(±)Bay K8644 提高衰老大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化能力的研究

王斯 周翠平 王敬君

骨髓間充質干細胞又稱為骨髓間充質基質細胞，其在機體的骨代謝平衡的調節中起著關鍵的作用［1，2］。人體增加和維持骨量的主要細胞來源即為BMSCs 分化所形成得成骨細胞，是人體骨骼維持健康的重要因素［1－3］。骨髓間充質干細胞的衰老是與人體的衰老一同發生發展的，隨著骨髓間充質干細胞的逐漸衰老，其成骨分化的能力開始減弱，骨生成的能力隨之降低，從而導致一系列的骨代謝性疾病［4，5］，如骨質疏松癥(Osteoporosis)等［5］。(±)Bay K8644 是一種小分子化合物，是一種特異性的L 型鈣通道激動劑，在研究中發現其能夠通過激活L 型鈣通道從而促進細胞外的鈣離子內流［6，7］。我們在小分子化合物的篩選過程中發現了(±)Bay K8644 對干細胞干性標志物Nanog 的作用，通過(±)Bay K8644 干預，Nanog 在轉錄水平的表達出現了明顯的提升。隨后我們進行了一系列的相關研究，來探明(±)Bay K8644 對衰老的骨髓間充質干細胞的干性以及衰老特征的影響，同時對BMSC 的分化能力進行了相關的檢測研究。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 24 月齡健康雌性大鼠(n =8)用于衰老的BMSCs 的分離培養。大鼠購買自河北醫科大學動物實驗中心，清潔級。

1.1.2 試劑:高糖D-MEM 細胞培養基(Hyclone，美國)、胎牛血清(Gibco，美國)，青鏈霉素(Coning，美國)，胰蛋白酶(Hyclone，美國)β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C(Merck，美國);(±)Bay K8644(Sigma，美國)、二甲基亞砜(上海第一化學廠)、β-galactosidase染色試劑盒(Beyond，中國)、堿性磷酸酶活性定量試劑盒(Beyond，中國)、堿性磷酸酶染色試劑盒(建成生物，中國);Trizol reagent(Invitrogen，美國)、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TAKALA，日本)、DEPC 水(碧云天，中國)，THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TAKALA，日本);RIPA 細胞裂解液(BD，美國)，PMSF(Sigma，美國)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(赫特生物，中國)、蛋白上樣緩沖液(loading buffer)(碧云天，中國)、PVDF 膜(0.45nm)(密理博，美國)、SDS-Page凝膠試劑盒、Tris-Glycine-SDS 電泳緩沖液、Tris-Tricine-SDS 轉膜緩沖液、牛血清白蛋白、TBS、吐溫20、anti-OCN(Abcam，美國)、ECL 顯色試劑盒(Santa Cruz，美國)。

1.2 衰老骨髓間充質干細胞的分離培養

1.2.1 細胞分離與培養:大鼠注射過量1%戊巴比妥鈉麻醉后，斷頸處死。75%乙醇浸泡消毒10 min 后，置于超凈臺內，分離其四肢長骨，剪去長骨兩端并暴露髓腔，使用5 ml 注射器吸取PBS 對髓腔進行沖洗，將沖出的骨髓于培養皿中吹打至粉碎，隨后收集組織懸液，1 500 r/min離心10 min，使用含10%胎牛血清1%雙抗的高糖D-MEM 細胞培養基重懸細胞，移入培養瓶內，置于37℃含5%二氧化碳的孵箱內培養。待細胞生長至80%時進行傳代培養，第三代細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞衰老狀態的檢測:細胞生長至80%時，使用胰蛋白酶消化細胞，并以6×104/孔的密度接種至24 孔培養板(NUNC，美國)內培養，在培養12 h 后使用β-gal 染色試劑盒進行染色。方法為吸取培養孔內的細胞培養液，使用PBS 洗滌3 次，隨后使用4%多聚甲醛于室溫固定10 min，PBS 洗滌3 次，染色工作液按說明書配置后加入培養板，于37℃無二氧化碳的孵箱過夜。第2 天在普通光學顯微鏡下進行觀察。

