艾煙與香煙對載脂蛋白 E基因敲除小鼠自主行為與海馬 GFAP表達的影響

劉鈞天,崔瑩雪,黃玉海,黃暢,黃劍,趙百孝,韓麗,楊佳,王磊

(1.北京中醫藥大學附屬護國寺中醫醫院,北京 100035;2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院,北京 100010;3.中國中醫藥科技開發交流中心,北京 100010;4.北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京 100029)

艾灸作為針灸學科的重要組成部分,從古至今廣泛應用于疾病治療及預防保健等方面。古代醫家都提倡用艾灸防病強身,延緩衰老,如《醫學入門》記載:“凡一年四季各要熏一次,元氣堅固,百病不生。”艾煙作為艾灸過程中的重要組成部分,其主要成分與生物活性均參與到艾灸療效的發揮過程中。我們前期研究證明艾煙可提高人體自主神經系統活力[1],改善SAMP8小鼠腦中的氧化應激狀態[2]。初步提示艾煙可以改善中樞神經系統功能。

載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠作為一種新型動物模型廣泛應用于阿茨海默病發生機制的研究中。許多研究證實ApoE基因缺失對認知功能的影響尤其是老化后出現的智力下降與氧化性損傷增強有關[3-4]。

為進一步了解艾煙對阿茨海默病小鼠模型學習記憶功能與海馬膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達的影響。本實驗以ApoE-/-小鼠為模型,通過對比觀察艾煙暴露與香煙暴露兩種不同干預方式對其自主行為及腦組織海馬中GFAP表達的影響,探討艾煙對腦組織衰老的干預作用,以期為探索艾灸療法延緩衰老機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用清潔級8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)27只,C57BL/6小鼠13只,體重30 g,購自北京大學動物醫學中心[許可證為SCXK(京)2011-0012]。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養,C57BL/6小鼠采用標準飼料喂養,自由進水;飼養環境溫度 22℃±2℃,相對濕度 50%～60%,保持 12 h光照(8:00-20:00)和黑暗(20:00至次日8:00)交替循環。

小鼠購進后,適應性飼養1星期,干預12星期。按隨機數字表法將ApoE-/-小鼠隨機分為ApoE-/-模型組、艾煙組、香煙組3組(每組9只),并將13只C57BL/6小鼠作為空白對照組進行對照。在干預12星期后,所有小鼠進行行為學測試,隨后全部處死,每組隨機選取6只小鼠大腦進行免疫組織化學檢測。

1.2 主要實驗材料、儀器及試劑

自制細艾條(直徑0.5 cm×長20 cm,河南南陽漢醫艾絨有限公司);香煙(中南海牌,焦油含量 10 mg/支);自制帶孔玻璃缸(1 m×1 m×1 m,頂層玻璃正中設一直徑5 mm圓孔);光散射式數字粉塵測試儀(北京賓達綠創科技有限公司);小鼠自主行為測試儀(UGO Basile);GFAP兔抗小鼠抗體(Abcam);中性樹膠封片劑;多聚甲醛,中性樹膠及其他生物試劑(Sigma)。

1.3 實驗步驟

1.3.1 空白暴露

將空白對照組與ApoE-/-模型組小鼠分別暴露于玻璃缸中20 min。

1.3.2 艾煙、香煙干預

1.3.2.1 艾煙干預

將調試好的粉塵測試儀置于玻璃缸中間,將艾煙組小鼠自由暴露在玻璃缸中,點燃自制細艾條,從玻璃缸上方的圓孔將點燃的一端插入,令艾煙充滿玻璃缸。根據前期實驗結論[5],控制艾煙濃度為 5～15 mg/m3。用粉塵測試儀測試其濃度達到預定范圍后(此過程艾條燃燒約 15 s),將艾條取出,迅速封閉圓孔。此后每隔 3 min記錄一次濃度數值,使濃度穩定在 10 mg/m3左右。若數值高于 15 mg/m3,可將上方玻璃蓋稍微移動,令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回;若數值低于5 mg/m3,可再將點燃的艾條由圓孔插入,以補充艾煙。20 min后,取出小鼠,每星期干預6 d,共干預12星期。

