硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的作用

楊紅梅

錦州市太和區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科，錦州 121001

硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞增殖與凋亡的作用

楊紅梅

錦州市太和區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科，錦州 121001

目的探討硝酸鎵對卵巢癌HO-8910細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖的影響。 方法通過對卵巢癌HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)（硝酸鎵不同濃度及時間作用），采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對凋亡細(xì)胞進(jìn)行測定；MTT技術(shù)對腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行測定。 結(jié)果 MTT及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，增殖抑制率（80μg/ml）24 h為57.1%、48 h為59.4%、72 h為68.1%；凋亡率5μg/ml為（9.92±1.04）%、10μg/ml為（28.31±1.22）%、20μg/ml為（38.59±1.21）%、40μg/ml為（45.48±1.43）%、80μg/ml為（52.25±2.18）%，硝酸鎵對HO-8910細(xì)胞作用呈劑量-時間依賴效應(yīng)。 結(jié)論硝酸鎵對卵巢癌細(xì)胞作用明顯，為腫瘤治療及制備抗腫瘤藥物提供新的途徑。

硝酸鎵；卵巢癌細(xì)胞；細(xì)胞增殖與凋亡

鎵作為金屬類藥物，在腫瘤方面卻未廣泛應(yīng)用，目前主要應(yīng)用于骨質(zhì)疏松方面［1-5］。本研究以不同濃度硝酸鎵分別體外作用卵巢癌HO-8910細(xì)胞，觀察對卵巢癌細(xì)胞的作用效果，為研發(fā)抗腫瘤藥物尋找新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌HO-8910細(xì)胞株（中科院腫瘤研究所）；硝酸鎵（Betapharma有限公司）。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞

將卵巢癌HO-8910細(xì)胞株復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。

1.3 實驗分組

分對照組、硝酸鎵組，將細(xì)胞調(diào)整密度為1×105/ml接種在培養(yǎng)板上。

1.4 細(xì)胞增殖（MTT法）

用0.25%胰酶處理對數(shù)生長期的細(xì)胞成密度為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，各孔100μl。

硝酸鎵組分別加入藥物（終濃度為5、10、20、40、80μg/ml的硝酸鎵），各孔終體積為150μl，對照組加入培養(yǎng)液（RPMI 1640），設(shè)3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h，終止培養(yǎng)前4 h再分別加入MTT（5 mg/ml）10μl，4 h后棄掉上清，加150μl二甲基亞砜液，震蕩10min，酶標(biāo)儀測值，計算細(xì)胞增殖抑制率，重復(fù)3次，取均值，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。

1.5 細(xì)胞凋亡（流式細(xì)胞儀法）

用0.25%胰酶處理對數(shù)生長期的細(xì)胞成密度為1×105/ml的單細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板上，各孔100μl。

硝酸鎵組分別加入藥物（終濃度為5、10、20、40、80μg/ml的硝酸鎵），各孔終體積為150μl，對照組加入培養(yǎng)液（RPMI 1640），設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。收集兩組細(xì)胞，速度1000 r/min，離心5 min，棄掉培養(yǎng)液，用冷PBS兩次洗滌細(xì)胞，篩網(wǎng)（400目）濾1次，濾后細(xì)胞調(diào)整濃度約為1×106/m l以1×Binding Buffer 400μl進(jìn)行懸浮，再加入Annexin V-FITC 5 ul，輕輕混勻，在低溫下，避光孵育15 min。再加PI 10μl混勻，低溫下，避光孵育5 min后，在流式細(xì)胞儀上測定，計算細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 硝酸鎵對HO-8910細(xì)胞增殖的抑制作用

以硝酸鎵終濃度5、10、20、40、80μg/ml分別作用HO-8910細(xì)胞24、48、72 h。MTT結(jié)果表明，對HO-8910細(xì)胞明顯抑制增殖。硝酸鎵高濃組在24、48、72 h的抑制率分別為57.1%、59.4%、68.1%，不同時間點、不同濃度之間抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1、圖1）。

表1 硝酸鎵對HO-8910細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

表1 硝酸鎵對HO-8910細(xì)胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

與正常對照組比較，*P＜0.01

組別（μg/ml）24 h OD 抑制率（%）48 h OD 抑制率（%）72 h OD 抑制率（%）正常對照組硝酸鎵組5 10 20 40 80 1.052±0.012-1.043±0.110-0.953±0.031-0.752±0.012*0.671±0.204*0.602±0.201*0.542±0.132*0.454±0.141*28.2 36.3 42.6 48.5 57.1 0.705±0.018*0.648±0.102*0.583±0.247*0.522±0.521*0.421±0.328*32.3 37.5 44.0 50.1 59.4 0.624±0.008*0.544±0.113*0.461±0.005*0.381±0.078*0.302±0.164*34.4 43.1 51.7 60.2 68.1

