香煙提取物對氣道平滑肌細胞增殖作用的研究

管頻，于化鵬，吳智勇，李偉，吳潔

香煙提取物對氣道平滑肌細胞增殖作用的研究

管頻1，2，于化鵬1△，吳智勇2，李偉2，吳潔3

目的探討香煙提取物（CSE）對人氣道平滑肌細胞（ASMCs）增殖以及鈣網織蛋白（CRT）、CCAAT增強子結合蛋白α（CEBPα）表達的影響及機制。方法（1）通過收集經不同濃度CSE處理24 h的ASMCs，分為對照組、2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組。以MTT法分析各組細胞增殖情況，采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測各組細胞CEBPα的mRNA水平；免疫印跡法檢測4組細胞CRT、CEBPα的蛋白水平。（2）在10%CSE組，分別在ASMCs中轉染陰性對照siRNA、CRT的siRNA，比較2組ASMCs的CEBPα、CRT表達及細胞增殖情況。結果（1）對照組、2.5%CSE組、5%CSE組、10%CSE組ASMCs的CEBPα蛋白表達依次遞減，CRT和細胞增殖程度呈依次增高（P＜0.05）；而CEBPα mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）。（2）在10%CSE作用下，CRTsiRNA組中ASMCs的CEBPα表達較陰性對照siRNA組增強（P＜0.05），而CRT和細胞增殖程度均較相應陰性對照siRNA組減弱（P＜0.05）。結論CSE可使ASMCs中CRT的表達增強，從而抑制CEBPα mRNA的翻譯，使CEBPα的表達減少，最終促進ASMCs的增殖。

肌細胞，平滑肌；細胞增殖；肺疾病，慢性阻塞性；體外研究；香煙提取物；鈣網織蛋白；CCAAT增強子結合蛋白

CCAAT增強子結合蛋白α（CEBPα）廣泛表達于肺、肝臟及骨髓干細胞等，可抑制細胞增殖的活性［1］。Borger等［2］研究顯示，在哮喘患者氣道平滑肌細胞（ASMCs）中CEBPα的表達明顯下調。Miglino等［3］研究顯示，在體外以室內塵螨作用于哮喘患者的ASMCs后，CEBPα的表達受抑制，從而使AMSCs的增殖明顯增加。進一步研究認為，人AMSCs中CEBPα的表達受抑制與鈣網織蛋白（CRT）密切相關［4］。慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者ASMCs的顯著增生是COPD氣道重塑的基礎之一［5］。體外研究顯示，在香煙提取物（CSE）作用下AMSCs的增殖加速［6］，但具體機制尚未明確。本研究旨在探討CSE促進ASMCs增殖的可能機制，為研究COPD患者的氣道重塑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料原代ASMCs購自美國ScienceCell公司，于37℃、5%CO2孵箱中培養，取第4～6代細胞用于后續實驗；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；羊抗人CEBPα、CRT及內參蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自上海吉泰生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗羊單克隆抗體、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒、Radio-Immunoprecipitation Assay（RIPA）裂解液、Trizol及DMEM胎牛血清購自武漢博士德生物技術有限公司。CRT?siRNA、陰性對照siRNA轉染試劑盒及CEBPα的引物購自上海生工生物有限公司。

1.2 CSE的制備及分組按文獻［7］的方法，將1支3R4F參考香煙（海南醫學院熱帶檢驗學院實驗室贈予）點燃，其過濾嘴端接一根橡皮管，橡皮管的另一端接注射器。收集煙霧注入含25 mL 10%胎牛血清DMEM的玻璃瓶中，搖晃玻璃瓶使煙霧溶入10%胎牛血清DMEM中，即為100%的CSE原液，以0.22 μm微孔濾膜過濾。CSE原液采用10%胎牛血清DMEM稀釋，按照稀釋濃度=CSE原液體積/總體積×100%計算。分別將含2.5%、5%、10%CSE的10%胎牛血清DMEM加入到細胞培養瓶中，即為2.5%CSE組、5%CSE組、10% CSE組，以不加入CSE者設為對照組。每組設6個復孔，培養24 h。

1.3 方法

1.3.1 MTT比色法檢測人ASMCs的增殖程度各組每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑鹽（MTT）20 μL，孵育4 h，1 500 r/min離心10 min，棄上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，搖勻，用免疫酶標儀（490 nm處）測定各孔培養液光密度（OD490）值。

