不同原料厭氧發酵及其微生物種群的研究

李海紅，巴琦玥，閆志英，劉曉風（.西安工程大學環境科學系，陜西 西安 70048；.中國科學院環境與應用微生物重點實驗室，四川 成都 6004）

不同原料厭氧發酵及其微生物種群的研究

李海紅1，巴琦玥1，閆志英2*，劉曉風2（1.西安工程大學環境科學系，陜西 西安 710048；2.中國科學院環境與應用微生物重點實驗室，四川 成都 610041）

使用PCR-DGGE技術，對以雞糞、豬糞、牛糞、秸稈為發酵原料的發酵體系的微生物群落多樣性進行了研究.在發酵不同時間取樣，進行了日產甲烷量、日產甲烷濃度的變化分析和DGGE分析.結果表明，日產甲烷量整體趨勢為豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞，日平均產甲烷量分別為2.67、2.24、0.99、0.49L；豬糞、雞糞、秸稈的日產甲烷濃度在整個發酵周期大多可維持在50%以上，牛糞的日產甲烷濃度大部分時間低于30%；細菌的優勢菌群有擬桿菌屬（Bacteroidetes）、密螺旋體屬（Treponema）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）等，新增優勢菌群有梭菌屬（Clostridium）、脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）；古菌的優勢菌群有甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），新增優勢菌群有斯氏甲烷球菌屬（Methanosphaera stadtmanae）.

雞糞；豬糞；牛糞；秸稈；厭氧發酵；PCR-DGGE；菌群多樣性

禽畜糞便和農作物秸稈是我國主要的兩大類生物質資源，2009年中國畜禽養殖業糞便排放總量為32.64億t鮮重，其資源沼氣潛力約1200億m3［1］.厭氧發酵產沼氣技術實現了畜禽廢棄物生物質的能源轉化，厭氧發酵的過程由多種微生物協同作用完成，主要分為產乙酸菌（細菌）和產甲烷菌（古菌）兩大微生物群落，以共營養形式相互聯系［2］.傳統微生物學分析方法因其局限性很難對環境中的微生物進行深入研究［3］，隨著分子生物學的迅速發展，基于16S rDNA基因的分子生物學方法被廣泛運用于復雜微生物種群的研究中［4-6］，國內學者也運用這些技術對魚腸道和厭氧顆粒污泥微生物種群、塔式蚯蚓生態濾池微生物群落結構進行了研究，并取得了一定的成果［7-9］.本研究采用5L厭氧發酵裝置，分別以雞糞、豬糞、牛糞、水稻秸稈為發酵原料進行連續式厭氧發酵，利用PCR-DGGE（聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳）技術研究發酵過程中古菌和細菌種群結構的差異，并對DGGE圖譜中的優勢條帶切膠回收進行測序，結合反應器的工藝條件對結果進行分析和討論，以期為不同原料產沼氣以及提高產氣效率提供分子生物依據.

1 材料與方法

1.1 材料

水稻秸稈取自成都郊區某農村，用粉碎機粉碎后待用.新鮮的雞糞、豬糞、牛糞分別取自成都雙流某養雞場、養豬場及奶牛場，剔除雜物后置于4℃冰柜待用.接種物為本實驗室中溫厭氧發酵富集馴化的發酵液.發酵原料基本性質見表1.

表1 原料和接種物的特性Table 1 Characteristics of materials and inoculum

1.2 實驗設計

表2 連續厭氧消化實驗設計（g）Table 2 Experimental design of anaerobic digestion（g）

設置4組連續厭氧消化實驗，發酵原料分別為雞糞、豬糞、秸稈、牛糞，在35℃條件下運行，反應器為有機玻璃制成，有效容積5L.發酵體系的TS（總固體）濃度始終為6%，水力停留時間為30d，每天的進料量見表2.

每天在相同時刻進行進出料并測定產甲烷量以及產甲烷濃度，進料前后分別攪拌20min，在發酵的第3、9、21、27d分別取樣于-20℃冰箱保存，實驗結束后對所取樣品集中處理進行DGGE分析.

