MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義

張倩，袁碧波△，王彥，許毅

MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義

張倩1，袁碧波1△，王彥1，許毅2

目的探討MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義。方法（1）以紡錘絲毒性藥物Nocodazole處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞，顯微鏡下觀察細胞形態學變化，并于0、6、12、24、48及72 h收獲細胞，流式細胞術檢測細胞周期和染色體倍體變化，Western blot檢測細胞中FBW7和MCL-1蛋白的表達。（2）用多激酶抑制劑索拉非尼（Sorafenib）分別與Nocodazole、紫杉醇（Taxol）聯合或單獨處理細胞，Western blot檢測處理48 h后各組細胞中MCL-1蛋白的表達，流式細胞術檢測處理48 h細胞周期和染色體倍體變化，MTT法檢測處理48、72 h細胞增殖情況。結果（1）Nocodazole處理后，細胞出現體積增大、核大的多倍體形態學改變，0、6、12、24、48及72 h八倍體細胞所占百分比分別為（0.8±0.2）%、（8.5±2.3）%、（7.8±2.0）%、（9.9±0.9）%、（28.2± 0.8）%及（35.1±4.9）%，逐漸增加（P＜0.001），48 h后多倍體（四倍體和八倍體）細胞數高達（97.6±0.7）%；隨時間延長，FBW7蛋白表達量減少，MCL-1蛋白表達量增加。（2）處理細胞48 h后，Nocodazole+Sorafenib組較Nocodazole組、Taxol+Sorafenib組較Taxol組MCL-1蛋白表達量均明顯減少，多倍體細胞均減少，細胞生長增殖率下降（P＜0.05）。結論FBW7蛋白低表達，MCL-1蛋白高表達與乳腺癌多倍體細胞的形成密切相關；Sorafenib抑制MCL-1蛋白表達，可能減少多倍體腫瘤形成。

乳腺腫瘤；多倍性；體外研究；MCL-1；FBW7；紡錘絲毒性藥物；Nocodazole；索拉非尼

惡性腫瘤易產生耐藥和復發，紫杉醇、長春新堿等紡錘絲毒性藥物是腫瘤化療的一線藥物［1］。這類藥物可誘導某些腫瘤細胞發生凋亡，而對另一些卻誘導其產生多倍體，使腫瘤細胞對常用化療藥物更加耐藥而致治療失敗［2］。有研究認為多倍體腫瘤形成的分子機制復雜，卵巢癌、非小細胞肺癌中F-box and WD repeat domain-containing 7（FBW7）缺乏，myeloid cell leukemia-1（MCL-1）高表達可促進有絲分裂滑動、核內復制，可能是導致多倍體腫瘤形成和對化療藥耐藥的重要原因［3］。FBW7缺失，MCL-1過表達的情況下，急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）對索拉非尼（Sorafenib）藥物非常敏感，Sorafenib可通過抑制MCL-1表達發揮抗癌作用［4］。本研究旨在探討MCL-1和FBW7蛋白在紡錘絲毒性藥物誘導的乳腺癌多倍體中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料人乳腺癌MDA-MB-231細胞由北京大學醫學部腫瘤研究中心柯楊教授惠贈，常規傳代培養。Sorafenib購自Cayman公司，紫杉醇（Taxol）購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，Nocodazole購自Sigma公司，FBW7鼠抗人單克隆抗體和MCL-1兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司，噻唑蘭（MTT）、Western及RIPA細胞裂解液購自碧云天生物技術研究所，碘化丙啶（PI）和核糖核酸酶（RNase）購自Solar?bio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的形態學變化人乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養基中，37℃、5%CO2常規培養，選取對數生長期細胞，用紡錘絲毒性藥物100 μg/L Nocodazole處理，于顯微鏡下觀察Nocodazole處理前后細胞的形態學變化。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞周期和染色體倍體變化用100 μg/L Nocodazole分別處理對數生長期細胞0、6、12、24、48及72 h，消化、收集細胞，70%冷乙醇固定，4℃過夜后1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS洗滌，加入100 ng/L RNase 37℃孵育30 min，加入500μL PI染色液室溫避光孵育30 min，計數1×106個/mL細胞，流式細胞儀檢測細胞周期（G0/S、G2/M），并測定二倍體、四倍體和八倍體細胞分別占細胞總數的百分比。