1.3.2 RT-PCR法測定各組ASMCs中CEBPα mRNA表達各組分別以Trizol抽提細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明進行反轉錄生成cDNA。由CEBPα引物（擴增片段210 bp）：上游5′-GGCGGCGACTTTGACTACC-3′；下游5′-CTGCTTGGCTTATCCTCCTC-3′。擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個循環，72℃再延伸6 min。β-actin引物（擴增片段620 bp）：上游5′-ACACTGTGCCCATCTACGACG-3′；下游5′-AGGGGCCG?GACTCCTCATACT-3′。擴增條件：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環，72℃再延伸6 min。所有擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用MUVB220凝膠成像分析系統對擴增產物測定CEBPα基因及內參β-actin的灰度值，取CEBPα與β-actin比值為CEBPα mRNA的相對含量。

1.3.3 免疫印跡法（Western blot）測定各組ASMCs中CEBPα、CRT的蛋白表達提取各組細胞總蛋白，以SDSPAGE進行電泳，轉膜，以5%牛血清白蛋白封閉，分別加入羊抗人CRT（44 ku）、CEBPα（42 ku）和GAPDH（36 ku）抗體，再予辣根過氧化物酶標記相對應的兔抗羊IgG單克隆抗體進行孵育，以DAB進行酶底物顯色反應。濾膜照片通過凝膠成像系統定量掃描灰度值，分別以CEBPα/GAPDH、CRT/ GAPDH來表示CEBPα、CRT的蛋白表達水平。

1.3.4 采用siRNA技術干預后CEBPα、CRT及細胞增殖程度變化在10%CSE濃度條件下，通過分別對人ASMCs轉染陰性對照siRNA、CRT siRNA相應分為陰性對照siRNA組、CRT siRNA組。檢測2組人ASMCs中CRT、CEBPα的表達及增殖程度并進行比較。CRT siRNA組及陰性對照siRNA組的轉染分別按照相應試劑盒說明書進行，待ASMCs細胞融合至80%左右置于6孔板中，分別以50 nmol/L的相應siRNA轉染7 h，然后均加入新鮮的DMEM培養24 h，再予10%CSE作用24 h后收集細胞，檢測2組CEBPα、CRT及細胞增殖程度表達。

1.4 統計學方法采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。2組計量資料的比較采用獨立樣本資料t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度CSE下ASMCs的CEBPα、CRT表達及ASMCs增殖程度不同CSE濃度組間人ASMCs的CEBPα mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05），細胞增殖程度（OD490）依次增高，見圖1、表1。隨著CSE濃度增加，CEBPα蛋白表達依次降低，CRT表達依次增加，見圖2。

2.2 CRTsiRNA組和陰性對照siRNA組中ASMCs的CRT、CEBPα的表達及細胞增殖程度比較CRT siRNA組CEBPα高于陰性對照siRNA組，CRT和細胞增殖程度低于陰性對照siRNA組（P＜0.05），見表2。

3 討論

CEBPα是重要的具有抑制細胞增殖活性的轉錄因子［8］。CEBPα有42 ku和30 ku 2種異構體，分別稱為P42CEBPα和P30CEBPα，它們是由同一個mRNA通過“核糖體跳躍機制”翻譯得到的產物，P42CEBPα在N端比P30CEBPα長出12 ku的區域內含有轉錄激活功能較強的AD區及抑制有絲分裂的功能域，因此P30CEBPα轉錄激活功能較弱，且沒有抗有絲分裂的作用，因而不能抑制細胞的增殖［1］，僅P42CEBPα有相應生物學活性［9］。本研究結果顯示，在CSE的作用下，隨著其濃度的增高，ASMCs的增殖程度逐漸增加，而具有抗細胞增殖活性CEBPα的蛋白表達逐漸下降，表明CSE促進ASMCs增殖的機制可能與抑制CEBPα的表達有關。

Fig.1 The expression levels of CEBPα mRNA under different concentrations of CSE in four groups圖1 各組不同濃度CSE下CEBPα mRNA表達

Tab.1 The expression levels and proliferation of CEBPα and CRT in four groups表1 各組ASMCs中CEBPα mRNA、CEBPα、CRT的表達及細胞增殖程度（n=6，）