圖1 硝酸鎵組抑制率曲線

2.2 硝酸鎵誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，硝酸鎵隨著藥物濃度增加而凋亡增強（P＜0.01）（表2）。

表2 流式細(xì)胞儀檢測高濃度組作用48 h后細(xì)胞凋亡結(jié)果（±s）

表2 流式細(xì)胞儀檢測高濃度組作用48 h后細(xì)胞凋亡結(jié)果（±s）

與硝酸鎵濃度5μg/ml組比較，*P＜0.01

硝酸鎵濃度（μg/ml） 凋亡率（%）5 10 20 40 80 9.92±1.04 28.31±1.22*38.59±1.21*45.48±1.43*52.25±2.18*

3 討論

鎵作為金屬元素，早期，在對腫瘤的定位及檢測腫瘤細(xì)胞活性得到應(yīng)用。近幾年美國已作為non. Hodgkin的Ⅱ期淋巴癌治療的臨床用藥［6］。鎵用于腫瘤治療，是繼鉑之后的第二個金屬類藥物，初步實驗證明，它能通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體途徑，抑制細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)［7-8］。另外，還發(fā)現(xiàn)鎵能夠抑制核苷酸還原酶的活性［9］，進(jìn)一步地抑制細(xì)胞內(nèi)DNA的合成，通過以上機制抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而有效地控制某些癌癥［10-11］，與鉑類藥物相比，硝酸鎵的一個重要特性是沒有骨髓抑制和缺乏對其他藥物的交叉耐藥性［12-15］，這需要進(jìn)一步研究，更好地了解其分子機制，并確定其臨床療效與其他藥物的結(jié)合效應(yīng)。

本實驗結(jié)果表明，硝酸鎵能很好地抑制細(xì)胞增殖，硝酸鎵5μg/ml組抑制率隨時間遞增分別為28.2%、32.3%、34.4%；硝酸鎵作用24 h組抑制率隨藥物濃度遞增分別為28.2%、36.3%、42.6%、48.5%、57.1%，明顯呈時間-劑量依賴效應(yīng)。48 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，硝酸鎵組凋亡率隨藥物濃度遞增呈顯著性差異（P＜0.01），與Kaluderovic等［5］在腫瘤治療中，將鎵化合物與順鉑進(jìn)行比較的研究較一致，綜合硝酸鎵在HO-8910細(xì)胞增殖抑制與促進(jìn)凋亡的結(jié)果，完全可以證明硝酸鎵對卵巢癌HO-8910細(xì)胞作用效果顯著。

以上研究表明，在體外細(xì)胞層面，對于卵巢癌HO-8910細(xì)胞，硝酸鎵有顯著的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行動物模型實驗，在動物整體水平研究鎵對腫瘤細(xì)胞的作用效應(yīng)及副作用，為腫瘤藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

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Effect of gallium nitrate on Proliferation and aPoPtosis of ovarian cancer cells

YANG Hong-mei
Department of Obstetrics and Gynecology，Taihe District Hospital of Jinzhou City in Liaoning Province，Jinzhou 121001，China

Objective To study the effect of gallium nitrate on ovarian cancer cell line HO-8910，observe the effect on ovarian cancer cells HO-8910 induced apoptosis，inhibited the proliferation.Methods The human ovarian cancer cell line HO-8910 was cultured and treated with drugs （with different concentrations and time effect by gallium nitrate），apoptosis of cells was determined by flow cytometry.Proliferation of cells wasmeasured using MTT assay.Results The results of MTT and the results of flow cytometry showed that，the proliferation inhibition rate （80μg/ml）of 24 h was 57.1%，48 hwas59.4%，72 hwas68.1%；theapoptosis rateof5μg/mlwas（9.92±1.04）%，10μg/mlwas（28.31±1.22）%，20μg/ml was（38.59±1.21）%，40μg/mlwas（45.48±1.43）%，80μg/mlwas（52.25±2.18）%，gallium nitrate on the role of HO-8910 cellswere in a dose time dependent effect.Conclusion Gallium nitrate on ovarian cancer cells is significantly，provide a new way for tumor treatmentand preparation of anti-tumor drugs.

Gallium nitrate；Ovarian cancer cells；Cell proliferation and apoptosis

R737.31

A

1674-4721（2015）02（c）-0073-03

2014-11-04本文編輯：郭靜娟）

楊紅梅，女，本科，副主任醫(yī)師；研究方向：婦產(chǎn)科腫瘤學(xué)