補腎益精方含藥血清對β-淀粉樣蛋白干預血腦屏障體外模型滲透性的影響

王丹丹 史國娟 于顧然

（南京中醫藥大學附屬醫院神經內科，江蘇南京 210029）

補腎益精方含藥血清對β-淀粉樣蛋白干預血腦屏障體外模型滲透性的影響

王丹丹 史國娟 于顧然

（南京中醫藥大學附屬醫院神經內科，江蘇南京 210029）

目的：以Aβ1-42干預血腦屏障大鼠腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞共培養模型，評價補腎益精方含藥血清對該模型的滲透性的影響。方法：體外分別培養胚胎鼠腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞，鑒定并測定跨內皮細胞電阻，利用Transwell細胞培養池，建立內皮細胞和星形膠質細胞共培養的血腦屏障體外模型，將5μmol/L Aβ1-42加入大鼠腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞非接觸式共培養血腦屏障模型。分為Aβ1-42模型組和Aβ1-42加補腎益精方低、中、高劑量組，另設血腦屏障空白組，分別檢測并比較各培養組熒光素鈉的滲透性。結果：補腎益精方低、中劑量組熒光素鈉的通透性明顯低于Aβ1-42模型組（P＜0.05）。結論：補腎益精方含藥血清對Aβ1-42誘導的血腦屏障滲透性增加有抑制作用。

補腎益精方含藥血清 腦血管 內皮細胞 星形膠質細胞 血腦屏障 滲透性 體外實驗 Wistar乳鼠

阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以進行性全面認知功能損害為特征的老年變性性疾病，細胞外老年斑及神經元纖維纏結是其病理學特征［1］。在該病發病學說中，β-淀粉樣蛋白（Aβ）破壞血腦屏障功能是該病發病的重要機制［2-3］。針對該病中醫發病機理，王永炎院士提出了“毒損腦絡”理論［4］。基于AD中西醫發病機制，我們建立了Aβ干預的血腦屏障體外模型，探討我們臨床治療阿爾茲海默病常用的補腎益精方含藥血清對該模型的影響［5-6］。

1 實驗材料

1.1 實驗動物Wistar乳鼠購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，合格證號：2008001652684，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 主要試劑與耗材Aβ1-42（美國sigma公司），細胞培養瓶（美國FALCON 353014），青霉素/鏈霉素溶液（Penicillin/streptomycin solution）、0.25%胰蛋白酶（Tripsin-EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自中國南京凱基生物科技發展有限公司，DMEM高糖培養基（美國GIBCO12800-082），F12培養液（美國GIBCO 883684），胎牛血清（FBS，美國ExCell Biology FBS500），24孔細胞培養板（24 wellcell culture plate，美國Corning Incorporated 3413），96孔細胞培養板（96 wellcell culture plate，美國Corning Incorporated 3599），因子Ⅷ（Abcam ab11713），膠質纖維酸性蛋白（GFAP，博士德PB0046），內皮細胞生長因子（ECGS， Sciencell 1052），熒光素鈉（Sigma F6377）。

1.3 主要儀器與設備超凈工作臺（中國蘇州凈化SW-CJ-1FD），CO2培養箱（日本SANYO XD-101），生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51），臺式低速離心機（中國上海醫療器械股份有限公司醫療設備廠，80-2），多功能酶標儀（美國MD M3），電阻儀（美國Millipore公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養腦微血管內皮細胞（brain capillary endothelial cells，BCECs）培養：無菌條件下取Wistar乳鼠大腦，留皮質，將皮質剪碎后勻漿，勻漿液依次經100目、200目篩網過濾，收集200目濾網上物質，向其加入0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃作用30min后離心（2000r/min，10min），用完全培養液［DMEM/F12基礎培養液+15%FBS+1%（v/v）ECGS+120U/mL肝素］懸浮管底沉淀，吹打均勻后接種于預先涂有多聚賴氨酸的塑料培養瓶中，置培養箱中培養。星形膠質細胞（astrocytes，As）培養：無菌條件下取Wistar乳鼠大腦，分離大腦皮質，將皮質剪碎后在0.125%胰蛋白酶中37℃消化10min（期間每隔3min輕搖晃數次），200目篩網過濾，濾過液以1000r/min，離心2min，管底沉淀用星形膠質細胞完全培養液（DMEM/F12基礎培養液+10%FBS）懸浮后，接種于多聚賴氨酸包被的塑料培養瓶中，置培養箱中培養。

2.2 細胞鑒定細胞培養板中取出長滿腦微血管內皮細胞（或星形膠質細胞）的蓋玻片，浸入4%的多聚甲醛固定液中30min或過夜，PBS浸洗3min×3次。將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復緩沖液的燒杯中，高火檔至煮沸，將燒杯取出置于電熱器上保持微沸狀態20min，而后將燒杯浸入流水中，自然冷卻后用PBS浸洗3次。每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫（15～25℃）封閉10min，PBS浸洗3次。滴加即用型山羊血清50～100μL，室溫孵育20min；滴加一抗Ⅷ及GFAP（1∶100稀釋）50μL，37℃，濕盒孵育2h，PBS浸洗3次；滴加異硫氰酸熒光素（FITC，1∶200稀釋）二抗50μL，37℃，避光孵育1h，PBS浸洗3次。每張片子滴加配制二脒基苯基吲哚（DAPI）染液50～100μL復染，室溫避光放置5min，用防萃滅封片膠封片。

