脾切除對重度熱傷誘導的大鼠腸黏膜屏障破壞的影響

柳向東 李 衛 黎 明 陳振勇

(1復旦大學附屬金山醫院燒傷整形外科 上海 200540;2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院普外科 武漢 430030)

嚴重熱傷后胃腸道屏障功能下降，其原因是多方面的［1－2］。它誘發全身嚴重的應激反應，產生大量炎癥介質，包括腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)、白介素(interleukin，IL)、核因子 κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等。這些炎性因子相互作用，形成炎癥級聯反應及“瀑布樣”效應，損害腸黏膜屏障［3］。阻斷炎性因子的級聯反應可以恢復胃腸道屏障。

正常情況下，脾臟可通過其釋放的細胞因子直接或間接影響、調節腸道的免疫功能，影響腸黏膜屏障功能［4］。在應激狀況下，如急性胰腺炎等，脾臟巨噬細胞在內毒素作用下可產生大量的TNF-α、IL-6、IL-1等促炎細胞因子，參與機體的過度炎癥反應［5］。研究發現［5］，切脾后血清TNF-α、IL-1 含量和細菌移位率顯著降低，減輕腸黏膜屏障損傷，提示脾切除在阻止急性胰腺炎病情的發展中具有一定作用。

我們前期的研究顯示［2］，脾切除在短期內能降低大鼠腸黏膜通透性，對應激所導致的腸黏膜屏障破壞具有保護作用。本研究探討在重度熱傷時脾臟的保護作用。推測脾切除后，由于其分泌的細胞因子減少，能減緩嚴重熱傷后腸屏障功能障礙。

材料和方法

動物模型制備及分組 健康Wistar大鼠80只，雌雄不限，體質量200～300 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，按隨機數字表法分成對照組、熱傷組(B組)，熱傷+脾切除7天組(B+SP7組)和熱傷+脾切除14天組(B+SP14組)，每組20只。大鼠實驗前禁食12 h，10%水合氯醛(0．3 g/kg)腹腔注射麻醉，背部剃毛。對照組置剃毛區于25℃水浴18 s;實驗組92℃水浴18 s，造成30%III度燙傷(病理證實)［6］;熱傷 +脾切除組在制造熱傷模型同時左肋緣下切口(1．5 cm)行脾切除，雙層關閉切口，傷后立即以40 mL/kg等滲鹽水腹腔注射抗休克，清醒后均經口給與廣譜抗生素治療。脾切除組大鼠分別于傷后7天及14天腔靜脈抽血后處死。

血清內毒素水平測定 取上述血液標本1 mL，2 000 r/min離心15 min，置于無熱原肝素抗凝試管中，通過鱟試驗動態濁度法(動態測定試劑盒，上海市醫學化驗所)測定血清內毒素水平(所有器皿均去內毒素處理)，按說明書并參考文獻［7］進行操作。

血清炎癥因子的檢測 采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各血清標本內TNF-α和NF-κB含量，按照試劑盒 (北京晶美生物工程有限公司)說明書逐步操作。

腸黏膜形態學分析 無菌條件下距回盲部10 cm處環形切取回腸，一部分于40 g/L甲醛中固定，石蠟包埋切片，光鏡下觀察腸黏膜上皮結構。用高清晰度彩色病理圖文分析系統(HPIAS 1000型，武漢千葉公司)，在計算機圖像分析系統的高倍視野(×400)下隨機選取5個視野，用目鏡測微器測量絨毛高度及黏膜厚度。每個標本觀察2張切片，每張切片測量3個絨毛，最后取平均值。