1.3 分析方法

總固體（TS）、揮發性固體（VS）含量采用常規方法測定［10］，C質量分數、N質量分數、碳氮比用碳氮分析儀測定，產氣量用氣袋法收集后用北京合百意燃氣計量表測量，氣體成分用安捷倫7890A 氣相色譜測定.

1.4 基因組總DNA的提取

DNA的提取采用自己改進后的手提研磨法［11］.

1.5 PCR擴增

擴增對象為16S rDNA的V3可變區對于細菌，引物為518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和341F（5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3'）；對于古菌，引物為518R（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）和109F（5'-ACGGCTCAGTAACACGT-3'）；為提高DGGE分辨效率，在518R的5'端加GC夾（-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGGG-）［12-14］.

PCR反應體系:天根Mastermix 12.5μL，引物各1μL，模板1μL，補加無菌ddH2O至25μL，PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

細菌PCR反應條件:94℃預變性4min，然后94℃變性45s，55℃退火40s，72℃延伸45s，最后72℃保溫7min，30個循環.

古菌PCR反應條件:94℃預變性4min，然后94℃變性1min，56℃退火37s，72℃延伸1min，最后72℃保溫10min，35個循環.

1.6 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

在INGENY phorU- 2Dcode Universal Mutation system 上進行DGGE分析，聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，細菌和古菌的變性劑濃度范圍分別是45%～60%和35%～50%，在1×TAE緩沖液中，以200V電壓，60℃預電泳10min，然后以90V電壓，60℃恒溫電泳12h.電泳結束后，進行硝酸銀染色［15］并拍照.用Quantity One 軟件對DGGE圖譜進行分析.

1.7 DGGE條帶回收及序列分析

選擇DGGE圖譜中條帶清晰的優勢帶，切膠并溶于30μL滅菌ddH2O中，4℃過夜，然后取1μL做模板進行PCR反應，引物不帶GC“夾子”外，反應條件同上.產物直接送上海生物工程測序，登陸NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），將測序結果與數據庫中的已知序列進行比對分析.

2 結果與分析

2.1 日產甲烷量

甲烷的產氣量是厭氧消化過程中一個重要參數，能直觀反映厭氧消化系統的產氣性能.是判斷厭氧消化過程好壞的重要依據.圖1為不同發酵原料的日產甲烷量.

圖1 多種原料日產甲烷量Fig.1 Daily methane production of different materials

從圖1可以看出，日產甲烷量整體趨勢呈現出豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞.豬糞的平均日產甲烷量為2.67L，發酵的前10d日產甲烷量不穩定，產氣量先呈下降趨勢然后穩步回升，后20d的日產甲烷量比較穩定，產氣最高峰出現在第23d，為3.57L；雞糞的平均日產甲烷量為2.24L，前24d的日產甲烷量整體呈現出穩步上升的趨勢，然后小幅回落，產氣最高峰出現在第24d，為3.1L；秸稈的平均日產甲烷量為0.99L，前11d產氣量穩定，然后產氣量穩步回升，從第17d開始產氣量繼續保持平穩狀態，產氣最高峰出現在第28d，為1.8L；牛糞的平均日產甲烷量為0.49L，發酵的前9d產氣量一直呈現下降趨勢，之后產氣量穩定沒有出現明顯波動，產氣最高峰出現在第1d，為1.54L.秸稈的纖維素、木質素含量高，降解緩慢，大分子的水解作用是整個過程的限速步驟，因此發酵啟動期較長［16］.牛糞的日產甲烷量一直處于較低的水平，可能與奶牛飼養過程中口服抗生素抑制了牛糞的微生物活性有關.

2.2 日產甲烷濃度

根據產氣中甲烷的百分含量可判斷厭氧發酵中占優勢的是酸化反應還是甲烷化反應，當甲烷含量等于或者高于50%時，甲烷化反應占優勢［17］.圖2為不同發酵原料的日產甲烷濃度.