2.3 體外血腦屏障模型的建立采用Corning公司的Transwell 3413細胞培養池（PET膜材，孔徑0.22μm）作為共培養的支持物，建立大鼠腦微血管內皮細胞與星形膠質細胞非接觸式共培養模型。首先將分離的腦微血管內皮細胞接種于細胞培養池的上室，將細胞培養池置于底部含有星形膠質細胞的24孔板內，培養7d后BCEC即可形成致密單層，測定其電阻。

2.4 跨內皮細胞（BCEC）電阻的測定通過測定模型中跨BCEC的電阻值評價體外血腦屏障模型中細胞旁轉運程度。用Millicell-ERS測定共培養模型的跨內皮細胞電阻值（transendothelial electricresistance，TEER），以無細胞的培養池作為對照，測得其電阻值為濾過層的TEER［7］。通過測定BCEC兩側的電阻可以評價緊密連接形成的程度。大多數結果表明，跨細胞單層電阻值應該在300Ω·cm2以上，本實驗共培養模型的電阻值為（320.056±32.833）Ω·cm2，符合體外血腦屏障模型的要求［7］。

2.5 實驗分組與熒光素鈉通透性的測定補腎益精方含藥血清（簡稱含藥血清）包含菟絲子、蛇床子、覆盆子、楮實子、熟地黃、人參、茯苓、白術、海風藤、石菖蒲，制備方法參見文獻［6］。實驗分組：空白組（體外血腦屏障模型）、模型組（Aβ1-425μmol/L）、Aβ1-42+補腎益精方低劑量組（Aβ1-425μmol/L+10%含藥血清+20%正常血清+70%培養液）、Aβ1-42+補腎益精方中劑量組（Aβ1-425μmol/L+20%含藥血清+10%正常血清+70%培養液）、Aβ1-42+補腎益精方高劑量組（Aβ1-425μmol/L+30%含藥血清+70%培養液）。首先在供給池中加入200μL含有熒光素鈉10mg/L、不同濃度中藥組分和5μmol/L Aβ的Hanks液，在接受池中加入Hanks液，使插板內外液面平行，于10、20、30、40、60min分別從接受池中取200μL溶液，測定熒光強度，再通過熒光素鈉標準曲線，計算熒光素鈉透過血腦屏障模型及無細胞對照組的量。根據文獻報道方法計算各組血腦屏障通透性［7］。

3 實驗結果

與空白組比較，Aβ1-42模型組熒光素鈉通透性明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，補腎益精方低、中劑量組熒光素鈉通透性明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組熒光素鈉通透性比較

4 討論

AD是臨床發病率最高的癡呆類型，針對其致病毒素Aβ和Tau蛋白開發的藥物，臨床研究均證明無效，目前該病現代醫學尚無針對病因治療的藥物［8］。Aβ破壞血腦屏障功能是該病發病的重要機制［2-3］。

補腎益精方是我們依據元代宮廷醫家許國禎的《御藥院方》神仙六子丸，并根據《難經》“損其腎者益其精”理論結合臨床實踐化裁而成，有補腎益精、健脾化痰、活血化瘀之功效，臨床治療AD取得較好的療效［5］。

本研究通過測定TEER值評價血腦屏障體外模型的完整性。TEER值是反映小離子通透物理屏障的電阻抗，是公認的測定血腦屏障完整性的最精確和最敏感的指標。本研究結果顯示，補腎益精方各劑量組對Aβ1-42引起的血腦屏障破壞有保護作用，其中中劑量和低劑量的保護作用更明顯。血腦屏障的通透性是由腦微血管內皮細胞的生物學特征控制的［9］，這些特征與內皮細胞、星形膠質細胞、神經元等的相互作用有關，它們統稱為神經血管單元，形成了一個調節分子進出大腦的功能性屏障［10-12］。我們既往研究發現補腎益精方含藥血清對D-半乳糖誘導原代神經元氧化應激損傷有抑制作用［6］，本實驗顯示其對Aβ1-42誘導的血腦屏障破壞有保護作用，我們推測補腎益精方含藥血清可能通過保護內皮細胞及星形膠質細胞等的完整性而起作用。該方保護血腦屏障的分子生物學機制將是我們下一步研究的重點。

綜上，補腎活血化痰對血腦屏障損傷有保護作用，該方法可延緩或減輕Aβ引起的繼發損害。另外，該模型可用于阿爾茲海默病有效中藥篩查，為開發符合中醫理論的有效方藥提供方便高效的研究平臺。下一步研究可應用該體外模型篩查補腎益精方中有效中藥單體，進一步研究中藥對Aβ誘導血腦屏障組成成分內皮細胞、星形膠質細胞凋亡的影響，同時可研究中藥對內皮細胞膜Aβ轉運體的影響，以明確中藥保護血腦屏障的靶點。

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［6］史國娟，賀燕勤，于顧然.補腎益精方含藥血清對D-半乳糖致原代培養神經元損傷影響的研究.江蘇中醫藥，2015，47（2）：80

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R241.1

A

1672-397X（2015）10-0072-03

王丹丹（1990—），女，碩士研究生，神經內科學專業。

于顧然，醫學博士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。dr.ygrdf@163.com

2015-06-04

編輯：吳寧

國家自然科學基金資助（81573771）；江蘇省自然科學基金資助（BK20151599）；江蘇省中醫藥局基金資助（LZ13027）