ZO-1和閉鎖蛋白Western blot檢測 備用的黏膜組織100 mg，加入1 mL裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5，1%Triton X-100，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF)和10 mL緩沖液 (10 mmol/L Tris-HCl，pH 7．5，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，0．1%SDS，1 mmol/L脫氧膽酸鈉，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF)，組織粉碎，勻漿，冰浴30 min;4℃ 2 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法用紫外可見分光光度儀測定蛋白濃度，并用蒸餾水將各樣本統一稀釋為5 μg/μL，－70℃保存。各取樣本10 μL及5 μL的預染 Marker，加入上樣緩沖液;混合后100℃煮沸蛋白變性5 min，分別經7．5%和12%SDS-PAGE凝膠電泳分離1 h或2 h。電轉30 min;取出硝酸纖維膜，轉移至染色液中染色1 min，標記，用含5%脫脂奶粉的TBS-T(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7．2，150 mmol/L NaCl，0．1%Tween 20)洗膜數次。浸入封閉液中封閉1 h。分別加一抗ZO-1和Occludin抗體(均購自北京晶美生物工程有限公司)，均以1∶1 000稀釋;以βactin(武漢博士德產品)為內參，1∶2 000稀釋，4℃孵育過夜。加入1∶2 000的二抗［四甲基異硫酸羅丹明(TRITC)-山羊抗兔IgG］室溫下孵育1 h。將膜放入顯色液中，震蕩孵育5～10 min，暗室下膠片顯影，掃描。Olympus BX41圖像采集系統收集圖片信息，Photoshop軟件定量測量平均吸光度(D)值，以樣本D值/同一樣本內β-actin蛋白D值來代表樣本的相對表達量。

結 果

脾切除前后熱傷大鼠血清內毒素的變化 實驗過程中熱傷組死亡1只，熱傷+脾切除組各死亡2只。由于血清內毒素能間接反映腸黏膜通透性，我們通過血清內毒素進行比較，發現熱傷組較對照組上升301%，而B+SP7組僅上升226%(P＜0．01)，B+SP14組的上升幅度(264%)接近熱傷組(P＞0．05)。說明脾切除7天后降低了內毒素水平，且B+SP14組的內毒素高于B+SP7組(表1)。

表1 脾切除前后熱傷大鼠血清內毒素的變化差值Tab 1 The change value of serum endotoxin levels in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

表1 脾切除前后熱傷大鼠血清內毒素的變化差值Tab 1 The change value of serum endotoxin levels in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．05．

Serum endotoxin(EU/mL) 0．267 ±0．06 1．071 ±0．29(1)0．872 ±0．18(1)(2)0．972 ±0．17(1)

血清NF-κB和TNF-α檢測結果 參與炎癥反應的細胞因子較多，其中內毒素可激活單核或巨噬細胞的NF-κB，啟動 TNF、IL-6等基因轉錄，參與對炎癥反應和腸黏膜屏障的調控，我們選擇NF-κB和TNF-α作為脾臟參與應激反應的信號機制的研究對象。實驗發現接受熱傷刺激后大鼠血清NF-κB和TNF-α 均明顯升高(247%，607%，P＜0．01)，B+SP7組NF-κB和TNF-α的升高幅度(173%，370%)均低于B組 (P＜0．01)，而B+SP14組僅TNF-α上升幅度高于B+SP7組(P＜0．01，表2)。

表2 脾切除對熱傷大鼠血清TNF-α和NF-κB的影響Tab 2 The levels of NF-κB and TNF-α in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

表2 脾切除對熱傷大鼠血清TNF-α和NF-κB的影響Tab 2 The levels of NF-κB and TNF-α in thermal trauma rats after splenectomy (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．01;(3)vs．B+SP7 group，P＜0．05．

TNF-α(μg/mL) 14．0 ±3．03 99．1 ±18．1(1))65．8 ±19．2(1)(2))76．3 ±14．3(1)(2)(3

小腸黏膜形態學的改變 光鏡下觀察對照組黏膜上皮結構完整，熱傷后各實驗組小腸黏膜都有不同程度的萎縮，以B組更加明顯(圖1)。各組平均腸絨毛高度和黏膜厚度與對照組相比下降明顯(P＜0．01)，其中 B+SP7組和 B+SP14組下降幅度均較B組小(P＜0．01)，但B+SP7組與B+SP14組之間差異無統計學意義(P＞0．05)。說明切脾對腸黏膜形態的破壞具有保護作用，但腸黏膜形態的破壞短期內無法恢復(表3)。

圖1 小腸黏膜形態學改變(HE×20)Fig 1 Histologic sections of distal ileum mucosa(stained with HE×20)

表3 脾切除大鼠小腸黏膜形態學改變Tab 3 The changes of morphology of intestine inburned-rats after splenectomy (±s)