1.2.3 Western blot檢測FBW7和MCL-1蛋白表達水平用100 μg/L Nocodazole分別處理對數生長期細胞0、6、12、24、48及72 h，收集細胞，用細胞裂解液RIPA裂解提取蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓冰浴電轉至PVDF膜上，膜封閉液封閉1 h，然后一抗孵育（FBW7 1∶1 000，MCL-1 1∶1 000）4℃過夜，相應的二抗孵育1 h（1∶5 000，1∶4 000），熒光發光成像分析儀檢測蛋白質印跡，β-actin作為內參。

1.2.4 各組MCL-1蛋白表達量和細胞周期檢測使用多激酶抑制劑2μmol/L Sorafenib與100 μg/L Nocodazole、100 nmol/L Taxol聯合或單獨處理細胞48 h。實驗分組：No?codazole+Sorafenib組、Taxol+Sorafenib組、Nocodazole組、Taxol組、Sorafenib組和只加RPMI 1640培養液的空白對照（control）組。Western blot檢測聯合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物間MCL-1蛋白表達水平。流式細胞術檢測聯合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物間細胞周期和染色體倍體變化。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖取對數生長期細胞，以5×103個/孔接種于96孔板，使用2、4μmol/L Sorafenib分別與100 μg/ L Nocodazole、100 nmol/LTaxol聯合或單獨處理細胞48和72 h后終止培養，每個分組5個復孔，終止培養前4 h加入5 g/L MTT溶液20μL，繼續培養4 h，除去每孔中培養基，加入二甲基亞砜200μL/孔，振蕩至結晶溶解。酶標儀檢測各孔波長490 nm處的吸光度（A）值，計算細胞生長增殖率=A藥物組/A對照組× 100%。比較聯合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物間細胞增殖的差異。

1.3 統計學方法采用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDA-MB-231細胞形態學變化Nocodazole處理前MDA-MB-231細胞呈梭形貼壁生長，No?codazole處理后細胞出現體積增大，細胞核大等典型的多倍體細胞形態學改變，見圖1。

Fig.1 Morphological changes of MDA-MB-231cells before and after Nocodazole treatment（×100）圖1 顯微鏡下Nocodazole處理前后MDA-MB-231細胞形態學變化（×100）

2.2 細胞周期和染色體倍體變化Nocodazole處理細胞6 h開始出現G2/M期停滯，24 h完全停滯在G2/M期，24 h后多倍體（四倍體和八倍體）細胞形成顯著增多，見圖2a。0、6、12、24、48及72 h八倍體細胞所占百分比分別為（0.8±0.2）%、（8.5±2.3）%、（7.8± 2.0）%、（9.9±0.9）%、（28.2±0.8）%及（35.1±4.9）%，12 h后呈增加趨勢（F=91.417，P＜0.001），48～72 h多倍體細胞數所占比例達到高峰（97.6±0.7）%，見圖2b。

Fig.2 DNA content and percentages of diploid，tetraploid and octaploid of MDA-MB-231 cells at different time points after treatment by Nocodazole圖2 Nocodazole處理不同時間后MDA-MB-231細胞DNA含量（a）和各倍體細胞所占百分比（b）

2.3 細胞中FBW7、MCL-1蛋白表達水平隨No?codazole處理時間的延長，細胞中FBW7蛋白表達量減少，MCL-1蛋白表達量增加，且48 h后差異顯著，見圖3。

Fig.3 The expressions of FBW7 and MCL-1 in MDA-MB-231cells at different time points after treatment by Nocodazole圖3 Nocodazole處理不同時間后MDA-MB-231細胞中FBW7和MCL-1蛋白表達

2.4 聯合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物對MCL-1蛋白表達量、細胞周期的影響Nocodazole+ Sorafenib組較Nocodazole組、Taxol+Sorafenib組較Taxol組MCL-1蛋白表達量均明顯減少，二倍體細胞均增多，多倍體細胞均減少（P＜0.05），見圖4、5，表1。

Fig.4 The expressions of MCL-1 in MDA-MB-231 cells after 48 h treatment by different drugs圖4 不同藥物處理48 h后MDA-MB-231細胞中MCL-1蛋白表達

Fig.5 DNA content of MDA-MB-231 cells after 48 h treatment by different drugs圖5 不同藥物處理48 h后的MDA-MB-231細胞DNA含量

