糖腎方對2型糖尿病大鼠肝臟氧化應激水平及病理改變的影響

李忻，顧立剛，趙婷婷，楊鑫，張韞，張浩軍，嚴美花，董晞，趙海玲，文玉敏，李平△

糖腎方對2型糖尿病大鼠肝臟氧化應激水平及病理改變的影響

李忻1，2，顧立剛1，趙婷婷2，楊鑫2，張韞2，張浩軍2，嚴美花2，董晞2，趙海玲2，文玉敏2，李平2△

目的觀察糖腎方對2型糖尿病大鼠肝臟氧化應激水平及病理改變的影響，并探討其可能的機制。方法采用高脂飼料喂養和小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔內注射方法，建立2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝動物模型。將造模成功的大鼠隨機分為正常組、模型組、糖腎方組和二甲雙胍組，比較各組大鼠血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（CHO）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，肝組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、維生素E（VE）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）水平，并在光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理形態學改變。結果與模型組相比，二甲雙胍組和糖腎方組大鼠表現狀態較好，毛色較光澤，糞便成形；二甲雙胍組和糖腎方組大鼠的肝臟質量和肝臟質量指數較模型組明顯下降，2組大鼠血清ALT、AST、TG、CHO、LDL-C水平顯著降低。與模型組相比，糖腎方組大鼠肝組織勻漿中SOD、CAT、VE水平明顯升高，NO、NOS水平減低；二甲雙胍組大鼠肝組織勻漿中SOD、CAT水平明顯升高，NO、NOS水平減低。HE染色顯示二甲雙胍組和糖腎方組較模型組大鼠肝細胞脂肪變性明顯減少，肝細胞排列基本規則。結論糖腎方可改善2型糖尿病大鼠肝功能，降低血脂水平，減輕肝臟脂質沉積，其作用機制可能與其清除脂質過氧化物，改善肝組織氧化應激水平有關。

糖腎方；糖尿病，2型；肝損傷；氧化性應激

糖尿病是一組由遺傳以及環境因素相互作用導致的代謝性疾病，嚴重威脅人類的健康。糖尿病合并非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver dis?ease，NAFLD）是其并發癥之一，發病率逐年增加，但發病機制尚未完全明確。有研究發現NAFLD患者的氧化應激水平高于正常人群，說明氧化應激與其病因和發病機制有著密切關系［1］。本課題組在進行中藥干預糖尿病并發癥的實驗研究時發現糖尿病腎病大鼠存在肝損傷［2］。糖腎方由黃芪、生地、三七等藥組成，具有益氣養陰、活血化瘀的功效。中醫理論認為肝與腎的關系密切，即“肝腎同源”。糖尿病癥狀的出現與肝腎功能失調關系較為密切，特別是并發糖尿病腎病和糖尿病肝損傷時，其發生與肝腎陰虛、瘀血阻絡密切相關。糖腎方可以改善糖尿病腎病大鼠的腎損傷［3］，但對肝臟的保護作用還鮮見報道。本實驗對糖尿病大鼠給予糖腎方治療，通過觀察其血脂水平以及肝臟氧化應激和肝臟病理學的變化，探討糖腎方在降低糖尿病大鼠血脂和保護肝臟中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物雄性Wistar大鼠47只，6周齡，體質量160～180 g，購自北京華阜康實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2010-0001。飼養于中日友好醫院臨床研究所動物室（SPF級）。

1.2藥物與飼料糖腎方配方顆粒由黃芪、生地、三七、大黃等藥物組成，江陰天江藥業有限公司加工，4 g/袋，批號060632。鹽酸二甲雙胍片（格華止）：中美上海施貴寶制藥有限公司，規格0.5 g/片，批號1205102。高脂飼料成分：38%脂肪，12%蛋白質，50%碳水化合物。

1.3主要試劑及儀器

1.3.1主要試劑超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、維生素E（vitamin E，VE）、一氧化氮（nitricoxide，NO）、一氧化氮合酶（NO synthetase，NOS）和三酰甘油（triglyceride，TG）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3.2實驗儀器代謝籠（蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司）；One Touch UltraII穩豪血糖儀（美國強生公司）；全自動生化分析儀（美國CD-1600）；滑走式切片機（日本SAKURA）；奧林巴斯BX-51顯微鏡，DP70圖像采集系統（日本OLYMPUS）。