表3 脾切除大鼠小腸黏膜形態學改變Tab 3 The changes of morphology of intestine inburned-rats after splenectomy (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．01．

ZO-1和閉鎖蛋白的Western blot檢測結果腸黏膜的通透性與腸上皮的緊密連接蛋白有關，我們通過對緊密連接蛋白的研究進一步探討脾臟對腸黏膜屏障的影響機制。以β-actin為內參，ZO-1蛋白條帶相對分子質量(Mr)約為210×103，閉鎖蛋白條帶為80×103(圖2)。用圖像分析儀測量條帶的平均吸光度值(D)，定量結果分析表明，B組的ZO-1和閉鎖蛋白的D值較對照組分別下降53．3%、46．3%(P＜ 0．01)，B+SP7 組僅下降36．7%、30．2%，B+SP14組下降30%、36%，下降幅度均小于B組(P＜0．01)，其中B+SP7組的閉鎖蛋白下降值高于B+SP14組(表4)。

圖2 ZO-1和閉鎖蛋白的Western blot檢測結果Fig 2 The expression of intestinal ZO-1 and occludin after burn and splenectomy by Western blot

表4 各組ZO-1和閉鎖蛋白平均吸光度值比較Tab 4 The values of optical density of ZO-1 and occludin protein in different groups (±s)

表4 各組ZO-1和閉鎖蛋白平均吸光度值比較Tab 4 The values of optical density of ZO-1 and occludin protein in different groups (±s)

(1)vs．Control group，P＜0．01;(2)vs．Burn group，P＜0．01．

Values of optical density(D)Occludin 2．42 ±0．23 1．30 ±0．27(1)1．69 ±0．28(1)(2)2．06 ±0．30(1)(2)

討 論

嚴重熱傷會導致急性胃腸黏膜缺血及內臟血流減少，由此引起胃腸道功能障礙，表現為麻痹性腸梗阻、胃擴張、胃分泌增多和潰瘍形成［5］，并進一步導致全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙的發生。熱傷后腸道屏障功能受損的機制包括缺血缺氧性損害、缺血再灌注、內毒素、炎性介質產生、營養代謝障礙等，其中炎性介質具有重要作用。熱傷能激活巨噬細胞和單核細胞分泌大量炎性介質如 TNF-α、IL-6、血小板 活化因 子、NO 等［6］。這些炎性因子相互作用，形成網絡，造成“瀑布樣”效應。

從我們的實驗來看，重度熱傷后7天和14天，血清內毒素水平明顯升高，而血清內毒素反映腸黏膜通透性，因此傷后實驗動物的腸黏膜屏障受損，通透性增加。B+SP14組的內毒素增加值小于B+SP7組，即B+SP14組的腸黏膜屏障受損較輕，也說明熱傷后腸黏膜的損傷隨時間的推移而恢復。同時血清NF-κB和TNF-α較對照組明顯上升。從形態上看，熱傷后腸絨毛高度和黏膜厚度也明顯下降，說明熱傷后血漿內毒素、NF-κB、TNF-α和腸絨毛形態的變化具有一致性，也進一步證實了重度熱傷引起的腸黏膜形態和功能的改變與炎癥介質有關［6］。

轉錄調節因子NF-κB通過誘導多種細胞因子(IL-6、TNF等)、黏附分子、趨化因子的基因轉錄表達［5］，促進TNF激活炎性細胞，增強其吞噬殺傷功能，誘導它們釋放炎性蛋白和炎性介質如NO、氧自由基等，參與炎性反應放大與延續。本研究表明TNF也介導腸上皮細胞緊密連接蛋白的通透性增加。

既然熱傷引起的腸黏膜通透性的改變與炎性介質有關，因此阻斷炎性介質的釋放能改善受損的腸黏膜［8］。本實驗中大鼠脾切除7天后，其內毒素水平也較對照組升高，但升高幅度小于有脾動物(即熱傷組);術后14天升高幅度進一步減少。說明脾切除對腸黏膜屏障有保護作用。研究脾切除后細胞因子的變化，NF-κB、TNF-α 均較有脾動物下降，說明脾臟對腸黏膜屏障的調整部分是通過細胞因子NF-κB、TNF-α 而實現的。

