β-catenin下調對乳腺癌MDA-MB-231細胞上皮間質轉化及侵襲遷移能力的影響

許光偉，曹旭晨

β-catenin下調對乳腺癌MDA-MB-231細胞上皮間質轉化及侵襲遷移能力的影響

許光偉，曹旭晨△

目的探討β-連環蛋白（β-catenin）對乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞上皮間質表型和侵襲遷移能力的影響。方法用β-catenin siRNA質粒轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞（對照組），免疫熒光染色觀察β-catenin的表達情況。Western blot檢測上皮標記蛋白E-cadherin、間質標記蛋白vimentin及上皮間質轉化相關調控因子Twist1和Snail的表達。Transwell侵襲實驗和傷口愈合實驗比較對照組、空質粒組和β-catenin下調組細胞體外侵襲遷移能力。結果免疫熒光染色顯示對照組和空質粒組細胞可見β-catenin在胞膜、胞漿和胞核表達，β-catenin下調組細胞胞膜β-catenin呈低表達，且未見胞漿、胞核表達。下調β-catenin的細胞E-cadherin表達增高，而vimentin、Twist1和Snail表達減少。侵襲遷移實驗證明，下調組細胞穿膜細胞數和遷移距離顯著少于MDA-MB-231和對照組（P＜0.05）。結論下調β-catenin阻礙Wnt/β-catenin通路的激活，降低乳腺癌MDA-MB-231細胞間質表型的表達而促進其上皮表型的表達，從而降低了細胞的體外侵襲、遷移能力。

乳腺腫瘤；鈣黏著糖蛋白類；腫瘤侵潤；細胞運動；β-catenin；上皮間質轉化；MDA-MB-231

β-連環蛋白（β-catenin）不僅是細胞間重要的黏附分子，參與細胞間的黏附、生長、分化、凋亡等過程，而且作為Wnt經典信號通路中的關鍵分子，其異常激活與多種腫瘤的發生密切相關［1］。文獻報道在上皮細胞來源的惡性腫瘤中，細胞可通過激活βcatenin介導的Wnt通路發生上皮間充質轉化（epi?thelial-mesenchymal transition，EMT），使細胞具有間質細胞表型而促進腫瘤的侵襲轉移［2］。有研究表明，β-catenin在乳腺癌組織中也存在異常激活［3-4］。本研究通過在乳腺癌細胞系中下調β-catenin明確其對乳腺癌細胞上皮間質表型的影響及侵襲、遷移能力的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系與培養乳腺癌細胞系MDA-MB-231購自中國醫學科學院基礎醫學研究中心。細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中（加入青霉素、鏈霉素各100 U/mL），置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2 細胞轉染取對數生長期MDA-MB-231細胞接種于6孔板培養24 h后，采用轉染試劑LipofectamineTM2000，向MDA-MB-231細胞轉染β-catenin siRNA質粒及空質粒，轉染后，將細胞分成3組：MDA-MB-231組（對照組）、空質粒組和β-catenin下調組（MDA-MB-231轉染β-catenin siRNA）。

1.3 免疫熒光96孔板內放置蓋玻片，將各組細胞消化成單細胞懸液接種于96孔板內，24 h后取出細胞爬片，甲醇固定10 min，0.1%TritonX-100作用30 min，PBS沖洗5 min×3次，BSA封閉30 min，滴加兔抗人一抗β-catenin（1∶200，ab32572，abcam）37℃溫箱孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次，滴加FITC標記的二抗，常溫避光反應30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAPI染核5 min，滴加抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.4 Western blot細胞接種于6 cm皿中，長至90%匯合時每孔加入200 μL trizol裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠轉膜至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入一抗βcatenin（1∶500，ab32572，rabbit，abcam），上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin，1∶500，sc-7870，Santa Cruz），vimentin（1∶500，sc-5566，Santa Cruz），Twis（t1∶500，sc-15393，Santa Cruz）和Snail（1∶500，sc-28199，Santa Cruz），在37℃箱孵育2 h；TBST漂洗10 min×3次；加山羊抗兔二抗（1∶2 000），37℃作用2 h；TBST漂洗10 min×3次；暗室避光X線片曝光，進行顯影、定影、拍照。

1.5 細胞侵襲實驗將包被有Matrigel的Transwell小室置于24孔培養板孔中，在每一Transwell小室的下室加條件培養液500 μL，上室分別接種200 μL含1×104個細胞的細胞懸液。常規培養48 h后，取出Transwell小室，拭去其濾膜上表面的未穿膜細胞，將黏著于Matrigel膜下層的細胞用結晶紫染色后高倍鏡下選5個視野進行計數。

