RP-H PLC同時測定萬古霉素和茶堿的血清藥物濃度

唐喆　管靜

（南京市婦幼保健院藥劑科，江蘇南京210004）

RP-H PLC同時測定萬古霉素和茶堿的血清藥物濃度

唐喆管靜

（南京市婦幼保健院藥劑科，江蘇南京210004）

目的：應用反相高效液相色譜法（RP-HPLC），建立同時測定人血清中萬古霉素和茶堿濃度的分析方法，為臨床監測萬古霉素和茶堿血藥濃度提供實驗手段。方法：采用外標法，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，19∶81，pH=3.2），流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，236，280 nm雙波長檢測。結果：萬古霉素在2.5～100.0 μg/mL濃度范圍內線性良好（r=0.999 6），茶堿在2.5～50.0 μg/mL濃度范圍內線性良好（r=0.999 9）；萬古霉素高、中、低濃度的提取回收率為87.28%～102.24%，方法回收率為100.89%～105.24%，日內精密度為0.95%～3.48%，日間精密度為3.59%～4.20%；茶堿高、中、低濃度的提取回收率為99.55%～103.46%，方法回收率98.28%～99.76%，日內精密度為0.95%～4.28%，日間精密度為1.58%～3.80%。結論：該方法靈敏度高，選擇性強，快速、簡便、準確，適用于臨床標本的檢測和藥物代謝動力學研究。

反相高效液相色譜法；萬古霉素；茶堿；血藥濃度監測

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，臨床上主要用于對抗革蘭陽性菌特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）所致的感染性疾病。萬古霉素具有耳毒性、腎毒性等不良反應，臨床應用時需進行血藥濃度監測，以降低相關不良反應發生風險［1-2］。茶堿是臨床常用平喘藥，治療指數窄，個體差異大，血藥濃度過高可引起呼吸、心跳停止等嚴重不良反應。接受茶堿治療的患者均應測定血藥濃度［3-4］。萬古霉素與茶堿在臨床上時常聯合用藥，搶救危重患者［5］。目前尚未有同時監測萬古霉素與茶堿血藥濃度方法的報道。本文采用RP-HPLC法，意在建立同時監測萬古霉素與茶堿血藥濃度的方法，以滿足臨床需要。

1　儀器與試劑

1.1儀器

日本島津高效液相色譜儀（LC-20AT泵，SPD-15C紫外檢測器，DGU-A3在線脫氣機，SIL-10AF自動進樣器），色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），電子天平（Mettler XS205），高速冷凍離心機（Thermo Sorvall ST 16R），pH計（Mettler DElTA320）。

1.2試藥

萬古霉素標準品（批號：130360-201302，純度90%），茶堿標準品（批號：100121-201104，純度99.5%），購于江蘇省食品藥品檢定研究院。甲醇和乙腈均為色譜純（美國天地TEDIA），磷酸二氫鉀和高氯酸均為分析純（南京化學試劑有限公司）。

2　方法

2.1溶液的配制

精密稱取萬古霉素標準品10 mg于10 mL容量瓶中，精密稱取茶堿標準品10 mg于20 mL容量瓶中，分別加入超純水稀釋至刻度，搖勻，分別得萬古霉素與茶堿的儲備液，4℃避光保存。將萬古霉素儲備液稀釋成濃度為12.5，25.0，50.0， 125.0，250.0，500.0 μg/mL的萬古霉素系列標準溶液備用，將茶堿儲備液稀釋成濃度為12.5，25.0，50.0，100.0，125.0，250.0 μg/mL的茶堿系列標準溶液備用，均4℃避光保存。

精密稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加超純水溶解至1 000 mL，用磷酸調節pH至3.2，0.45 μm微孔濾膜濾過，超聲脫氣后備用。

2.2色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，19∶81，pH=3.2），流速：1.0 mL/min，檢測波長：236，280 nm（在波長236 nm條件下檢測萬古霉素，在波長280 nm條件下檢測茶堿），柱溫：30℃，進樣量：20 μL。