2.5 聯合使用Sorafenib與單用紡錘絲毒性藥物對細胞增殖的影響藥物處理48、72 h時，100 μg/LNocodazole+2μmol/L Sorafenib組較100 μg/L No?codazole組，100 nmol/L Taxol+2μmol/L Sorafenib組較100 nmol/L Taxol組，100 μg/L Nocodazole+4μmol/L Sorafenib組較100 μg/L Nocodazole+2μmol/L Sorafenib組，100 nmol/L Taxol+4μmol/L Sorafenib組較100 nmol/L Taxol+2μmol/L Sorafenib組細胞生長增殖率均明顯降低（P＜0.01），見表2。

Tab.1 Percentages of diploid，tetraploid and octaploid after 48 h treatment by different drugs表1 不同藥物處理MDA-MB-231細胞48 h后各倍體細胞所占百分比（n=3，%）

Tab.1 Percentages of diploid，tetraploid and octaploid after 48 h treatment by different drugs表1 不同藥物處理MDA-MB-231細胞48 h后各倍體細胞所占百分比（n=3，%）

＊＊P＜0.01

組別Nocodazole+Sorafenib組Nocodazole組t Taxol+Sorafenib組Taxol組t 2 n 15.3±1.1 3.7±1.2 12.115＊＊47.7±1.1 21.4±1.4 25.353＊＊4 n 65.0±0.1 68.0±1.6 3.346＊49.4±0.8 67.1±1.1 23.065＊＊8 n 8.6±0.1 28.2±0.8 12.557＊＊0.8±0.7 10.5±1.3 10.920＊＊

Tab.2 The relative cell proliferation rates of MDA-MB-231 cells after different time treatment by different drugs表2 MDA-MB-231細胞經不同藥物培養不同時間后的相對增殖率（n=5，%）

Tab.2 The relative cell proliferation rates of MDA-MB-231 cells after different time treatment by different drugs表2 MDA-MB-231細胞經不同藥物培養不同時間后的相對增殖率（n=5，%）

＊＊P＜0.01；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（4）比較，d與（5）比較，均P＜0.01

72 h 80.1±3.1 56.4±3.5a36.9±3.0ab210.381＊＊82.1±2.9 65.9±1.8c44.3±2.0cd395.234＊＊組別100 μg/L Nocodazole組（1）100 μg/L Nocodazole+2μmol/L Sorafenib組（2）100 μg/L Nocodazole+4μmol/L Sorafenib組（3）F 100 nmol/L Taxol組（4）100 nmol/L Taxol+2μmol/L Sorafenib組（5）100 nmol/L Taxol+4μmol/L Sorafenib組（6）F 48 h 82.3±2.0 61.2±3.5a45.1±3.0ab137.857＊＊83.3±3.6 72.4±1.8c61.0±1.2cd74.798＊＊

3 討論

多倍體腫瘤的形成途徑包括核內復制、有絲分裂滑動、細胞分裂失敗和細胞融合［5］。但與紫杉醇等化療藥誘導多倍體腫瘤形成有關的途徑是有絲分裂滑動［6］，其在腫瘤細胞有絲分裂過程中影響紡錘絲的結構和功能，激活紡錘絲控制點，誘導細胞凋亡［7］；然而有些細胞無視紡錘絲結構和功能的破壞，細胞核不分裂，但仍能進入下一個細胞周期，形成四倍體、八倍體，稱為有絲分裂滑動，形成多倍體腫瘤，增強了其對化療藥物的耐藥性［7］。本研究結果顯示，紡錘絲毒性藥物可誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞多倍體化，出現細胞體積增大、核大等典型的多倍體形態學改變，且藥物處理48 h后多倍體細胞數高達97.6%。因此，治療多倍體腫瘤可能是治療腫瘤耐藥的新突破口。

本研究結果同時顯示，紡錘絲毒性藥物處理細胞48 h后，FBW7蛋白表達降低，MCL-1蛋白表達顯著升高，提示MDA-MB-231細胞多倍體的形成可能與FBW7低表達，MCL-1高表達有關。有研究報道，MCL-1作為BCL-2家族中重要的抗凋亡蛋白，是紡錘絲毒性藥物誘導細胞凋亡的關鍵調節因子［4］。FBW7/Cdc4（SKP1-cullin-1-F-box complex，SCFFBW7）通過識別磷酸化基團，泛素化降解下游致癌蛋白MCL-1，促進細胞凋亡，發揮抗癌作用［3-4，8］。因此，筆者推測FBW7低表達及缺乏可能致使MCL-1的泛素化降解減弱，從而導致細胞中MCL-1高表達，這一機制可能在多倍體腫瘤的形成中起著關鍵的作用。Wang等［9］研究認為，T-ALL、結腸癌細胞、乳腺癌細胞等多種癌細胞中FBW7表達缺失、MCL-1過表達與腫瘤耐藥密切相關。Akhoondi等［10］研究發現，在人類各種原發腫瘤中含有平均大約6%的FBW7失活突變率，FBW7在膽管細胞癌、T-ALL、子宮內膜癌、結腸癌和胃癌中的突變率分別為35%、31%、9%、9%和6%。