Tab.1 The expression levels and proliferation of CEBPα and CRT in four groups表1 各組ASMCs中CEBPα mRNA、CEBPα、CRT的表達及細胞增殖程度（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與（1），b與（2），c與（3）比較，P＜0.05

組別對照組（1）2.5%CSE組（2）5%CSE組（3）10%CSE組（4）F CEBPα mRNA 0.661±0.133 0.696±0.126 0.713±0.125 0.677±0.142 0.174 CEBPα 0.733±0.101 0.622±0.084a0.497±0.098ab0.368±0.077abc18.238＊＊組別對照組（1）2.5%CSE組（2）5%CSE組（3）10%CSE組（4）F CRT 0.293±0.092 0.489±0.088a0.620±0.103ab0.770±0.087abc28.628＊＊ASMCs增殖（OD490nm）0.187±0.024 0.270±0.033a0.321±0.041ab0.368±0.043abc28.063＊＊

Fig.2 The expression levels of CEBPα protein and CRT under different concentrations of CSE in four groups圖2 各組不同濃度CSE下CEBPα蛋白和CRT水平的表達

Tab.2 The expression levels and proliferation of CRTand CEBPα in CRT-siRNA group and control group表2 CRTsiRNA組、陰性對照siRNA組中CRT、CEBPα的表達及細胞增殖程度（n=6）

Tab.2 The expression levels and proliferation of CRTand CEBPα in CRT-siRNA group and control group表2 CRTsiRNA組、陰性對照siRNA組中CRT、CEBPα的表達及細胞增殖程度（n=6）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別陰性對照siRNA組CRT siRNA組t OD4900.390±0.079 0.265±0.060 3.101＊＊CEBPα 0.247±0.063 0.380±0.180 2.616＊CRT 0.754±0.126 0.544±0.132 2.826＊

CRT是參與CEBPα mRNA翻譯的重要調控因子之一。以往研究發現，在脂肪形成的過程中，CEBPα與CRT的表達呈負相關，CRT通過抑制CEBPα和PPARα的表達而促進脂肪的合成［10］。近期在ASMCs中的研究也發現CEBPα的表達受CRT負調節［4］。可能機制為CRT與CEBPαmRNA莖環結合形成GC富集模體，這種復合物抑制了CEBPα mRNA翻譯為全長42 ku的CEBPα，從而抑制了其生物學活性［11］。本研究結果顯示，不同CSE濃度作用下CEBPα mRNA表達無差異，但CEBPα蛋白的表達隨濃度增加呈依次降低，表明CSE對于ASMCs的作用主要是調控CEBPα的轉錄后水平，從而影響其蛋白表達；CRT的表達隨著CSE濃度增高逐漸增強，提示香煙煙霧可能作用于ASMCs后使CRT表達上調，通過抑制CEBPα mRNA的翻譯，從而使全長CEBPα（P42）的蛋白水平下降，進而促進ASMCs細胞增殖。另外，本研究采用siRNA技術抑制CRT的表達后，相應的CEBPα（P42）蛋白表達增加，從而使ASMCs的增殖相應減弱，進一步證實了CRT、CEBPα之間的關系，提示抑制CRT的表達可減輕氣道平滑肌的增殖，從而改善氣道重塑、減輕氣道炎癥，此可能為探索COPD發病機制和治療方法提供一個新的切入點。

［1］Miglino N，Roth M，Tamm M，et al.Asthma and COPD-The C/EBP Connection［J］.Open Respir Med J，2012，6（1）：1-13.doi：10.2174/ 1874306401206010001.

［2］Borger P，Matsumoto H，Boustany S，et al.Disease-specific expres?sion and regulation of CCAAT/enhancer-binding proteins in asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.J Allergy Clin Immu?nol，2007，119（1）：98-105.doi：10.1016/j.jaci.2006.07.056.

［3］Miglino N，Roth M，Tamm M，et al.House dust mite extract downregulates C/EBPes C/EBPP/EBPP C/EBPP C/Esmoothmuscle cells［J］.Eur Respir J，2011，38（1）：50-58.doi：10.1183/09031936.000 68010.

［4］Miglino N，Roth M，Lardinois D，et al.Calreticulin is a negative reg?ulator of bronchial smoothmuscle cell proliferation［J］.J Allergy（Cai?ro），2012（2012）：783290.doi：10.1155/2012/783290.