1.4模型建立及實驗分組將大鼠適應性喂養3 d后，測量血糖、體質量，剔除指標異常的動物，將動物按隨機數字表法分為正常組（n=12）和模型組（n=35）。正常組大鼠給予普通飼料，模型組大鼠給予高脂飼料，5周后，取正常組和模型組大鼠各4只，參照文獻［4］進行胰島素鉗夾實驗。模型組大鼠葡萄糖輸注率顯著低于正常組，表明模型大鼠出現了胰島素抵抗，模型大鼠參照文獻［5］以25 mg/kg體質量給予1%的鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射，72 h后測定空腹血糖，大于11.1 mmol/L視為造模成功。將成模動物35只按隨機數字表法隨機分成3組：模型組14只，二甲雙胍組10只，糖腎方組11只。正常組和模型組均給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；二甲雙胍組給予500 mg/（kg·d）二甲雙胍，混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；糖腎方組給予1.67 mg/（kg·d）糖腎方，混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。均是1次/d灌胃給藥，10 mL/次，連續給藥20周。

1.5檢測指標

1.5.1一般情況密切觀察大鼠精神狀態、反應性、毛發色澤、飲食及排泄狀況。每周稱大鼠的體質量。實驗結束，各組大鼠水合氯醛腹腔麻醉，取出肝臟后稱其質量，計算肝臟質量指數=肝臟質量/體質量×100%。

1.5.2血生化指標自腹主動脈取血5 mL，離心取血清，用自動血生化分析儀測定血清丙氨酸轉氨酶（aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、TG、總膽固醇（cholesterol，CHO）和低密度脂蛋白膽固醇（low den?sity lipoprotein-cholesterol，LDL-C）的含量。

1.5.3肝臟組織中肝組織SOD、CAT、VE、NO和NOS水平測定分離肝組織做成肝組織勻漿液，按試劑盒方法進行檢測。

1.5.4肝臟組織學觀察摘取大鼠肝臟右葉相同部位組織一塊，冰生理鹽水清洗后，10%福爾馬林固定72 h后制備4 μm石蠟切片，用蘇木素伊紅染色。光鏡下觀察肝組織脂肪變性、炎癥、壞死等病理變化。

1.6統計學方法應用SPSS 13.0統計軟件處理，實驗數據以表示。多組比較采用One-way ANOVA，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1一般情況正常組大鼠表現狀態良好，正常飲食、飲水，毛色光澤，糞便成形；模型組大鼠進食量增加、飲水量增加、尿量增多，開始消瘦，毛色凌亂無光澤，活動減少。二甲雙胍組和糖腎方組大鼠的狀態較模型組均有改善。模型組、二甲雙胍組、糖腎方組的體質量低于正常組，糖腎方組和二甲雙胍組的肝臟質量和肝臟質量指數低于模型組，且糖腎方組高于二甲雙胍組（P＜0.05），見表1。

Tab.1Comparison of body weights，liver mass and liver mass indexes between four groups表1 各組大鼠體質量、肝臟質量及肝臟質量指數比較

Tab.1Comparison of body weights，liver mass and liver mass indexes between four groups表1 各組大鼠體質量、肝臟質量及肝臟質量指數比較

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與二甲雙胍組比較，P＜0.05；表2、3同

組別正常組模型組二甲雙胍組糖腎方組F n 12 14 10 11體質量（g）698.79±97.26 488.58±80.28a 478.12±93.85a 480.15±62.70a 7.379＊＊肝臟質量（g）14.96±2.60 23.91±4.29a 18.04±2.55ab 20.25±2.55abc 24.796＊＊肝臟質量指數（%）2.16±0.39 4.89±0.59a 3.72±0.48ab 4.22±0.42abc 76.335＊＊

2.2 糖腎方對血清學指標的影響ALT：模型組、二甲雙胍組、糖腎方組高于正常組，二甲雙胍組、糖腎方組低于模型組（P＜0.05）。AST、TG：模型組高于正常組、二甲雙胍組、糖腎方組（P＜0.05），后3組無明顯差異（P＞0.05）。CHO：模型組高于正常組、二甲雙胍組、糖腎方組，糖腎方組高于正常組（P＜0.05）。LDL-C：模型組高于正常組、二甲雙胍組、糖腎方組，糖腎方組高于正常組和二甲雙胍組（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of serum markers between four groups表2 各組大鼠血清學指標比較

Tab.2Comparison of serum markers between four groups表2 各組大鼠血清學指標比較

組別正常組模型組二甲雙胍組糖腎方組F n 12 14 10 11 ALT（IU/L）53.60±9.03 174.25±33.70a 93.52±35.11ab 121.77±41.68ab 17.713＊＊AST（IU/L）151.44±22.93 199.08±55.35a 127.70±28.84b 149.40±33.95b 10.603＊＊組別正常組模型組二甲雙胍組糖腎方組F n 12 14 10 11 TG（mmol/L）0.42±0.27 1.17±0.53a 0.50±0.27b 0.60±0.29b 69.711＊＊CHO（mmol/L）2.15±0.32 4.61±2.37a 2.39±0.57b 2.82±0.71ab 48.287＊＊LDL-C（mmol/L）0.51±0.10 2.77±1.20a 0.70±0.31b 1.68±0.85abc 14.239＊＊