同時，我們也發現B+SP14組TNF-α上升幅度高于B+SP7組，說明脾切除對TNF-α上升的抑制是短時間的，而NF-κB的變化兩組間沒有差異，可能的原因是血清TNF-α主要來源于脾臟，而NF-κB來源更廣泛［4］。脾切除對腸黏膜的保護僅僅是短期效應，可能在于切脾后雖然近期內炎性因子釋放減少，腸道屏障損傷和腸源性感染的發生率降低，但切脾后機體丟失大量的免疫細胞，阻礙了抗體和免疫調節因子的形成，使機體處于一種免疫功能低下的狀態，脾臟免疫因子對腸道免疫功能的調節、協同作用減弱，因此一段時間后脾切除的不良作用即呈現出來。

我們通過對腸上皮緊密連接蛋白的研究進一步探討脾臟對腸黏膜屏障的影響機制。腸黏膜通透性的維持依賴腸上皮細胞間的緊密連接［6］。腸黏膜上皮緊密連接是由一系列的細胞質蛋白、細胞骨架元素和幾種跨膜蛋白組成，包括 ZO-1、Occludin、Claudin家族等［9］。其中ZO-1與細胞內細胞骨架肌動蛋白相連，使細胞內細胞骨架與胞外連接蛋白實現信號溝通，腸上皮Occludin的檢測不僅可以反映腸道屏障的破壞情況，還可以反映外科創傷后腸道屏障的恢復程度。應激狀況下，腸緊密連接蛋白的分布和數量均發生改變［10］。我們選擇其中關鍵的緊密連接蛋白ZO-1和Occludin作為研究對象。研究發現，重度熱傷后ZO-1和Occludin均明顯下降。而切脾動物的下降值較少，其下降幅度與TNF-α的上升呈正相關，說明脾切除后，減少了炎性因子的釋放，減弱了炎性反應，恢復了腸上皮緊密連接蛋白的分布和數量，對腸黏膜屏障具有保護作用。

［1］ Costantini TW，Peterson CY，Kroll L，et al．Role of p38 MAPK in burn-induced intestinal barrier breakdown［J］．J Surg Res，2009，156(1):64 －69．

［2］ 陳振勇，馮賢松，楊鵬，等．脾切除對大鼠腸黏膜屏障的影響［J］．華中科技大學學報:醫學版，2010，39(3):387－390．

［3］ 胡森，耿世佳，吳靜堡，等．35%TBSAⅢ度燙傷大鼠腸內補液時葡萄糖電解質液的吸收效率研究［J］．解放軍醫學雜志，2008，33(6):640 －642．

［4］ Noel G，Guo X，Wang Q，et al．Post burn monocytes are the major producers of TNF-alpha in the heterogenous splenic macrophage population［J］．Shock ，2007，27(2):312 －319．

［5］ Schwacha MG，Thobe BM，Daniel T，et al．．Impact of thermal injury on wound infiltration and the cermal inflammatory response［J］．J Surg Res，2010，158(1):112 － 120．

［6］ Shao L，Zhu Q，Feng W， et al．Observation of microvasculature in intestinal wall after burn in rats［J］．Anal Quant Cytol Histol，2007，29(3):166 －172．

［7］ Shao L，Huang Q，HeM，et al．Changes of occludin expression in intestinal mucosa after burn in rats［J］．Burns，2005，31(7):838 －844．

［8］ Costantini TW，Loomis WH，Putnam JG，et al．Pentoxifylline modulates intestinal tight junction signaling after burn injury:effects on myosin light chain kinase［J］．J Trauma，2009，66(1):17－25．

［9］ Costantini TW，Deree J，Loomis W，et al．Phosphodiesterase inhibition attenuates alterations to the tight junction proteins occludin and ZO-1 in immunostimulated Caco-2 intestinal monolayers．［J］．Life Sci，2009，84(1 －2):18 － 22．

［10］ 張明鳴，程驚秋，陸燕蓉，等．不同營養支持途徑對外科創傷應激后相關腸黏膜形態和屏障功能影響的實驗研究［J］．四川大學學報:醫學版，2009，4(4):615 －618．