

圖6　超聲功率對蛋白得率的影響Fig.6　Effect of ultrasonic power on the rate of protein extraction

2.5響應面優化灰兜巴蛋白的提取

2.5.1PB篩選實驗對pH（A）、液料比（B）、時間（C）、溫度（D）和功率（E）5個因素進行考察，其他因素以虛擬因素代替。PB實驗設計及結果見表2和表3。

以因素B液料比為例：其回歸系數為2.53，標準誤差為0.20，影響水平為5.05，表明因素B對灰兜巴蛋白得率的影響為正效應，隨著液料比的增加，蛋白得率逐漸增加，因此在后面的因素優化實驗中應當提高B的值，因素B的平方和為76.56。由表可以明顯看出因素B（液料比）、C（時間）和D（溫度）為主要影響因子，在95%的概率水平上影響顯著，其貢獻度分別為45.84%、48.97%和2.59%。由PB實驗的結果，非顯著影響因素的水平確定為：pH7.5、超聲功率800W。

2.5.2最陡爬坡實驗以PB實驗結果為基礎，針對液料比、時間和溫度3個因素設計最陡爬坡實驗，3個顯著影響因子均呈正效應，設定其步長分別為10、 10、10，以尋找快速最佳的響應區域。實驗設計和結果如表4所示。

由表4可知：液料比50∶1mL/g、時間50min和溫度60℃的條件下，灰兜巴蛋白得率最高，達到51.69%。因此設定液料比50∶1mL/g、時間50min和溫度60℃為響應面優化實驗的中心點。

表2　PB篩選實驗的實驗結果Table 2　Experimental results of PB design

表3　偏回歸系數及影響因子的顯著性分析Table 3　Partial regression coefficients and analysis of their significance

表4　最陡爬坡實驗的實驗設計及實驗結果Table 4　Experiment design and results of steepest ascent path design

2.5.3響應面優化實驗

2.5.3.1響應面優化灰兜巴蛋白提取以液料比、時間和溫度為因素進行響應面優化灰兜巴蛋白的提取條件，結果和分析見表5和表6。

由表6可知，該模型極其顯著（p值＜0.0001），表明該模型灰兜巴蛋白得率的實驗值和擬合值之間具有很好的擬合度。該模型的失擬項p值＞0.10，表明二次模型是合適的。

對模型系數顯著性分析可知，X1、X2、X3、X12、X22、X32對灰兜巴蛋白的得率影響顯著，其中因素X1、X3、X12、X32對蛋白的得率影響極顯著。一次項中各因素對灰兜巴蛋白得率的影響顯著性大小順序是：液料比（X1）和提取溫度（X3）＞時間（X2）。擬合后得到關于液料比、時間、溫度和蛋白得率的二次多項式回歸模型為：

Y（%）=51.44+3.84X1+0.93X2-2.52X3+0.32X1X2-0.44X1X3-0.095X2X3-5.48X12-2.56X22-4.98X32

2.5.3.2雙因素間交互作用分析響應面優化蛋白提取實驗中兩因素間交互作用影響見圖7～圖9。

從圖7可以看出，當溫度在最佳值時，時間和液料比的交互作用不明顯，蛋白的得率隨著時間的增加變化緩慢；液料比對蛋白的得率影響明顯，隨著液料比的增加，蛋白得率增加，超過最高點后，略有下降。

表5　響應面實驗結果Table 5　Results of response surface experiment

表6　回歸模型的方差分析Table 6　Variance analysis of regression model

圖7　時間和液料比對灰兜巴蛋白得率的響應曲面圖Fig.7　The response surface plot of time and liquid-solid ratio on the Huidouba protein extraction

從圖8可以看出，超聲時間處于最佳值時，溫度和液料比的交互作用影響較大，但不顯著?；叶蛋偷鞍椎牡寐孰S著兩者的增大而增大，達到最高值后，略微下降。

圖8　提取溫度和液料比對灰兜巴蛋白得率的響應曲面圖Fig.8　The response surface plot of extraction temperature and liquid-solid ratio on the Huidouba protein extraction

從圖9可以看出，液料比處于最佳值時，溫度和時間的交互作用影響不明顯。溫度低，時間短時，灰兜巴蛋白的得率低，但是溫度過高，時間過長，也會導致灰兜巴蛋白的得率降低。

圖9　溫度和時間對灰兜巴蛋白得率的響應曲面圖Fig.9　The response surface plot of extraction temperature and time on the Huidouba protein extraction