2.3肝臟組織學正常組大鼠肝臟組織結構清晰，肝索呈放射狀分布，肝細胞形態規則，大小如常，無明顯的脂肪變性和炎癥。模型組大鼠肝小葉輪廓基本消失，肝細胞索模糊，肝竇變窄，胞質內充滿大量大小不等的圓形脂滴，存在炎性細胞浸潤，部分肝細胞呈氣球樣變。糖腎方組和二甲雙胍組大鼠肝小葉結構完整清晰，肝細胞形態規則，其脂肪變少見，炎癥程度較模型組改善，見圖1。

Fig.1HE staining of rat liver tissues in four groups（HE，×100）圖1 糖腎方對2型糖尿病大鼠肝臟病理觀察（HE，×100）

2.4對大鼠肝臟抗氧化能力的影響SOD：模型組低于正常組，二甲雙胍組、糖腎方組高于模型組（P＜0.05）。CAT：模型組和糖腎方組低于正常組，二甲雙胍組、糖腎方組高于模型組（P＜0.05）。VE：模型組和二甲雙胍組低于正常組，二甲雙胍組低于模型組，糖腎方組高于模型組和二甲雙胍組（P＜0.05）。NO：模型組高于正常組，二甲雙胍組、糖腎方組低于模型組，糖腎方組高于二甲雙胍組（P＜0.05）。NOS：模型組、二甲雙胍組和糖腎方組均高于正常組，二甲雙胍組、糖腎方組低于模型組，糖腎方組高于二甲雙胍組（P＜0.05），見表3。

Tab.3Comparison of oxidative stress indicators in liver tissues between four groups表3 各組大鼠肝臟氧化應激指標比較

Tab.3Comparison of oxidative stress indicators in liver tissues between four groups表3 各組大鼠肝臟氧化應激指標比較

組別正常組模型組二甲雙胍組糖腎方組F n 12 14 10 11 SOD（U/mgprot）252.12±22.20 213.49±29.09a 246.43±14.10b 241.24±17.30b 5.938＊＊CAT（U/mgprot）10.97±2.39 6.82±1.54a 9.02±2.34b 8.34±0.69ab 7.723＊＊組別正常組模型組二甲雙胍組糖腎方組F n 12 14 10 11 VE（μg/g）13.16±1.81 10.61±2.83a 8.40±0.73ab 14.13±0.68bc 8.670＊＊NO（μmol/gprot）0.13±0.04 0.27±0.15a 0.08±0.03ab 0.12±0.03bc 57.690＊＊NOS（U/mgprot）0.72±0.05 1.52±0.20a 1.08±0.13ab 1.32±0.15abc 16.629＊＊

3 討論

糖尿病會導致各種并發癥，幾乎影響身體各處器官。NAFLD是糖尿病的主要并發癥之一，長期糖尿病導致視網膜血管、腎臟、肝臟和神經系統并發癥，包括其結構和功能改變。氧化應激是糖尿病并發癥發展的影響因素，源于糖脂代謝紊亂引起的自由基生成增加和內源性抗氧化劑的減少。因此，改善糖尿病合并NAFLD需要關注抗氧化劑的治療［6-7］。

本研究采用高脂飲食喂養加小劑量STZ腹腔注射的實驗方法，建立模擬人類2型糖尿病合并NAFLD的實驗動物模型。HE染色顯示模型組大鼠肝小葉結構紊亂、肝細胞彌漫性脂肪變性，可見點狀壞死灶，炎癥細胞增多，說明肝組織損傷。血清中的ALT、AST酶活性升高也顯示肝功能受損。模型組大鼠血清中TG、CHO、LDL-C水平明顯高于正常組，說明存在嚴重的脂代謝紊亂。經糖腎方治療后，明顯降低糖尿病合并NAFLD大鼠血清中ALT、AST水平，并糾正了脂代謝紊亂。提示糖腎方對糖尿病合并NAFLD大鼠的肝臟脂質代謝異常有保護作用。