2.3樣品預處理

取血清樣品600 μL于2 mL EP管中，加入800 μL沉淀劑（甲醇-乙腈-6%高氯酸=1∶1∶6，V/V/V）沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，13 500 r/min離心10 min，取上清經0.45 μm針頭過濾器濾過后，轉入樣品瓶中待測。

3　結果

3.1方法專屬性

在上述的色譜條件下，萬古霉素與茶堿分離完全，血中內源性物質對測定無干擾（圖1），兩者的保留時間分別為10.703 min和14.021 min。

3.2線性范圍和檢測限

分別取“2.1”項下萬古霉素標準溶液與茶堿標準溶液各200 μL，加入空白血清600 μL，配制成含萬古霉素2.5～100.0 μg/mL、茶堿2.5～50.0 μg/mL的系列標準濃度血清樣本，按“2.3”項下方法進行預處理，按“2.2”項下色譜條件進行測定。分別以樣品峰面積（Y）對濃度（C）進行線性回歸。萬古霉素的標準曲線為：

Y=9 606.8C-6 962.4，

圖1　萬古霉素與茶堿的HPLC色譜圖

r=0.999 6（n=5）；

茶堿的標準曲線為：

Y=27 719C-988.52，

r=0.999 9（n=5）。結果顯示，萬古霉素在2.5～100 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，茶堿在2.5～50 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。萬古霉素最低定量限為2.5 μg/mL，最低檢測限為1.0 μg/mL。茶堿最低定量限為1.0 μg/mL，最低檢測限為0.5 μg/mL。

3.3回收率與精密度

取人空白血清，分別加入萬古霉素和茶堿標準溶液，配成萬古霉素濃度為2.5，25.0，100.0 μg/mL和茶堿濃度為2.5，20.0，50.0 μg/mL的標準濃度血樣各5份，按“2.3”項進行前處理后測定，連續測定5天。所測得藥物峰面積代入回歸方程計算測得量，以計算測得量與加入量之比即方法回收率；所測得藥物峰面積除以同一濃度的標準溶液所得峰面積，以計算提取回收率。結果見表1。由表1可見，萬古霉素和茶堿的回收率和精密度符合生物樣本的測定要求［6］。

3.4穩定性考察

3.4.14℃條件下穩定性考察分別取“2.1”項下萬古霉素標準溶液與茶堿標準溶液各200 μL，加入空白血清600 μL，配制成含萬古霉素25.0 μg/mL、茶堿20.0 μg/mL的標準濃度血清樣本5份。于4℃冰箱內分別放置0，1，3，5天和1周后按“2.3”項下操作，注入色譜儀，記錄峰面積。計算此條件下萬古霉素與茶堿峰面積RSD值，分別為4.86%與5.25%。由此可知，血清樣品在4℃條件下保存一周內可保持穩定。

表1　血清中萬古霉素與茶堿的回收率和精密度

3.4.2凍融穩定性考察配制成含萬古霉素25.0 μg/mL、茶堿20.0 μg/mL的標準濃度血清樣本5份。于-20℃冰箱內分別凍存0，1，2，3周和1月，溶解樣品后按“2.3”項下操作，注入色譜儀，記錄峰面積。計算此條件下萬古霉素與茶堿峰面積RSD值，分別為7.03%與6.86%。表明血清樣品在-20℃條件下凍存后可保持穩定。

4　結論與討論

血藥濃度監測試驗中，一般常用的樣本預處理方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等［7-10］。有文獻報道，用高濃度硫酸鋅溶液沉淀血清中的蛋白，離心后進樣［11］。但經試驗發現，經硫酸鋅溶液沉淀蛋白后的上清液仍有渾濁，經0.45 μm針頭過濾器過濾時，會堵塞過濾器，無法進樣測定。也有文獻報道，以三氯醋酸溶液作為血清蛋白沉淀劑［12-13］。試驗結果表明，以三氯醋酸溶液作血清樣本前處理時，血清中內源性物質與藥物色譜峰不能完全分離，干擾最終結果的測定。本研究以混合溶劑（甲醇-乙腈-6%高氯酸=1∶1∶6，V/V/V）作為蛋白沉淀劑，可以完全沉淀血清中蛋白，并保證樣品回收率。