為進一步證實MCL-1高表達與多倍體腫瘤形成有關，本研究應用多激酶抑制劑Sorafenib與紡錘絲毒性藥物聯合處理細胞。研究認為，Sorafenib通過抑制Raf激酶使MAPK信號通路失活，從而降低MCL-1的表達水平［11-13］。本研究結果顯示，聯合應用Sorafenib較單用紡錘絲毒性藥物MCL-1蛋白表達量明顯減少，多倍體細胞也明顯減少，細胞生長增殖率降低，表明其藥物敏感性增加；同時隨Sorafenib藥物濃度增加，作用時間延長，細胞生長增殖率依次降低。

綜上所述，FBW7蛋白低表達，MCL-1蛋白高表達與乳腺癌多倍體細胞的形成密切相關，通過Sorafenib抑制MCL-1的表達，可能降低多倍體的形成，增加藥物敏感性，有望成為攻克腫瘤耐藥的新方案。

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（2015-03-10收稿2015-05-08修回）

（本文編輯陸榮展）

Expression and clinical significance of MCL-1 and FBW7 proteins in breast cancer polyploid induced by spindle poisons

ZHANG Qian1，YUAN Bibo1△，WANG Yan1，XU Yi2
1 Department of Gynecology and Obstetrics，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Hebei Tsinghua Development Research Institute△

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of myeloid cell leukemia-1（MCL-1）and F-box and WD repeat domain-containing 7（FBW7）in breast cancer polyploid induced by spindle poisons.Methods（1）Nocodazole spindle poison was used to treat breast cancer cell MDA-MB-231.The morphological changes of cells were ob?served under microscope，and cells were harvested in 0，6，12，24，48 and 72 h.The cell cycle and DNA-ploidy changes were examined by flow cytometry.The expressions of FBW7 and MCL-1 proteins were detected by Western blot assay.（2）A multikinase inhibitor（Sorafenib）with Nocodazole or Taxol was used to treat MDA-MB-231 cells.MCL-1 protein expression was detected by Western blot assay after 48 h treatment.The cell cycle and DNA-ploidy changes were examined by flow cy?tometry after 48 h treatment.MTT method was used to observe cell proliferation after 48 and 72 h treatment.Results（1）Af?ter treatment by Nocodazole，polyploid characteristics of large cell size and nucleus were appeared.The percentages of octa?ploid were（0.8±0.2）%，（8.5±2.3）%，（7.8±2.0）%，（9.9±0.9）%，（28.2±0.8）%and（35.1±4.9）%after 0，6，12，24，48 and 72 h treatment，showing the increasing trend in turn（P＜0.001）.The number of polyploidy（tetraploid and octaploid）cells was as high as（97.6±0.7）%after 48 h treatment.The expression level of FBW7 protein was decreased significantly but the expres?sion of MCL-1 protein was increased significantly after 48 h treatment.（2）After 48 h treatment，the expression level of MCL-1 protein，polyploidy percentage and cell proliferation decreased significantly in Nocodazole+Sorafenib group and Taxol+Sorafenib group compared with those of Nocodazole group and Taxol group（P＜0.05）.ConclusionThe lower expression of FBW7 protein and over-expression of MCL-1 protein are correlated with the formation of breast cancer polyploidy. Sorafenib can reduce polyploid tumor cells by inhibiting MCL-1 protein expression.

breast neoplasms；polyploidy；in vitro；myeloid cell leukemia-1；F-box and WD repeat domain-containing 7；spindle poison；Nocodazole；sorafenil

R737.9；R349.12

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.003

國家自然科學基金資助項目（30872969）

1天津醫科大學總醫院婦產科（郵編300052）；2河北省清華發展研究院

張倩（1988），女，碩士在讀，主要從事婦科腫瘤耐藥機制的研究

△通訊作者E-mail：yuanbibo@hotmail.com