1.3.2.2 香煙干預

除將艾條換成香煙,香煙濃度及干預方式與艾煙組相同。在進行香煙干預時要保證與其他組別嚴格隔離,避免其他組別嗅到香煙。

1.3.3 自主活動實驗

小鼠自主活動測試儀,定時為 5 min,將小鼠放入實驗活動儀反應槽中,蓋上蓋子后開始進行實驗,當小鼠站立時,反應槽周圍上方的紅外線探頭探測到信號改變,當小鼠沒有站立,而是在爬行時,反應槽周圍下方的紅外線探頭探測到信號改變,數據均自動記錄。

1.3.4 標本制備與圖像采集

隨機選取6只,用10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠,經一側頸總動脈先注射200 mL生理鹽水灌注沖洗后,再灌注 4%多聚甲醛直至流出的液體澄清。靜置30 min后開顱取腦(視交叉與乳頭體之間的腦組織),置4%多聚甲醛中固定過夜,流水沖洗30 min,用各級乙醇脫水,苯透明,浸蠟,常規包塊。轉化切片機切片,制備腦冠狀面切片,片厚約6 μm。

免疫組織化學超敏法[6]一抗為兔抗小鼠GFAP多倍體克隆抗體(美國Abcam公司)。其中A液,即用型過氧化物酶阻斷劑;B液,即用型非免疫血清;C液,即用型生物素標記二抗;D液,即用型鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶標記三抗。實驗步驟嚴格按照說明書進行,替代實驗用0.01 mol/mL PBS代替一抗,其他步驟不變,結果為陰性。

于400倍Olympus顯微鏡下觀察海馬切片上GFAP陽性細胞形態和分布特征;用Leica Qwin Plus圖像分析儀計數每張切片5個視野海馬結構0.1 mm2GFAP的積分光密度(IOD)值。

1.4 統計學方法

所有數據應用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示。符合正態性和方差齊性的數據,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 自主活動成績分析

空白組小鼠活動距離與站立次數均高于模型組小鼠(P＜0.05),表明ApoE-/-小鼠會降低中樞神經系統的興奮性。艾煙組移動距離高于模型組(P＜0.05),但與空白組無差別,站立次數與模型組無差異,但低于空白組。表明艾煙可以提高ApoE-/-小鼠活動性,增強其運動能力。香煙組沒有表現出與模型組、艾煙組的明顯差異,但香煙組活動距離與站立次數均差于空白組(P＜0.05),說明香煙組小鼠活動能力低于正常小鼠。詳見圖1-2,表1。

圖1 各組小鼠自主活動移動距離

圖2 各組小鼠自主活動站立次數

表1 各組小鼠的自主活動行為 (±s)

表1 各組小鼠的自主活動行為 (±s)

注:在第 1星期適應性喂養中由于飼養環境改變模型組小鼠死亡 3只,香煙組死亡1只。與模型組比較1)P＜0.05;與空白組比較2)P＜0.05

組別 n 活動距離(mm)站立次數(次)空白組 13 580.54±130.511) 36.79±18.931)模型組 6 304.00±76.87 10.11±5.49艾煙組 9 477.93±81.791) 18.37±9.362)香煙組 8 359.54±106.612) 12.46±7.832)

2.2 各組小鼠海馬中GFAP蛋白表達

GFAP免疫陽性反應在細胞中呈現兩種形態,一種原漿性星形膠質細胞體型較大,呈圓形或橢圓形,突起粗短、數量較少,GFAP免疫陽性產物聚集細胞體一側;另一種纖維性星形膠質細胞體型較小,呈星性或多角形,突起細長、分部廣泛,GFAP免疫陽性產物充滿細胞體(圖3)。模型組小鼠海馬中GFAP免疫反應產物積分光密度值明顯高于空白組與艾煙組(P＜0.05)(表2)。香煙組小鼠海馬 GFAP表達高于艾煙組與空白組(P＜0.05)。說明艾煙較香煙能減低ApoE-/-小鼠海馬中GFAP的表達。

表2 各組小鼠海馬結構GFAP免疫反應產物的積分光密度值 (±s)

表2 各組小鼠海馬結構GFAP免疫反應產物的積分光密度值 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與空白組比較3)P＜0.05;與香煙組比較4)P＜0.05

組別 n GFAP免疫反應產物的積分光密度值空白組 6 4.30±1.522)模型組 6 13.90±4.06艾煙組 6 7.60±2.281)4)香煙組 6 12.40±4.683)

圖3 各組小鼠海馬CA3區GFAP表達(×400)

