鞣云實素對果糖溶液喂養大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影響

張建博，陳　平，謝　雨，龔建瑜，范 源

（1.云南中醫學院中藥學院，云南　昆明　650500；2.云南中醫學院基礎醫學院，云南　昆明　650500；3.云南中醫學院臨床醫學院，云南　昆明　650500）

鞣云實素對果糖溶液喂養大鼠血清中IAPP、GLP-1及INS的影響

張建博1，陳平1，謝雨2，龔建瑜1，范 源3

（1.云南中醫學院中藥學院，云南昆明650500；2.云南中醫學院基礎醫學院，云南昆明650500；3.云南中醫學院臨床醫學院，云南昆明650500）

目的果糖溶液喂養Wistar雄性大鼠，注射Wistar大鼠不同濃度的鞣云實素檢測大鼠體內胰島淀粉樣多肽（IAPP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）及胰島素（INS）濃度的變化。方法Wistar大鼠給予相同濃度果糖溶液連續灌胃3周，第4周腹腔注射不同濃度的鞣云實素溶液，隔1 d注射1次，連續注射3次，第7天取大鼠血清，利用酶標儀測定血清中胰島淀粉樣多肽、胰高血糖素樣肽-1及胰島素的濃度。結果果糖溶液喂養后胰島素分泌減少、胰島淀粉樣多肽濃度降低、胰高血糖素樣肽-1濃度升高；注射20 mg·kg-1鞣云實素溶液后胰島素分泌增多、胰島淀粉樣多肽濃度明顯降低、胰高血糖素樣肽-1濃度明顯增高；注射40 mg·kg-1鞣云實素溶液后胰島素分泌與對照組相比明顯減少、胰島淀粉樣多肽濃度明顯增高且高于對照組、胰高血糖素樣肽-1濃度明顯降低。結論低濃度鞣云實素能夠促進胰高血糖素樣肽-1生成、刺激胰島素分泌及抑制胰島淀粉樣多肽的形成，本實驗為進一步研究鞣云實素對胰島素抵抗大鼠模型的相關激素變化提供一定基礎。

鞣云實素；Wistar大鼠；果糖；胰島淀粉樣多肽；胰島素；胰高血糖素樣肽-1

近年來，隨著生活質量不斷提高，飲食結構不斷改變，果糖攝入過多的現象趨于普遍，代謝綜合征的患病率也隨之升高且趨于早齡化，已嚴重威脅人類的健康。近期研究表明，健康人群長期攝入過多果糖會產生胰島素抵抗［1］，且胰島素抵抗是代謝綜合征的主要病因之一，此外，長期攝入果糖會導致胰島β細胞凋亡率增加。Maiztegui等［2］在研究中，對成年Wistar大鼠用10％果糖溶液喂養3周，利用碘化丙啶染色法檢測細胞凋亡，攝入果糖組與正常組相比胰島β細胞凋亡率明顯增加且有顯著性差異，提示果糖可能具有誘導胰島β細胞凋亡的作用。

鞣云實素又名柯里拉京（Corilagin.Cor），屬于天然多酚類化合物，白色針形晶體粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機試劑，分子式為C27H22O18，分子量634.46，是余甘子、老鶴草、葉下珠、龍眼等藥材的有效成分。鞣云實素具有保肝［3］、抑制病毒［4］、降血壓［5］、抗炎［6］、抗腫瘤［7］、抗菌［8］、抗氧化［9］等多種生物活性。關于鞣云實素治療糖尿病的相關報道較少，

目前國內外應用果糖溶液喂養大鼠的相關文獻不多，果糖所致胰島β細胞功能障礙與胰島素（INS）、胰島淀粉樣多肽（IAPP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）之間的關系需進一步明確。本實驗觀察鞣云實素對果糖溶液喂養后大鼠血清中INS、IAPP、GLP-1濃度的影響，為研究鞣云實素對果糖溶液喂養大鼠的藥理活性提供一定實驗基礎。

1　材料與儀器

1.1實驗材料 SPF級Wistar雄性大鼠（簡陽達碩動物科技有限公司，動物合格證號：SCXKC11172013-24）；鞣云實素（南京澤朗醫藥科技有限公司）；果糖（華北制藥華源有限公司）；飼料（昆明醫科大學）；酶聯免疫分析試劑盒96T（上海紀寧實業有限公司）。

