鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化損傷的影響

杜學(xué)柯，潘靈輝，裴圣林，葛萬運(yùn)

鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化損傷的影響

杜學(xué)柯，潘靈輝，裴圣林，葛萬運(yùn)

目的探討鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法用過氧化氫（H2O2）加入A549細(xì)胞培養(yǎng)液中制成A549細(xì)胞氧化損傷模型，實驗分為空白對照組（C組）、H2O2處理組（H組）和鹽酸戊乙奎醚-過氧化氫處理組（P組）。用MTT方法測A549細(xì)胞存活率，用TUNEL方法測定細(xì)胞凋亡指數(shù)，并測定細(xì)胞內(nèi)的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）含量。結(jié)果與C組比較，H組的細(xì)胞存活率下降，凋亡指數(shù)增加，MDA含量上升，SOD、GSH、NADPH的含量下降（P＜0.05）。與H組比較，P組的細(xì)胞存活率增加，凋亡指數(shù)下降，MDA含量下降，SOD、GSH、NADPH的含量增加（P＜0.05）。結(jié)論鹽酸戊乙奎醚對A549細(xì)胞過氧化損傷具有保護(hù)作用。

鹽酸戊乙奎醚；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；A549細(xì)胞；氧化損傷

肺泡上皮屏障功能損傷是肺損傷發(fā)生的關(guān)鍵，而肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是肺泡上皮屏障的重要組成部分，其損傷及修復(fù)過程，是急性肺損傷發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。鹽酸戊乙奎醚具有抗炎、抗凋亡的作用，對膿毒血癥造成的臟器損傷具有保護(hù)作用［1］。研究表明鹽酸戊乙奎醚能改善已有肺疾病患者的呼吸力學(xué)指標(biāo)［2］，對肺功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是下調(diào)肺內(nèi)Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)，抑制與TLR4信號傳導(dǎo)通路有關(guān)的下游炎癥細(xì)胞因子。但鹽酸戊乙奎醚在體外對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用尚少見報道。本研究在過氧化氫（H2O2）攻擊損傷肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞基礎(chǔ)上，觀察鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的氧化損傷是否具有保護(hù)作用，探討抗膽堿藥物防治急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）潛在的可能性。

1 材料與方法

1.1實驗材料肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549細(xì)胞株，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供；高糖DMEM培養(yǎng)液、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；小牛血清和胰蛋白酶購自武漢飛羿科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自華美生物公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物制品所；實驗儀器由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、氧化應(yīng)激處理和分組人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞A549細(xì)胞在含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天更換培養(yǎng)基，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗處理。氧化應(yīng)激處理方法：將細(xì)胞分為空白對照組（C組）；H2O2處理組（H組），用500 μmol/L H2O2處理A549細(xì)胞；鹽酸戊乙奎醚-過氧化氫處理組（P組），預(yù)先20 min給予2 mg/L鹽酸戊乙奎醚［3］，然后加入500 μmol/L H2O2處理A549細(xì)胞4 h。

1.3MTT法檢測細(xì)胞存活率用0.25%胰蛋白酶消化，以1.5×104/L密度的細(xì)胞接種到96孔板，每孔100 μL，每孔設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h后，棄培養(yǎng)液。以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液作空白對照，按上述方法處理各組后，加入無血清培養(yǎng)基100 μL和MTT溶液20 μL（5 g/L）37℃培養(yǎng)4 h顯色。加入DMSO 150 μL，振蕩至結(jié)晶物充分溶解后，空白對照調(diào)零，用酶聯(lián)免疫儀測各孔波長在490 nm處的光密度值（OD490）。細(xì)胞存活率計算公式：細(xì)胞存活率=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。

1.4細(xì)胞凋亡指數(shù)的測定采用TUNEL方法測定，在光鏡下細(xì)胞核呈棕褐色視為陽性凋亡細(xì)胞，此外部分細(xì)胞漿也可因核內(nèi)DNA碎片的逸出呈棕褐色。高倍鏡（400倍）下，任選3個視野，每個視野中計100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)為凋亡指數(shù)。

1.5各組細(xì)胞內(nèi)NADPH、還原型谷胱甘肽（GSH）、SOD、MDA水平的監(jiān)測以1×105/L密度的細(xì)胞接種到24孔板上，每孔0.5 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h后。按上述方法處理各組，每組設(shè)3個復(fù)孔。處理后，棄培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化，等量PBS液收集細(xì)胞。超聲細(xì)胞破碎儀破碎后，按照相關(guān)試劑盒說明進(jìn)行測定。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTT結(jié)果和凋亡指數(shù)與C組比較，H組和P組細(xì)胞存活率下降，凋亡指數(shù)增加，與H組比較，P組的細(xì)胞存活率增加，凋亡指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1Comparison of viability and apoptotic rate of A549 cells between three groups表1 3組細(xì)胞的存活率和凋亡指數(shù)（n=3，%，）

Tab.1Comparison of viability and apoptotic rate of A549 cells between three groups表1 3組細(xì)胞的存活率和凋亡指數(shù)（n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與H組比較，P＜0.05；表2同

細(xì)胞存活率93.3±0.4 66.5±3.9a86.6±1.8ab69.420＊＊組別C組H組P組F凋亡指數(shù)6.6±0.6 32.9±3.9a21.4±2.3ab74.534＊＊

2.2鹽酸戊乙奎醚對H2O2損傷的549細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響與C組比較，H組MDA水平明顯增高，SOD、GSH和NADPH含量下降；與H組比較，P組MDA水平明顯降低，SOD、GSH和NADPH含量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of MDA，SOD，GSH and NADPH contents between three groups表2 3組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、GSH和NADPH含量的比較（n=3，）