3 討論

本實驗對各組小鼠進行自主活動觀察,發現模型組小鼠自主活動移動距離和站立次數均比空白組小鼠減少,差異均有統計學意義,表明ApoE-/-小鼠的活動性降低,運動能力減弱,對新環境認知能力較差,對潛在危險缺乏警惕。許多研究證實,ApoE-/-小鼠在幼齡時就會出現中樞神經系統興奮性降低甚至認知功能障礙,而這種情況會隨著年齡的增加日漸加重[7]。艾煙干預后,其自主活動移動距離較模型組明顯增多,說明艾煙可使 ApoE-/-小鼠中樞神經系統興奮性提高,運動能力增強,對新環境有更好的認知與適應性。本研究中,艾煙組小鼠表現優于香煙組小鼠,但未產生統計學差異,如果加大樣本量,期望能出現統計學差異。

星形膠質細胞是中樞神經系統內數量最多、功能最復雜的一種膠質細胞,幾乎占腦容量的50%以上,對神經元的存活、腦組織的修復起重要作用[8]。GFAP作為一個典型的星形膠質細胞標記物,會隨動物與人大腦年齡的增長而表達增加[9]。而ApoE-/-小鼠與衰老野生小鼠腦中GFAP蛋白含量同樣呈現高表達,說明ApoE-/-小鼠與衰老有著非常密切的聯系[10]。亦有研究表明,在阿茨海默病(AD)的病理過程[11]中,星形膠質細胞會被β淀粉樣蛋白激活,大量增殖,產生細胞炎性分子、氧自由基等物質并啟動炎性反應,促進神經細胞的損傷與凋亡,大大加速AD進程。GFAP是星形膠質細胞構成中的一種重要的細胞骨架蛋白,有著保護星形膠質細胞的作用,其大量表達以對抗腦中氧化損傷。本研究中,空白組與艾煙組海馬GFAP蛋白表達低于模型組與香煙組,間接說明,兩組小鼠腦中氧化損傷較小,衰老程度降低。因此提示艾煙可以通過降低腦內氧化應激損傷起到保護腦組織進而抗衰老的作用。

艾煙的安全性與多種生物活性同樣倍受關注。在對艾煙進行系統毒理學分析后,得出其半數致死濃度LC50=11117 mg/m3[12];亞慢性毒理實驗說明艾煙不能引起大鼠臟器萎縮與水腫[13];在艾煙致畸與致突變試驗中發現,高于臨床濃度百倍的艾煙冷凝物才會產生潛在的致畸與致突變特性[14-15]。本課題組前期研究亦證實,臨床濃度(2.5～3.5 mg/m3)艾煙對大鼠其他臟器不會產生任何病理改變,且不會引起全身過敏反應[16]。總之,各項研究結果都說明臨床濃度艾煙的基本安全性。然而,香煙的毒理研究發現香煙煙霧對小鼠各系統有較強的急性、慢性毒性作用[17]與致突變效應[18],說明香煙對人體會產生各種可能的危害。

艾煙是艾灸過程中,艾絨燃燒產生的煙氣,其中揮發性成分有26種[19]。香煙中的主要芳香成分也有165種[20]。早在1949年R.W.Monorieff就提出“氣味的立體化學論”這一理論,認為當空氣中氣味分子適合于嗅神經的某些輔助性受體部位的時候,人類或動物就會嗅到它們。這一理論經過多年發展完善,Buck L等[21]在研究中闡明不同的嗅覺感受器內涵特殊的受體蛋白,當特定氣味分子被嗅覺感受器識別,就會引發其動作電位,由嗅絲傳遞到嗅球被特殊的受體蛋白識別。通過僧帽細胞和叢狀細胞軸突組成的嗅束將信號投射到初級嗅覺皮質中樞,最終可以投射到下丘腦、邊緣系統、海馬等部位[22],直接參與到情緒調節,學習記憶的識別、編碼與儲存。因此,我們推測艾煙與香煙也是通過干預嗅覺系統的神經遞質,影響嗅覺傳導通路,從而改善情緒以及學習記憶功能,增強中樞神經系統的興奮性。

艾煙可提高ApoE-/-小鼠中樞神經系統興奮性,并通過改善腦中氧化應激損傷,降低GFAP蛋白在海馬的表達起到延緩大腦衰老的作用。

[1]Cui Y, Zhao B, Huang Y, et al. Effects of moxa (Folium Artemisiae argyi)smoke exposure on heart rate and heart rate variability in healthy young adults: A randomized, controlled human study[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013,(2013):510318.