文獻報道監測萬古霉素血藥濃度一般選用磷酸二氫鉀緩沖液和甲醇或乙腈作為流動相［8，12］，監測茶堿血藥濃度一般選用甲醇和水或緩沖鹽溶液作為流動相［14-15］。試驗中發現，有機相比例對藥物色譜峰保留時間影響很大；緩沖液種類與pH值的選擇決定了藥物是否能順利地從色譜柱中洗脫。經反復配比試驗，最終選擇甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（V/V，19∶81，pH=3.2）作為流動相。這一色譜條件可以很好分離萬古霉素與茶堿，且血清內源性物質對兩者的測定不產生干擾。

《中國藥典》2010年版第二部中，萬古霉素和茶堿的檢測波長分別為280 nm和271 nm［16］。由于血清樣品中藥品濃度很低，萬古霉素在280 nm檢測波長下吸收度偏低，該檢測波長不能滿足試驗需要（圖1D）。參考大量報道可知，萬古霉素在波長236 nm下有較好的紫外吸收［8，12］。茶堿在波長236 nm下有一定紫外吸收，但空白血清樣品在波長236 nm下與保留時間14 min處有一較小雜峰，該雜峰與茶堿的保留時間接近，干擾茶堿峰面積的計算（圖1A），故考慮采用雙波長法排除干擾。參考《中國藥典》2010年版中茶堿的檢測波長，在271 nm附近反復調整后發現，波長280 nm下茶堿保留時間附近無內源性雜峰干擾，且茶堿峰強度較好。因此采用雙波長檢測法，在236 nm波長下檢測萬古霉素，在280 nm波長下檢測茶堿，既保證了待測藥物的吸收度，又排除了內源性物質的干擾。

綜上，本法能夠同時測定萬古霉素與茶堿的血藥濃度，且血清取樣少，檢驗快速穩定，操作簡便，成本較低，適用于臨床監測。

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Simultaneous Determination of Plasma Concentrations of Vancomycin and Theophylline by RP-HPLC

Tang Zhe，Guan Jing（Department of Pharmacy of Maternity and Child Health Care Hospital of Nanjing City，Jiangsu Nanjing 210004，China）

Objective:To establish an analytical method for the simultaneous determination of concentrations of vancomycin and theophylline in human serum by reversed phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）so as to provide an experimental means for clinical monitoring of plasma concentrations of vancomycin and theophylline.Methods:External standard method was applied and Agilent ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used.The mobile phase consisted of methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate buffer solution（V/V，19∶81，pH=3.2），at a flow rate of 1.0 mL/min，the column was at 30℃and the dual detection wavelength was at 236 and 280 nm.Results:A good linearity ofthe concentration of vancomycin was obtained within a range of 2.5～100.0 μg/mL（r=0.999 6）and within a range of 2.5～50.0 μg/mL（r=0.999 9）for theophylline.The extraction recovery rates of vancomycin in high，medium and low concentrations were 87.28%～102.24%，the objective recovery rates were 100.89%～105.24%，the within-day relative standard deviation（RSD）of vancomycin was 0.95%～3.48%and the inter-day RSD was 3.59%～4.20%.The extraction recovery rates of theophylline in high，medium and low concentrations were 99.55%～103.46%，the objective recov-ery rates were 98.28%～99.76%，the within-day and inter-day RSD of theophylline was 0.95%～4.28% and 1.58%～3.80%respectively.Conclusion:The method is sensitive，selective，rapid，simple and accurate.It can be applied to testing clinical specimens and the study of pharmacokinetic.

RP-HPLC；Vancomycin；Theophylline；Monitoring of Blood Concentration

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.10.002

2015-06-10）

唐喆，女，碩士，主管藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：tjj870520@hotmail.com