1.2儀器離心機（Hitachi CF16RXII，日本日立）；352型酶標儀（Labsystems Multiskan MS，芬蘭）；洗板機（AC8 Thermo Labsystems，芬蘭）。

2　實驗方法

2.1建立模型及分組給藥取Wistar大鼠24只隨機分成4組，即正常組、對照組、低濃度的鞣云實素組、高濃度的鞣云實素組，除正常組外其他3組均用20％濃度的果糖溶液喂養，喂養時間為3周。根據低濃度組大鼠腹腔注射20 mg·kg-1，高濃度組40 mg·kg-1，分別配制低濃度的鞣云實素溶液與高濃度的鞣云實素溶液：4 mg·mL-1與8 mg·mL-1，腹腔注射鞣云實素溶液5 mL·kg-1，注射間隔為1 d，第7天目內眥取血2 mL于離心管中，10 000 rpm離心10 min，取上清液作為測定硫氧還蛋白結合蛋白（TXNIP）、IAPP、INS指標的待測物。

2.2酶聯免疫分析測定INS、IAPP及GLP-1試劑盒嚴格按照說明書所指示在小試管中進行稀釋。分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30 min。將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用，小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。再次培育，再次洗滌，每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15 min以內進行。

2.3數據處理所有數據用SPSS 18.0統計軟件進行分析，且用表示，組間比較采用ANOVA檢驗，P ＜0.05判定為差異具有統計學意義。

3　結果

喂果糖組（對照組）與正常組相比，INS呈下降趨勢，注射20 mg·kg-1鞣云實素后與對照組相比，INS有一定的升高，當注射40 mg·kg-1鞣云實素后INS明顯下降且比對照組INS濃度低，高濃度組與對照組相比具有差異性，對照組與正常組相比具有顯著性差異（見圖1）；與正常組相比喂果糖后IAPP有降低的趨勢，注射20 mg·kg-1鞣云實素后與對照組相比IAPP濃度有明顯的下降，當注射40 mg·kg-1鞣云實素時IAPP濃度有明顯的增高，且比對照組濃度高，對照組與正常組相比具有差異性，與低濃度組及高濃度組相比具有顯著性差異（見圖2）；喂果糖組與正常組相比GLP-1濃度升高，注射20 mg·kg-1鞣云實素后與對照組相比GLP-1濃度明顯升高，當注射40 mg·kg-1鞣云實素時GLP-1濃度急劇下降，且比對照組的濃度低，對照組與正常組相比具有差異性，對照組與低濃度組相比具有顯著性差異（見圖3）。表1為胰島素抵抗指數，其中正常組與對照組相比、對照組與低濃度組及高濃度組相比，胰島素抵抗指數沒有統計學差異，表明沒有產生胰島素抵抗。

4　討論

果糖在體內會代謝成游離脂肪酸和甘油三酯，長期高濃度游離脂肪酸可抑制胰島素合成與分泌，加速胰島β細胞凋亡。果糖通過抑制糖異生作用以及糖原分解作用可導致胰島素抵抗以及代謝綜合征的產生，影響胰島β細胞功能。高果糖喂養大鼠誘導胰島β細胞功能紊亂已被廣泛地應用于建立胰島素抵抗模型在糖尿病及其并發癥的相關研究中。此外，果糖可誘導氧化應激對線粒體功能也有一定影響。Jaiswal等［10］在實驗中發現，在大鼠L6骨骼肌細胞系中加入果糖會產生氧化應激，可導致骨骼肌線粒體功能障礙，產生胰島素抵抗作用。

圖1　酶聯免疫分析INS的數據

表1　胰島素抵抗指數

圖2　酶聯免疫分析IAPP的數據

圖3　酶聯免疫分析GLP-1的數據

IAPP主要存在于胰島β細胞中，與胰島素共同由胰島β細胞合成與分泌，IAPP協同胰島素可以精準的調節人體血糖。近期研究表明，IAPP具有一定的抑制胰島素分泌的作用，Zhu等［11］在實驗中，對Wistar大鼠胰腺中胰島β細胞分離并培養，加入16.7mmol葡萄糖處理1 h后加入0.5、1.0、5.0、10.0 μmol的IAPP預處理30 min后對INS進行檢測發現，IAPP的增多會減少胰島素的分泌，且在5 μmol及10 μmol時有明顯的差異性。GLP-1是一種主要由腸道L細胞分泌的激素，其具有刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素的分泌、減少肝糖元輸出、抑制食欲及攝食、減緩胃排空、改善外周組織對胰島素的敏感性。近期研究發現，在健康人體內口服果糖后GLP-1濃度有明顯的增高趨勢［12］。此外，GLP-1類似物能夠抑制IAPP前體的形成，從而減少IAPP的產生及積聚沉積［13］。