[2]孟笑男,徐煥芳,崔瑩雪,等.艾燃燒生成物對快速老化模型小鼠大腦 SOD、MDA和 GSH-Px的影響[J].環球中醫藥,2011,4(6):413-415.

[3]Fisher A, Brandeis R, Chapman S, et al. M1 muscarinic agonist treatment reverses cognitive and cholinergic impairments of apolipoprotein E-deficient mice[J]. J Neurochem, 1998,70(5):1991-1997.

[4]Kitagawa K, Matsumoto M, Hori M, et al. Neuroprotective effect of apolipoprotein E against ischemia[J]. Ann N Y Acad Sci, 2002,977:468-475.

[5]許煥芳,崔瑩雪,黃茶熙,等.艾燃燒生成物對快速老化模型小鼠SAMP8血清抗氧化酶的影響[J].中國針灸,2012,32(1):53-57.

[6]張潔,宿寶貴.電針對腦梗塞大鼠海馬結構內 GFAP免疫陽性細胞的形態學影響[J].解剖學研究,2010,32(1):6-9.

[7]Segev Y, Michaelson DM, Rosenblum K. ApoE epsilon4 is associated with eIF2alpha phosphorylation and impaired learning in young mice[J]. Neurobiol Aging, 2013,34(3):863-872.

[8]侯德仁,薛俐,陳坤,等.丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠海馬GFAP和 VEGF的影響[J].中南大學學報(醫學版),2010,53(2):111-115.

[9]Haley GE, Kohama SG, Urbanski HF, et al. Age-related decreases in SYN levels associated with increases in MAP-2, apoE, and GFAP levels in the rhesus macaque prefrontal cortex and hippocampus[J].Age (Dordr), 2010,32(3):283-296.

[10]Choi J, Forster MJ, McDonald SR, et al. Proteomic identification of specific oxidized proteins in ApoE-knockout mice: relevance to Alzheimer’s disease[J]. Free Radic Biol Med, 2004,36(9):1155-1162.

[11]Kuchibhotla KV, Lattarulo CR, Hyman BT, et al. Synchronous hyperactivity and intercellular calcium waves in astrocytes in Alzheimer mice[J]. Science, 2009,323(5918):1211-1215.

[12]蘭蕾,常小榮,譚靜,等.艾煙的急性毒理試驗[J].光明中醫,2011,27(10):1992-1995.

[13]蘭蕾,張國山,石佳,等.艾煙對大鼠的亞慢性毒理試驗一般生理性指標分析[J].時珍國醫國藥,2014,25(5):1241-1244.

[14]韓麗,劉平,胡海,等.艾煙中可吸入顆粒誘發染色體畸變效應的實驗研究[J].中國中醫藥信息雜志,2013,20(1):34-36.

[15]韓麗,胡海,劉平,等.艾煙中可吸入顆粒物致鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗[J].中華中醫藥雜志,2013,28(6):1860-1863.

[16]王磊,哈略,韓麗,等.平均臨床濃度艾煙下的豚鼠全身過敏反應實驗研究(英文)[J].中華中醫藥雜志,2014,29(5):1477-1483.

[17]顧小紅,周穎婷,張淑華,等.香煙煙霧水溶物對小鼠急慢性毒性實驗的研究[J].嘉興學院學報,2008,24(6):29-31.

[18]高永,郝恩柱,倪艷波.香煙和綠茶對輻射致突變效應的影響[J].中華放射醫學與防護雜志,2006,26(4):355-357.

[19]靳然,趙百孝,于密密,等.艾燃燒生成物組分固相微萃取氣相色譜質譜法定性分析[J].北京中醫藥大學學報,2011,51(9):632-636.

[20]黃映鳳,楊君,郭偉強,等.中藥指紋圖譜對香煙質量控制的啟示[J].理化檢驗(化學分冊),2009,47(1):119-124.

[21]Buck L, Axel R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition[J]. Cell, 1991,65(1):175-187.

[22]Insausti R, Marcos P, Arroyo-Jimenez MM, et al. Comparative aspects of the olfactory portion of the entorhinal cortex and its projection to the hippocampus in rodents, nonhuman primates, and the human brain[J]. Brain Res Bull, 2002,57(3-4):557-560.