1.3 (±)Bay K8644 對衰老骨髓間充質干細胞的作用

1.3.1 最適作用濃度的選定:將(±)Bay K8644 溶于DMSO 內，并配置(±)Bay K8644 濃度分別為1×10－6mol/L、1 ×10－7mol/L、1 ×10－8mol/L、1×10－9mol/L的細胞培養液用于細胞培養。在培養24 h 后提取各組細胞的RNA，使用實時定量PCR 檢測目標基因Nanog 的表達。通過對不同濃度作用下，Nanog 表達的變化來選取最適的作用濃度，并用于后續的其他實驗。實時定量PCR 的檢測中，細胞接種于六孔板內進行培養和化合物的干預，在干預結束后，使用PBS 洗滌，加入1 ml/孔的Trizol，充分裂解細胞，并移入1.5 ml EP 管內，加入200 μl 氯仿混勻，于4℃離心機內12 000 r/min 離心15 min，隨后吸取上清液，加入等體積異丙醇混勻后室溫靜置20 min，于4℃離心機內12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入500 μl 冰預冷的無水乙醇，于4℃離心機內12 000 r/min 離心5 min，吸取上清后，使用DEPC 水20 μl 重懸沉淀。于酶標儀中測定獲得的RNA 濃度，并使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 反轉錄試劑盒進行mRNA 的反轉錄，每2 毫克的總RNA 用于反轉錄。使用SYBR qPCR Mix 對反轉錄所獲得的cDNA 進行實時定量PCR 的檢測，選取2 μl 的cDNA 于20 μl 的反應體系中進行反應，反應在CFX96 TM Real-Time System(Bio-Rad)中進行，每個PCR 反應體系使用2 μl 的cDNA。使用Bio-Rad CFX Manager 對結果進行統計分析。引物使用Primer Express 6.0 基于公開cDNA 序列合成，Actin 作為內參，每個PCR 的反應使用3 個副孔進行。引物序列見表1。

表1 本文所用的引物序列列表

1.3.2 細胞β-半乳糖苷酶含量的測定:細胞以6×104/孔接種至24 孔板，接種后24 h 實驗組使用含(±)Bay K8644 濃度為1×10－8mol/L 的培養液培養24 h，在干預完成后，使用β-gal 染色試劑盒對干預后的細胞進行檢測。

1.4 (±)Bay K8644 對衰老骨髓間充質干細胞成骨分化的影響

1.4.1 Aging-BMSCs 的成骨分化誘導:細胞生長至80%時，配置含50 μg/ml VC，10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，10－8mol/L 地塞米松、10%胎牛血清、100 U/ml 青鏈霉素的成骨誘導培養液，對細胞進行誘導。每3 天換液。實驗組加入(±)Bay K8644 進行化合物的干預，對照組加入等體積二甲基亞砜。

1.4.2 細胞成骨分化潛能的檢測:對細胞進行成骨分化誘導，在誘導的第7 天，分別提取細胞的mRNA 和總蛋白，對OCN 的表達進行RT-PCR 檢測和western blot 的檢測。引物序列見表1。在成骨誘導后的第3、7、14 天使用AKP 試劑盒分別對細胞進行堿性磷酸酶(ALP)活性的測定，在第14 天使用BCIP/NBT 試劑盒對細胞進行ALP 染色，在誘導的第21 天對細胞進行茜素紅的染色。細胞總蛋白的提取:吸取細胞培養液，pbs 洗滌3 次，加入含1%PMSF 的RIPA 裂解液于冰上進行細胞裂解，10 min 后使用細胞刮刮取細胞，使用移液器置于1.5 ml EP 管內，于 4℃離心機內12 000 r/min離心5 min，將上清移入新的EP 管中，使用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加入蛋白上樣緩沖液，配置濃度為2 μg/μl 的蛋白懸液，于100℃沸水中煮沸10 min 備用。

1.5 統計學分析應用SPSS 9.0 統計軟件，使用單因素方差分析進行樣本的總體比較，使用SNK 檢驗進行樣本間的相對比較，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 衰老大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養選擇健康雌性24 月齡大鼠，取股骨髓腔內的骨髓進行培養，原代培養，細胞呈集落生長，傳代培養，鏡下可見細胞形態飽滿，折光性好，生長致密。至第三代細胞進行β-gal 染色，結果證實細胞中有大量的β-gal 陽性細胞分部，因此可以證實所獲得的BMSCs 為衰老細胞，可以用于后續實驗。見圖1 ～2。

圖1 圖1 大鼠骨髓間充質干細胞培養的光鏡照片

圖2 對細胞進行β-gal 染色，可見β-gal 陽性細胞大量分部

2.2 (±)Bay K8644 對衰老骨髓間充質干細胞的作用我們首先使用實時定量PCR 檢測了在不同濃度的(±)Bay K8644 的作用下，衰老骨髓間充質干細胞內Nanog 的表達的變化。實時定量PCR 的結果表明，在(±)Bay K8644 濃度為1 000 μmol/L 時，Nanog 的表達較Control 組出現了降低，而濃度為100 μmol/L和10 μmol/L 時Nanog 的表達出現了明顯的提升，并在10 μmol/L 的作用時表達達到最高。而更低的作用濃度(1 μmol/L)的干預下，Nanog 的表達出現了降低。因此我們繼續選擇10 μmol/L 的濃度來進行后續的實驗。在β-gal 的染色的試驗中，我們用10 μmol/L 濃度的(±)Bay K8644 對實驗組細胞進行刺激，隨后染色，并使用Image Pro Plus 軟件進行分析，結果顯示實驗組陽性細胞的含量(染色面積/總面積)為(0.36±0.09)明顯低于Control 組(0.85±0.08)，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表2，圖3。

