正交設計法優化補腎通痹顆粒提取工藝

謝明艷

（衡陽市中醫醫院藥劑科，湖南 衡陽 421001）

風濕病是一種發病機制相當復雜的疾病，臨床上非常常見，且難完全治愈[1]。目前，臨床上治療該疾病的藥物主要是糖皮質激素類或甾體抗炎藥物，治療效果不好而且存在較大的不良反應[2-3]。補腎通痹顆粒是我院臨床經過多年實踐，總結歸納得到的對于治療風濕有確切療效的處方，經過制藥設備的提取和濃縮，加入輔料制成易于患者服用的顆粒劑，在本院多年的使用期間對患者疾病的治愈起到很大的作用。為了進一步保證藥物的質量和確切的治療效果，本研究通過分析處方組成，利用高相液相分析和薄層色譜法對處方主要成分進行分析，以確定最佳的提取工藝，現將具體結果報道如下。

1 處方提取

補腎通痹顆粒處方為：首烏藤60 g，雞血藤60 g，鹿銜草35 g，丹參35 g，延胡索（醋炙）35 g，桑寄生30 g，骨碎補（燙）30 g，肉蓯蓉30 g，地黃30 g，知母20 g，甘草15 g，熟地黃15 g。將處方中的各味中藥按照正交設計表中各因素中的水平進行加熱和提取，在各個提取液中加入沉淀劑至完全陳定后過濾，取濾液，使用超純水對濾器進行沖洗，將濾液和沖洗液進行合并，在真空條件下進行濃縮，至密度為1∶1。

2 材料與儀器

處方中各飲片均符合2010版《中國藥典》中的規定。將槲皮素、延胡索乙素和原兒茶醛作為對照品（中國藥品生物制品檢定所提供）；色譜儀為島津LC-20A高效液相色譜儀（LC-20A泵，Alltech3300型蒸發光散射檢測器）；其余試劑均為分析純，水是超純水。

3 方法和結果

3.1 丹參、延胡索、桑寄生提取工藝考察：使用槲皮素、原兒茶醛、延胡索乙素、丹參酮的薄層鑒別作為指標，分別使用醇提法和水提法來考察3味處方中主要成分的藥材的提取效率。

3.1.1 水提法：取35 g延胡索（醋炙）、35 g丹參和30 g桑寄生在圓底燒瓶中，加入10倍水進行加熱回流，1.5 h后進行過濾，取藥渣加入8倍水進行加熱回流，1 h后過濾，將濾液合并濃縮至50 mL備用。

3.1.2 醇提法：取35 g延胡索（醋炙）、35 g丹參和30 g桑寄生在圓底燒瓶中，加入10倍50%乙醇進行加熱回流，1.5 h后進行過濾，取藥渣加入8倍50%乙醇進行加熱回流，1 h后過濾，將濾液合并濃縮至50 mL備用。

3.1.3 鑒別：取20 mL本品，研細后加入20 mL甲醇，進行超聲處理，30 min后進行過濾，去濾液進行濃縮，濃縮至20 mL后在進行20 min超聲處理，加乙酸乙酯搖動提取（2次，30 毫升/次），將2次乙酸乙酯液合并后蒸干，取殘渣加入1 mL乙酸乙酯液作為供試品溶液。再取對照品槲皮素加入乙酸乙酯后制成0.5mg/mL溶液，作為對照品溶液。進行薄層色譜法試驗（2010版《中國藥典一部附錄VB》）：使用0.5%氫氧化鈉溶液制備硅膠G薄層板，吸取上述2種溶液各10 μL分別點在同一個薄層板上，使用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（比例為5∶4∶1）作為展開劑，進行展開、取出和晾干，再噴灑5%三氯化鋁乙醇溶液，放置在365 nm紫光燈下進行檢視。供試品色譜中在和對照品色譜相應的位置上會有相同顏色的熒光斑點顯示。

3.2 醇提工藝條件選擇：本方中延胡索乙素的含量測定方法選擇高效液相色譜法。

3.2.1 正交試驗設計：考察原料粒度大小、提取時間、溶媒量等因素對延胡索乙素、原兒茶醛提取含量以及藥物有效成分提取的影響，因此在實施正交試驗時選擇不同濃縮方式也作為一個因素[4-6]，具體見表1。

表1 正交試驗工藝因素水平

3.2.2 高效液相色譜法色譜條件：甲醇和0.1%磷酸（PH使用三乙胺調整至6.0）以60∶40比例作為流動相，使用C18柱，檢測波長為280 nm。按照延胡索乙素峰計算理論板數，不低于2000。

3.2.3 制備對照品溶液：取適量對照品延胡索乙素，加甲醇制成0.04 mg/mL溶液。

3.2.4 制備供試品溶液：取5 mL延胡索純提液，進行精密稱定后放置在離心管中，加入20 mL甲醇，進行超聲處理（2次，20分鐘/次），將濾液合并蒸干后，取殘渣加10 mL水溶解，加入5 mL濃氨水，使用乙醚進行萃取（3次，20毫升/次），取3次萃取后的乙醚液進行合并和揮干后取殘渣，加甲醇5 mL溶解后即為供試品溶液。

3.2.5 測定方法：分別取20 μL對照品和供試品溶液，注入液相色譜后進行測定，測定結果見表2。

表2 正交試驗結果

根據表2可知，最佳提取工藝為A1B2C3D1。將延胡索乙素提取效率作為指標，提取效率越高，效果也越好，可以作為工藝選擇指標[7-8]。根據試驗結果分析可知，中等粒度的延胡索乙素，50%乙醇和8倍溶劑量，并進行2次提取，在減壓高溫條件下進行濃縮的提取方案為最佳方案。按照該方案進行驗證，結果顯示延胡索乙素的提取效率較好，且進行薄層鑒別可見斑點明顯。表明該提取工藝合理可行。

4 討 論

該補腎通痹顆粒適用于腰酸軟、風濕痹痛、關節痹痛、筋骨無力等病癥的治療，處方中的首烏藤、地黃和桑寄生作為君藥，具有養血活絡、祛風濕、強筋骨和補肝腎的作用；延胡索和丹參為臣藥，作用為活血通絡；甘草則對諸藥進行調和，諸藥聯用具有祛風濕、益腎健骨、強腰膝、增強免疫和強健體質的作用[9-10]。輔助合理穩定的提取工藝可以保證藥物作用最大化地發揮。

本研究中使用延胡索乙素提取效率作為指標，提取效率越高，效果也越好。根據試驗結果分析可知，中等粒度的延胡索乙素，50%乙醇和8倍溶劑量，并進行2次提取，在減壓高溫條件下進行濃縮的提取方案為最佳方案。

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