圖2 不同原料日產甲烷濃度Fig.2 Daily methane concentration of different materials

從圖2可以看出，日產甲烷濃度整體趨勢呈現出豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞.豬糞和雞糞的日產甲烷濃度在整個發酵周期沒有發生大的波動，基本都維持在50%以上；秸稈的日產甲烷濃度波動較大，前9d呈現下降趨勢，緊接著穩步回升后再次出現回落，從第20d開始濃度基本維持在47%左右；牛糞的日產甲烷濃度前9d波動不大，基本維持在53%左右，之后一直呈下降趨勢，從第16d開始濃度波動不大，基本維持在27%左右.牛糞的日產甲烷濃度大部分時間低于30%，且產甲烷量也不高，說明整個發酵體系有酸化現象.總體來說，各發酵原料的產甲烷濃度變化與產甲烷量的變化趨勢基本保持一致.

2.3 樣品細菌的DGGE分析

2.3.1 細菌16S rDNA片段V3區PCR擴增以不同發酵原料中提取的DNA為模板擴增出細菌16S rDNA V3區片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標產物大小約180bp，與預計大小一致，條帶清晰明亮，滿足后續實驗要求.

2.3.2 不同發酵原料細菌DGGE圖譜及特征條帶序列分析 不同發酵原料細菌16S rDNA V3區PCR產物的DGGE電泳指紋圖譜見圖3.圖3中條帶的位置和數量反映了樣品中菌群的多樣性，條帶的亮度反映了該條帶所代表菌群的豐度［18-19］，條帶數目及強度與微生物的種類及相對含量成正比［20］.從圖3可以看出，在發酵初期，條帶數目和位置變化不大，表明各發酵體系微生物群落結構可能比較穩定.從第15d開始，雞糞、秸稈、牛糞發酵體系的條帶數目明顯增多，在不同的位置出現了新增條帶，而之前的一些優勢條帶的顏色深度有所變淺，條帶a、b、e、g、h、i均為新出現的新增條帶，表明以上3個發酵體系在這一時期微生物群落結構發生了改變.第21、27d各原料發酵體系的條帶位置及數目相對穩定沒有發生大的變化，表明原先的微生物群落經過一定時間的調節和演替形成了一個新的比較穩定的微生物群落.豬糞發酵體系的條帶及數目在整個發酵過程中始終沒有發生大的改變，這可能與采用豬糞接種物有關，由于發酵原料相同，因此對原先的微生物群落沖擊不大，這也解釋了為什么豬糞發酵體系產甲烷量及產甲烷濃度可以始終保持穩定.從第9d起，秸稈的條帶改變最大，有很多新增條帶出現，原先的優勢條帶的顏色也有所變淺，與此同時，秸稈發酵體系的產甲烷量以及產甲烷濃度開始回增直至達到一個穩定的狀態.牛糞的條帶數目、顏色深度和其他發酵體系相比都比較少、比較淺，表明它的微生物相對含量以及群落生物多樣性比較低，這也解釋了為什么牛糞發酵體系的產甲烷量及產甲烷濃度始終保持低水平.

圖3 不同發酵原料細菌PCR-DGGE指紋圖譜Fig.3 16S rDNA PCR-DGGE gene patterns of bacterial about different materials

圖4 不同發酵原料細菌聚類分析Fig.4 Cluster analysis of bacterial about different materials

通過UPGMA聚類算法對細菌DGGE圖譜進行分析，生成系統進化樹，由圖4可以看出，屬于雞糞原料的5個樣品被聚類到一支，其細菌群落結構的相似程度在71%以上，結構變化相對不明顯；豬糞在發酵各階段相似性基本在80%以上，群落結構差異不明顯；秸稈15#樣品獨分一支，與其它發酵原料的相似程度僅有50%，而且在不同的發酵時期被聚到不同的分支，說明秸稈發酵系統群落結構不斷變化；牛糞17#樣品與該原料其它發酵時期相似性較低，之后的相似性均在85%以上，說明群落結構在發酵中期發生過一次波動，調整后趨于穩定.