1.6 細胞傷口愈合實驗將對照組、空質粒組和β-catenin下調組細胞分別接種于24孔板中（每孔5×105個細胞），待細胞生長至單層完全融合時，吸去培養液，用PBS洗2次，以100 μL微量移液槍頭在單層細胞上呈一字形劃痕，制造細胞創傷模型。每組平行3個樣本，鏡下記錄劃痕區相對距離，PBS沖洗2～3次后繼續培養。于48 h后在顯微鏡下監測創傷愈合程度，并于100倍視野下拍照。

1.7 統計學方法采用SPSS 17.0軟件做統計分析，以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞系經下調后的表達免疫熒光結果顯示對照組和空質粒組細胞β-catenin在胞膜、胞漿和胞核呈較強表達，而β-catenin下調組的MDA-MB-231細胞β-catenin表達明顯減少，而且未見胞漿及胞核表達，見圖1。

2.2 下調β-catenin對MDA-MB-231細胞上皮間質相關蛋白表達水平的影響與空質粒組和對照組相比，β-catenin下調組細胞的β-catenin表達顯著較少；上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達明顯增強，間充質細胞標志物vimentin明顯下調；調控EMT的關鍵轉錄因子Twist1和Snail表達均明顯減少，見圖2。

Fig.2 The protein expression levels of β-catenin，E-cadherin，vimentin，Twist1 and Snail圖2 各組細胞β-catenin、E-cadherin、vimentin、Twist1和Snail的蛋白表達水平

2.3 侵襲實驗結果空質粒組、對照組和β-catenin下調組細胞穿過小室底膜的細胞數分別為41.30± 5.16，38.80±6.53和15.60±3.21，差異有統計學意義（F=37.797，P＜0.01）。β-catenin下調組細胞的穿膜數顯著少于對照組和空質粒組（P＜0.01）。空質粒組與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

2.4 下調β-catenin對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響48 h后，β-catenin下調組、空質粒組和對照組遷移的距離分別為（31.23±4.24）、（50.34± 9.25）和（48.00±10.71）μm，差異有統計學意義（F= 7.463，P＜0.01）。β-catenin下調組細胞遷移的距離小于對照組和空質粒組（P＜0.01）。空質粒組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

β-catenin是細胞內的一種多功能蛋白，參與細胞間黏附的調節，是Wnt通路中關鍵調控蛋白，其在細胞內的濃度和狀態對該通路有決定性的影響［5］。正常成熟的組織細胞中，胞漿內β-catenin大部分與細胞膜上的E-cadherin結合起細胞間黏附作用。胞漿內游離β-catenin濃度維持在較低水平，不能進入胞核調控下游基因表達［6］。在腫瘤發生發展過程中，Wnt配體與細胞膜表面的Frizzled/LRP受體結合引起下游分子Dsh磷酸化，使β-catenin APC/Ax?in/GSK-3β組成的復合物分離，使其在細胞內積聚并隨后進入細胞核與TCF/LEF結合而激活下游靶基因cyclinD1、APC等的轉錄，參與調控細胞增殖、調亡、運動、分化［7］。本實驗中，我們應用免疫熒光染色觀察到MDA-MB-231細胞β-catenin于細胞膜胞漿和胞核內均可見β-catenin較強的陽性著色，說明乳腺癌細胞中存在Wnt/β-catenin通路的激活。經siRNA干擾后β-catenin表達明顯減少，并且胞漿和胞核內未見著色，提示β-catenin下游通路可能無法正常啟動，從而引起下游基因的變化，進而對腫瘤細胞的生物學特性產生影響。