本實驗結果提示，果糖喂養后可導致胰島β細胞凋亡率有所增加，致使胰島素分泌減少，此時大鼠血清中GLP-1的濃度略有升高，其可增加胰島素敏感性、抑制IAPP的產生。腹腔注射20 mg·kg-1鞣云實素后與對照組相比，胰島素分泌增加、GLP-1濃度明顯增高、IAPP濃度明顯降低，提示低濃度的鞣云實素可促進GLP-1生成的作用，刺激胰島素的分泌，抑制IAPP的形成。當注射40 mg·kg-1鞣云實素后GLP-1的濃度明顯降低且低于對照組，IAPP濃度有明顯的增高且高于對照組的濃度，提示鞣云實素在高濃度時可能對胰島β細胞產生毒性導致其凋亡，致使GLP-1濃度降低，促進IAPP形成，減少胰島素的濃度。

本實驗利用酶標免疫分析法測定果糖喂養大鼠腹腔注射鞣云實素對IAPP、GLP-1及INS的影響，發現低濃度的鞣云實素具有增加GLP-1的生成，促進胰島素分泌，抑制IAPP的形成的作用；而高濃度的鞣云實素會增加IAPP的形成，減少GLP-1濃度且抑制胰島素的分泌，提示：鞣云實素在低濃度（20 mg·kg-1）鞣云實素時可具有保護胰島β細胞的作用，高濃度（40 mg·kg-1）可能對胰島β細胞產生毒性，需進一步實驗探究。本實驗為探索鞣云實素對果糖溶液喂養大鼠的藥理活性實驗提供一定研究基礎，為發現新的可治療糖尿病的天然活性產物提供一定參考。

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The effect of corilagin for IAPP，GLP-1 and INS of rats which fed by fructose

ZHANG Jian-bo1，CHEN Ping1，XIE Yu2，GONG Jian-yu1，FAN Yuan3
（1.College of TCM，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；2.College of Basic Medicine，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China；3.College of Clinical Medicine，Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China）

Objective To feed male Wistar rats with fructose solution，and inject different concentration of corilagin solution to Wistar rats，determine the changes of the concentration of IAPP，GLP-1）and INS in rats serum.Methods To give same concentration of fructose solution to Wistar rats three weeks by intragastric administration.In the fourth week，different concentration of corilagin solution was admined by intraperitoneal injection，once every two days and three times.In the seventh day，blood serum of rats was collected and the concentrations of IAPP，GLP-1 and INS were determined by ELISA.Results After fed fructose solution，the rats secreted insulin was decreased，the concentration of IAPP was reduced and the concentration of GLP-1 was increased；After injected the concentration of 20 mg·kg-1corilagin，the insulin secretion was increased，the concentration of IAPP was decreased significantly，the concentration of GLP-1 was increased significantly；When injected the concentration of 40 mg·kg-1corilagin，the insulin secretion was decreased significantly to compared with control group，the concentration of IAPP was increased significantly and higher than control group，the concentration of GLP-1 was reduced significantly and lower than control group.Conclusion Corilagin at low concentration can promote the generation of GLP-1，stimulate insulin secretion and inhibit the formation of IAPP.The experiment provided some basis on the further research of corilagin for the hormonal changes related to insulin resistance in rats model.

Corilagin；Wistar rat；Fructose；IAPP；INS；GLP-1

R965

A

2095-5375（2015）12-0699-004

張建博，男，研究方向：中藥質量標準與控制，E-mail：284529046@qq.com

范源，男，博士研究生，副教授，碩士生導師，研究方向：天然產物活性及糖尿病研究，Tel：13708874680，E-mail：1647909799@qq.com