Tab.2Comparison of MDA，SOD，GSH and NADPH contents between three groups表2 3組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD、GSH和NADPH含量的比較（n=3，）

SOD（U/mg）19.663±0.614 15.559±0.612a 17.372±0.451ab 39.849＊＊組別C組H組P組F MDA（nmol/L）8.167±0.315 11.963±0.745a 9.422±0.407ab 41.054＊＊GSH（U/mL）34.230±0.543 27.401±0.713a 30.633±0.556ab 94.348＊＊NADPH（μmol/L）10.701±0.797 6.387±0.595a 8.486±0.395ab 36.565＊＊

3 討論

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有修復(fù)功能，通過其自身的鈉通道和鈉泵來維持肺泡的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。同時具有自然免疫功能，在細(xì)胞受損或者感染時，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞可以分泌趨化因子和細(xì)胞因子而顯著增強(qiáng)肺臟的防御能力。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷必然導(dǎo)致肺泡屏障功能的破壞，引起細(xì)菌和病毒的入侵，同時啟動肺內(nèi)局部及全身炎癥免疫反應(yīng)，導(dǎo)致ARDS的發(fā)生。因此減輕肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損害，維持其正常結(jié)構(gòu)和功能在治療ARDS過程中起著重要作用。

非神經(jīng)性乙酰膽堿及其受體表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞，其作用是調(diào)節(jié)這些非神經(jīng)依賴細(xì)胞的基本生物學(xué)功能：增殖、凋亡、細(xì)胞因子的釋放等。鹽酸戊乙奎醚具有選擇性M1、M3和N1、N2受體拮抗作用，對外周有很強(qiáng)的抗膽堿作用［4］。研究表明在心肺轉(zhuǎn)流術(shù)中鹽酸戊乙奎醚可能通過調(diào)節(jié)腸內(nèi)微循環(huán)，保護(hù)腸黏膜屏障，抑制全身炎癥反應(yīng)［5］。動物研究結(jié)果顯示鹽酸戊乙奎醚抑制P38MAPK和NF-kappaB的激活，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和凋亡，從而對腎臟缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用［6］。此外也可上調(diào)肺組織內(nèi)的水通道蛋白5（AQP5）的表達(dá)，減輕肺水腫，減輕肺臟氣體交換損害和肺組織形態(tài)學(xué)變化。鹽酸戊乙奎醚的應(yīng)用可以上調(diào)實驗動物肺內(nèi)β-arrestins的表達(dá)從而減輕肺毛細(xì)血管的通透性，同時使肺內(nèi)髓過氧化物酶（MPO）活性顯著下降、降低血管黏附分子-1的表達(dá)［7］。而抗膽堿能藥物鹽酸戊乙奎醚對肺泡上皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用尚少見報道。

本研究設(shè)想鹽酸戊乙奎醚對肺泡上皮細(xì)胞通過氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致肺部疾病的重要病理生理基礎(chǔ)，因此通過氧化應(yīng)激建立肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷模型，檢測MDA、SOD、GSH和NADPH含量來證實。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最重要的代謝產(chǎn)物之一，其含量水平反映了組織中氧自由基含量及細(xì)胞損傷程度的水平。SOD、GSH是體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，NADPH作為體內(nèi)重要的供氫體，主要參與多種活性物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)化，它的耗竭使得細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)的生物合成受到障礙，其水平可間接反映細(xì)胞抗氧化損傷的能力。本研究結(jié)果顯示預(yù)先給予鹽酸戊乙奎醚可減輕過氧化氫對肺泡Ⅱ型細(xì)胞的損傷作用，抑制MDA的形成，增加SOD、GSH和NADPH含量，減輕氧化損傷，提高細(xì)胞存活率，減低細(xì)胞凋亡指數(shù)。從細(xì)胞水平證實體外氧化應(yīng)激損傷時，鹽酸戊乙奎醚對肺泡Ⅱ型細(xì)胞具有保護(hù)作用。此外，與對照組比較，P組的MDA水平明顯增高，SOD、GSH和NADPH含量下降，說明鹽酸戊乙奎醚僅能部分減輕氧化損傷，不能完全阻斷損傷。但其機(jī)制還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

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（2014-08-21收稿 2015-02-12修回）

（本文編輯 魏杰）

Protective effects of penehyclidine hydrochloride on A549 cells against oxidative injury

DU Xueke，PAN Linghui，PEI Shenglin，GE Wanyun
Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

ObjectiveTo explore the effects of penehyclidine hydrochloride（PHC）on lung epithelial typeⅡcells against oxidative stress damage.MethodsA549 cells treated with H2O2were used as oxidative stress damage cell model. A549 cells were divided into 3 groups:control group（C group），H2O2treated group（H group）and PHC treated group（P group）.The viability of A549 cells was measured by MTT assay.The apoptotic rate was measured by TUNEL assay.The lev?els of malonicdialed（MDA），reactive oxygen species（SOD），reduced glutathione hormone（GSH）and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）of cells were detected by biochemistry colorimetry.ResultsCompared with group C，the viability of A549 and the contents of SOD，GSH and NADPH were significantly decreased in group H，while MDA content and apoptotic rate were increased（P＜0.05）.Compared with group H，the viability of A549，the contents of SOD，GSH and NADPH were significantly increased in group P，while MDA content and apoptotic rate were reduced（P＜0.05）.Conclu?sionPenehyclidine hydrochloride shows protective effects on A549 cells through reducing the oxidative damage induced by H2O2.

penehyclidine hydrochloride；lung epithelial typeⅡcells；A549；oxidative stress damage

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.005

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金項目（2013GXNSFBA019182）

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科（郵編530021）

杜學(xué)柯（1981），男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸急救方面研究