EMT指上皮細胞經過細胞骨架重塑，在形態學上發生向間充質細胞轉變的過程。無論在生理或病理情況下，Wnt/β-catenin信號通路都是參與調控EMT的重要信號通路之一。誘導EMT的信號和信號通路通常具有幾個共同終點，包括E-cadherin等關鍵基因表達的變化和細胞骨架、黏附結構的變化。E-cadherin作為一種鈣依賴型跨膜糖蛋白，能夠與β-catenin等形成復合物，發揮細胞連接參與維持上皮細胞極性和完整性的作用。當Wnt/βcatenin通路激活時，β-catenin向細胞核內聚集引起E-cadherin失去cadherin-catenin錨定連接而破壞了E-cadherin/β-catenin復合體的穩定性，E-cad?herin失去黏附功能，導致細胞分散，移動力增加，獲得侵襲性間質表型［8］。本實驗中筆者選擇了惡性程度高、分化低的乳腺癌細胞系MDA-MB-231，結果顯示，乳腺癌細胞系MDA-MB-231中β-catenin呈高表達，且E-cadherin低表達而vimentin高表達，證實乳腺癌細胞MDA-MB-231具有一定的間質表型。有文獻報道Wnt/β-catenin信號通路的活化可以引起一些EMT轉錄因子如Snail和Twist的表達上調［9-10］，上皮型鈣黏蛋白基因的抑制主要由鋅指轉錄因子Snai1介導，該轉錄因子能夠被大多數引發上皮間充質轉化的信號通路激活［11］。本研究結果中，下調β-catenin的細胞Snail減少，相應的受Snail調控的E-cadherin表達升高。此外，同為調控EMT的關鍵因子Twist1也有一定程度降低。以上結果說明β-catenin的下調影響了乳腺癌細胞MDAMB-231中EMT相關轉錄因子的表達，提示下調βcatenin對具有間質性表型的細胞發生EMT的逆轉。研究表明，在肺癌、肝癌、黑色素瘤等多種上皮來源的腫瘤中都存在EMT轉變，并且這種轉變與腫瘤的侵襲遷移能力密切相關［12-13］。本研究結果顯示，下調β-catenin的MDA-MB-231細胞與對照組MDA-MB-231相比侵襲能力明顯降低，結合βcatenin對腫瘤細胞發生EMT的促進作用，筆者認為下調β-catenin可能是通過調控細胞上皮表型的表達從而降低了腫瘤細胞的侵襲能力。

腫瘤的侵襲遷移能力與患者預后及腫瘤復發等密切相關，其相關機制的研究有益于提供新的腫瘤治療思路。本研究通過實驗證明下調β-catenin能促使具有間質細胞表型的乳腺癌細胞發生上皮表型的表達升高，并降低其侵襲遷移力，提示其在乳腺癌中可能作為新的治療靶點，以降低或阻斷腫瘤的侵襲轉移。β-catenin作為轉錄因子居于Wnt信號通路級聯反應的中心環節，對其上游信號轉導通路以及下游轉錄調控的直接靶點仍需更深入的研究，從而進一步明確腫瘤發生發展的機制。

（圖1、3見插頁）

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（2014-12-10收稿2015-04-17修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of down-regulated β-catenin on epithelial mesenchymal transition，invasion and migration ability of breast cancer cell line MDA-MB-231

XU Guangwei，CAO Xuchen△
Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center for Cancer，
Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy，Tianjin Medical University，Ministry of Education，Tianjin 300060，China△

ObjectiveTo investigate the effect of β-catenin on epithelial mesenchymal phenotype and invasion migra?tion ability of breast cancer cell line MDA-MB-231.MethodsSmall interfering RNA（siRNA）targeting β-catenin plas?mid was transfected into MDA-MB-231 cell line.Immunofluorescence staining was used to observe the expression of β-catenin.The expressions of epithelial cell marker E-cadherin and mesenchymal marker vimentin，epithelial mesenchymal transition correlation factor Twist1 and Snail were detected by Western blot assay.Invasion and migration ability was com?pared by transwell invasion and wound healing assay between control group，the MDA-MB-231 group and β-catenin downregulated group.ResultsImmunofluorescence staining showed that β-catenin was expressed in cell membrane，cytoplasm or nucleus in MDA-MB-231 group and control group.There was a decreased expression in β-catenin down-regulated group，and no expression in cytoplasm or nucleus.The expression of E-cadherin was increased，while vimentin，Twist1 and Snail expression decreased in β-catenin down-regulated cells.Transwell invasion and wound healing assay results proved that transmembrane cell number and migration distance were significantly lower in β-catenin down-regulated group than those of MDA-MB-231 group and control group（P＜0.05）.ConclusionThe down-regulation of β-catenin inhibits Wnt/ β-catenin activation that decreases the mesenchymal phenotype but increases epithelial phenotype of breast cancer cells MDA-MB-231，and which reduces the cell invasion and migration ability in vitro.

breast neoplasms；cadherins；neoplasm invasiveness；cell movement；β-catenin；epithelial mesenchymal transition；MDA-MB-231

R737.9

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.006

天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室（郵編300060）

許光偉（1988），女，碩士研究生，主要從事腫瘤學乳腺癌方面研究

△通訊作者E-mail：cxc@medmail.com.cn