糖尿病的重要特征糖脂紊亂會損害過氧化和抗氧化之間的平衡，抑制抗氧化水平和增加自由基水平［8-9］。此外，氧化應激過程中，酶促和非酶促抗氧化系統的活性降低。SOD和CAT都是體內重要的抗氧化酶［10-11］，反映機體清除自由基和抗氧化損傷的能力。本研究中，模型組肝臟中的SOD、CAT水平下降可能源于STZ誘導的活性氧失活，糖腎方治療后通過降低氧化應激反應來提升抗氧化酶體系的活性。非酶促抗氧化系統中的VE會轉移其酚醛氫鍵到過氧化多不飽和脂肪酸的過氧化氫自由基，打破自由基鏈反應并避免細胞膜脂質過氧化。NO和NOS也是機體抗氧化能力的重要指標。NO是一種細胞信使分子，由L-精氨酸NOS催化下合成。NOS過度表達可以產生大量的NO，誘導氧化損傷，生成過氧亞硝基陰離子，抑制線粒體代謝，介導其他毒性自由基產生，促進脂質過氧化反應［12］。本實驗中糖尿病模型組大鼠肝組織的SOD、CAT和VE活性明顯降低，而NO、NOS水平顯著增加，說明機體氧化應激水平增高，導致肝損傷。

2型糖尿病合并NAFLD屬于中醫“消渴”、“脅痛”等范疇。多因先天稟賦不足，加之過食。病因不外肥甘厚味、勞逸過度等導致脾胃運化失常，肝氣失疏泄，則氣機郁滯。糖腎方由黃芪、生地、三七等中藥組成，以益氣養陰、活血化瘀為主要功效［3］。糖腎方中的有效成分黃芪多糖和大黃素可提高肝臟的抗氧化能力，降低脂質沉積；黃芪總皂苷和三七總皂苷能夠調節免疫、改善大鼠血流動力學參數；大黃素可以降低血糖、血脂、改善胰島素抵抗；生地黃梓醇能夠降血糖，保護心血管。實驗結果顯示糖腎方可不同程度地提高肝組織的SOD、CAT和VE活性，降低NO、NOS水平，表明模型大鼠抗氧化能力提高、氧化應激減輕、肝組織炎癥和病理損傷緩解。

綜上所述，筆者通過建立2型糖尿病合并NAFLD的大鼠模型，證實模型組大鼠存在明顯的氧化應激反應。糖腎方對糖尿病大鼠肝臟具有一定的保護作用，其機制可能是通過抑制體內異常的氧化應激反應和改善脂質代謝異常來發揮作用。

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（2015-02-13收稿 2015-03-15修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects of Tangshen Formula on liver oxidative stress and pathologic changes in typeⅡdiabetic rats

LI Xin1，2，GU Ligang1，ZHAO Tingting2，YANG Xin2，ZHANG Yun2，ZHANG Haojun2，YAN Meihua2，DONG Xi2，ZHAO Hailing2，WEN Yumin2，LI Ping2△
1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 China-Japan Friendship Hospital△

ObjectiveTo investigate the effects of Tangshen Formula on liver oxidative stress in diabetic rats，and their mechanisms thereof．MethodsRat model of type 2 diabetes mellitus and nonalcoholic fatty liver disease was estab?lished by intraperitoneally injecting small dose of chain urea with cephalosporins（STZ）and feeding high fat fodder．The model rats were randomly divided into control group，model group，Tangshen Formula group and metformin group．The se?rum levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），triglyceride（TG），cholesterol（CHO），low density lipoprotein-cholesterol（LDL-C），and superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），vitamin E（VE），nitric oxide（NO）and nitric oxide synthase（NOS）in liver were compared between four groups.Changes of pathological morphology were ob?served under light microscopy.ResultsThere were significantly decrease in serum levels of ALT，AST，TG，CHO，LDL-C in Tangshen Formula group and metformin group compared with those of model group.There were significantly higher levels of SOD，CAT and VE，and lower levels of NO and NOS of liver homogenate in Tangshen Formula group than those of model group.There were higher levels of SOD and CAT，and lower levels of NO and NOS in liver homogenate in metformin group than those of model group.HE staining showed that liver fatty degeneration was significantly reduced in metformin group and Tangshen Formula group compared with that of model group.ConclusionThe fatty liver in type 2 diabetic rats is signifi?cantly improved by Tangshen Formula treatment，which is probably associated with the regulation of the response level to oxi?dative stress in liver．

Tangshen Formula；diabetes mellitus，type 2；liver injury；oxidative stress

R285.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.009

國家自然科學基金資助項目（81173422）；國家國際科技合作專項課題（2011DFA31860）

1北京中醫藥大學（郵編100029）；2中日友好醫院

李忻（1980），女，助理研究員，博士在讀，主要從事中西醫結合基礎研究

△通訊作者E-mail：lp8675@163.com