表2 不同濃度(±)Bay K8644 干預下BMSCs 的Nanog 表達

圖3 細胞使用10 μM 的(±)Bay K8644 干預后β－gal 染色陽性細胞

2.3 (±)Bay K8644 對Aging－BMSCs 成骨分化能力的影響在成骨誘導第7 天時對OCN 的表達進行RT－PCR 檢測Control OCN 表達為(1.00±0.17)，(±)Bay K8644 為(1.75±0.21)，western blot 檢測，并對所得條帶進行提及分析Control OCN 表達為(74.65±13.59)，(±)Bay K8644 為(136.98±21.14)，顯示(±)Bay K8644 明顯促進了OCN 在mRNA 和蛋白水平的表達(P ＜0.05)。在成骨誘導的第14 天對細胞進行堿性磷酸酶染色，染色結果顯示，通過(±)Bay K8644 的干預，(±)Bay K8644 深染細胞(0.82±0.23)高于Control(0.64±0.21)，差異有統計學意義(P ＜0.05)。細胞內堿性磷酸酶的活性出現了明顯的上升。而堿性磷酸酶活性的定量檢測的結果同樣顯示，實驗組的堿性磷酸酶活性在第7、14 天時較Control 組有明顯上升。這一結果表明(±)Bay K8644 能夠促進衰老骨髓間充質干細胞的成骨分化能力。在成骨誘導的第21 天，對細胞進行了茜素紅染色實驗，通過實驗證實了，(±)Bay K8644 干預后的細胞產生了更多的礦化結節為(0.92±0.22)明顯高于Control 的(0.54±0.26)，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見圖4 ～6，表3。

圖4 在成骨誘導第7 天時對OCN 的表達進行western blot 檢測結果

表3 成骨誘導的第3、7、14 天ALP 的活性 nmol/15 min/mg，±s

表3 成骨誘導的第3、7、14 天ALP 的活性 nmol/15 min/mg，±s

注:與(±)Bay K8644 組比較，*P ＜0.05

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圖5 在成骨誘導第14 天時對細胞進行堿性磷酸酶染色結果

圖6 在成骨誘導的第21 天進行茜素紅染色結果

3 討論

人體骨的形成及代謝的重要機制之一即為骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的過程［8］。在人體的衰老過程中，骨髓間充質干細胞也隨之衰老，而這一衰老的進程直接導致了其向成骨細胞分化的能力的下降，人體的骨代謝平衡被打破，骨量下降，從而導致骨質疏松等骨代謝疾病的發生和發展［4，5］。

(±)Bay K8644 是一種鈣離子通道的激動劑，由于其能夠特異性地激活L 型鈣離子通道［6］，因此在心律失常、心絞痛以及高血壓等疾病的研究中有較多的應用。而鈣離子對于人體具有極為廣泛的作用［9］，鈣離子的活動和骨折等骨疾病，以及老年病有著緊密的關系［10］。我們由此對(±)Bay K8644 與衰老干細胞之間的關系進行了相關的探索研究，并證實了(±)Bay K8644 對衰老的骨髓間充質干細胞的成骨分化的潛能有著一定的提升作用。

Nanog 是維持骨髓間充質干細胞多能性的重要核外轉錄因子［11，12］。而在衰老的骨髓間充質干細胞中，Nanog 表達下降，因此其定向分化的能力也隨之減弱［11］。在本研究中，我們發現10 μmol/L 濃度的(±)Bay K8644 能夠在mRNA 水平明顯提升Nanog 的表達，和對照組相比，實驗組的Nanog 表達提升了2 倍以上，證實了(±)Bay K8644 對于維持骨髓間充質干細胞的干性(stemness)具有一定的作用。

骨鈣素(Osteocalcin，OCN)是由成骨細胞(Osteoblasts)所特異性分泌的一種蛋白，骨鈣蛋白在骨礦化時大量合成，因此被認為是成骨分化誘導的標記之一［13，14］。在對衰老的骨髓間充質干細胞的成骨分化誘導過程中，RT-PCR 和western Blot 的結果顯示(±)Bay K8644 能夠明顯的促進衰老骨髓間充質干細胞內OCN 的表達。

綜上所述，通過我們的研究發現，(±)Bay K8644能夠使衰老的骨髓間充質干細胞的衰老狀態得到一定的改善，同時其成骨分化的潛能得到一定的提升。

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