2.5.3.3灰兜巴蛋白最佳提取條件的確定及優化工藝條件驗證經Box-Behnken設計得到超聲提取灰兜巴蛋白的最優工藝條件為：提取溫度57.28℃、提取時間52.10min、液料比53.68∶1mL/g，非顯著因素pH7.5、超聲功率800W。在此工藝條件下灰兜巴蛋白的得率為52.59%。

為了方便實際操作，灰兜巴蛋白提取的最優工藝條件設為：提取溫度57℃、提取時間52min、液料比54∶1mL/g、pH為7.5、超聲功率800W。在此條件下進行驗證實驗，得到灰兜巴蛋白的得率為52.66%，相對誤差為0.07%，證明該模型是適合有效的。

2.5.4灰兜巴粗蛋白對α-葡萄糖苷酶活性的抑制經測定，制備得到的灰兜巴粗蛋白中，蛋白的含量為56.75%，糖含量為1.27%。在體外α-葡萄糖苷酶的抑制實驗中，糖類物質會產生一些干擾，配制與灰兜巴粗蛋白中含糖量一樣葡萄糖溶液，測定對α-葡萄糖苷酶的抑制率，其結果顯示抑制率為2.65%，而灰兜巴粗蛋白溶液對α-葡萄糖苷酶抑制率為47.92%，因此盡管灰兜巴粗蛋白中含有部分糖類物質，但是對α-葡萄糖苷酶的抑制率影響甚小。

圖10　灰兜巴粗蛋白對α-葡萄糖苷酶活性的抑制Fig.10　Determination of huidouba crude protein of α-glucosidase inhibition activity

由圖10可知，灰兜巴粗蛋白對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制效果。并且隨著灰兜巴粗蛋白濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率也隨之增加，其α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50值約為18mg/mL。何穎敏［5］在對螺旋藻富鉻培養及其蛋白組份對α-葡萄糖苷酶活性的抑制研究中，發現用50%飽和度硫酸銨沉淀出的蛋白對α-葡萄糖苷酶抑制活性最大，其IC50值69.87mg/mL。兩者相比較，可以得到，在同等對α-葡萄糖苷酶抑制作用下，灰兜巴粗蛋白的濃度更低，抑制效果更好。

3　結論

以灰兜巴為原料，采用響應面法對超聲輔助提取灰兜巴蛋白工藝條件進行了優化，在單因素的基礎上，采用Plackett-Burman篩選實驗和Box-Behnken實驗設計建立數學模型，并進行了數據分析，結果表明，在本研究中影響灰兜巴蛋白得率的五個因素中，液料比、時間和溫度為顯著因素，影響順序為液料比和提取溫度＞時間。超聲輔助提取灰兜巴蛋白的最優提取條件為：功率800W、時間52min、溫度57℃、pH7.5和液料比54∶1mL/g。在此條件下，灰兜巴蛋白的理論得率是52.59%，通過驗證實際灰兜巴蛋白的得率為52.66%，相對偏差為0.07%，證明該模型是適合有效的。實驗結果表明，得到了灰兜巴粗蛋白對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制效果，并且灰兜巴粗蛋白的濃度越高，抑制效果越好，其對AGD抑制活性IC50值約為18mg/mL。

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Extraction process of Huidouba-protein by ultrasound and its inhibition on α-glucosidase

XU Wei1，LI Jin1，2，SHAO Rong1，YAN Xiu-hua1，WEI Ping2
（1.School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China；2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210009，China）

The protein was extracted from Tibetan Huidouba for the first time with ultrasonic-assisted extraction. The extraction process was optimized by response surface methodology based on the results of single factor experiments.The results showed that the optimal conditions were as follows：ultrasonic power 800W，ultrasonic time 52min，temperature 57℃，pH7.5 and the liquid-solid ratio 54∶1mL/g.Under the optimal extraction conditions，the extraction rate of Huidouba protein was 52.66%，and it was only a difference of 0.07%with the theoretical value which was 52.59%.The purity of the Huidouba-protein was up to 56.75%after the processes of centrifugation，microfiltration and dialysis.It had been proved that the Huidouba crude protein had inhibition effect on α-glucosidase（AGD），and its value of inhibitory activity IC50was about 18mg/mL.

Huidouba protein；ultrasound；extraction；α-glucosidase；inhibition

TS201.2

B

1002-0306（2015）14-0254-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.044

2014－11－03

許偉（1976-），女，博士，副教授，研究方向：生化工程。

國家自然科學基金（31101912）；江蘇省自然科學基金（BK2011420）；江蘇省“青藍工程”項目，江蘇省博后基金項目（1401101C）；江蘇省大學生實踐創新訓練省指導項目（2014046）；鹽城市農業科技指導性計劃項目（YKN2014004）。