［5］Pini L，Pinelli V，Modina D，et al.Central airways remodeling in COPD patients［J］.Int J Chron Obstruct Pulmon Dis，2014，9（1）：927-933.doi：10.2147/COPD.S52478.

［6］Xu GN，Yang K，Xu ZP，et al.Protective effects of anisodamine on cigarette smoke extract-induced airway smooth muscle cell prolifer?ation and tracheal contractility［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，262（1）：70-79.doi：10.1016/j.taap.2012.04.020.

［7］Pera T，Atmaj C，van der Vegt M，et al.Role for TAK1in cigarette smoke-induced proinflammatory signaling and IL-8 release by human airway smooth muscle cells［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2012，303（3）：L272-L278.doi：10.1152/ajplung.00291.2011.

［8］Roos AB，Nord M.The emerging role of C/EBPs in glucocorticoid signaling：lessons fromthe lung［J］.J Endocrinol，2012，212（3）：291-305.doi：10.1530/JOE-11-0369.

［9］Tsukada J，Yoshida Y，Kominato Y，et al.The CCAAT/enhancer（C/ EBP）family of basic-leucine zipper（bZIP）transcription factors is a multifaceted highly-regulated system for gene regulation［J］.Cyto?kine，2011，54（1）：6-19.doi：10.1016/j.cyto.2010.12.019.

［10］Helbling D，Mueller BU，Timchenko NA，et al.CBFB-SMMHC is correlated with increased calreticulin expression and suppresses the granulocytic differentiation factor CEBPA in AML with inv［J］. Blood，2005，106（4）：1369-1375.

［11］Timchenko LT，Iakova P，Welm AL，et al.Calreticulin interacts with C/EBPalpha and C/EBPbeta mRNAs and represses translation of C/EBP proteins［J］.Mol Cell Biol，2002，22（20）：7242-7257.

（2014-11-26收稿2015-01-05修回）

（本文編輯陸榮展）

Effects of tobacco extract on proliferation of human airway smooth muscle cells

GUAN Pin1，2，YU Huapeng1△，WU Zhiyong2，LI Wei2，WU Jie3
1 Southern Medical University，Guangzhou 510000，China；2 Department of Medical Health Center，Hainan Provincial People Hospital；3 Hainan Medical University，Haikou△

ObjectiveTo explore the effects and mechanism of cigarette smoke extract（CSE）on the proliferation of air?way smooth muscle cells（ASMCs）and the expression of CCAAT/enhancer-binding protein（CEBPα）and calreticulin.Methods（1）The ASMCs were stimulated with different concentrations of CSE for twenty-four hours.According to the concentra?tions of CSE，the cells were divided into control group，2.5%CSE group，5%CSE group and 10%CSE group.The prolifera?tion of ASMCs was measured by MTT colrimetric method.The CEBPαmRNA was analyzed by RT-PCR.Western bloting as?say was performed to detect the levels of CRT and CEBPα protein.（2）In 10%CSE group，transfection of the siRNA respec?tively for negative control or calreticulin was performed in accordance with instructions.The cell proliferation and the expres?sion of calreticulin and CEBPα were compared in negative control siRNA group and calreticulin siRNA group.Results（1）With the increasing of the concentrations of CSE，the protein expression of CEBPα decreased gradually（P＜0.05），while the proliferation of ASMCs and the protein expression of calreticulin increased（P＜0.05），but the expression of CEBPα mRNA in ASMCs showed no significant difference in groups with different concentrations of CSE（P＞0.05）.（2）Under the 10%CSE，the expression of CEBPα was significantly higher in CRT siRNA group than that in negative control group（P＜0.05），but the cell proliferation and CRT were significantly lower in the calreticulin siRNA group than those in negative control siRNA group（P＜0.05）.ConclusionThe CSE exposure contributes to the expression of calreticulin protein，and then inhibits the translation of CEBPα mRNA，thus promotes the proliferation of ASMCs.

myocytes，smooth muscle；cell proliferation；pulmonary disease，chronic obstructive；in vitro；cigarette smoke extract；calreticulin；CCAAT enhancer-binding protein

R655.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.005

海南省自然科學基金資助課題（807081）

1廣東廣州南方醫科大學（郵編510000）；2海口，海南省人民醫院醫療保健四區；3海口，海南醫學院

管頻（1980），女，醫學博士，主治醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病氣道重塑及氣道炎癥研究

△通訊作者E-mail：gp0318@126.com