從圖3中選取11個條帶進行切膠克隆送至上海生物工程測序，所測序列提交GenBank數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），并將測序結果通過BLAST程序在GenBank數據庫（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中查找比對，測序結果見表3.在所有11個條帶中，除了條帶b、e、i外，其余條帶與對比序列的相似度在99%以上，大多數為不可培養的細菌，包括梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroidetes）、密螺旋體屬（Treponema）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）、厚壁菌門（Firmicutes）等，其余部分屬于脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）.Islam等［21］在相關研究中指出，梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroidetes）在厭氧發酵產氫中發揮了重要作用.Ducey等［22］用新一代DNA測序法測定豬場廢水厭氧消化池微生物群落多樣性，其中脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）與測得的部分菌群有極高的相似性. Zhang等［23］在秸稈沼氣發酵反應器中微生物群落特征研究中表明厚壁菌門（Firmicutes）變形菌門（Proteobacteria）與擬桿菌門（Bacteroidetes）為優勢種群. Acetivibrio sp.多分離于垃圾污泥和豬糞中，成對或鏈排列，連體運動，中溫生長，最適生長溫度是35℃，化能有機營養，發酵碳水化合物產生乙酸，其他可能的產物有乙醇、CO2和H2，但不產生丙酸和乳酸.解纖維醋弧菌（Acetivibrio cellulolyticus）對于發酵液中的不良環境有較好的耐受和調節能力，對揮發酸的生成起著重要作用［24］. 厚壁菌門（Firmicutes），該門細菌已在厭氧消化污泥廢水處理反應器、玉米秸稈厭氧反應器、餐廚垃圾厭氧反應器中、糞便等環境中被大量發現過，主要進行纖維素降解有機物水解長鏈脂肪酸降解，生成小分子物質［23］，厚壁菌門（Firmicutes）中的Clostridium jejujuense分離自土壤，主要生長在中溫厭氧環境中，最適生長溫度為30℃， pH值為7.0，可以利用纖維素阿拉伯糖乳糖木糖葡萄糖等最終生成丙酸醋酸甲酸和氫［25］.擬桿菌門（Bacteroidetes）主要分離自海底腸道厭氧反應器等厭氧環境，有降解大分子碳水化合物產酸的功能.

表3 DGGE條帶克隆測序結果Table 3 Sequence of cloned DGGE bands

2.3.3 不同發酵原料細菌群落多樣性分析 Shannon-Wiener指數（H）反映了細菌菌群多樣性的高低，不同發酵原料細菌菌群的多樣性指數見圖5.從圖5中可知，雞糞的多樣性指數介于3.59～3.73，豬糞的多樣性指數介于3.5～3.8，秸稈的多樣性指數介于3.4～3.63，牛糞的多樣性指數介于3.45～3.56，雞糞的細菌多樣性指數整體最高，牛糞的細菌多樣性指數整體最低.除了豬糞，其它發酵原料的多樣性指數在發酵初期均呈現下降趨勢，由于接種物和發酵原料的群落結構有差異，當二者作用在一起時，各自原有的穩定的群落結構被擾亂，不適應新環境的微生物被淘汰，微生物群落結構發生變化；發酵中期多樣性指數緩慢增加，可能內部微生物種群已經完成更替，一個相對穩定的新種群建立；在發酵后期，多樣性指數再次出現下降趨勢，這可能是由于采用的是連續進料發酵方法，有機物積累量增大，超過了微生物的代謝能力，氨氮等其它有毒物質也隨之積累，部分微生物菌群不易生長，從而導致群落多樣性指數下降.

圖5 不同發酵原料細菌菌群多樣性分析Fig.5 Diversity index of bacterial about different materials

2.4 樣品古菌的DGGE分析

2.4.1 古菌16S rDNA片段V3區PCR擴增 以不同發酵原料中提取的DNA為模板擴增出古菌16S rDNA V3區片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標產物大小約400bp，與預計大小一致，條帶清晰明亮，滿足后續實驗要求.

2.4.2 不同發酵原料古菌DGGE圖譜及特征條帶序列分析分析 不同發酵原料古菌16S rDNA V3區PCR產物的DGGE電泳指紋圖譜見圖6.從圖6上可以看出，從發酵中期開始，各發酵系統的條帶數目及位置都發生了很大的變化，之前部分優勢條帶顏色變淡或消失，均出現了許多新增條帶.其中，雞糞的條帶數目及位置變化最大，出現了很多的新增條帶，表明這些新增微生物菌群可能是從雞糞中帶入的，之后建立起一個新的穩定的微生物群落系統，由于微生物多樣性增加，因此雞糞發酵體系的產甲烷量呈現穩步上升趨勢的原因.豬糞發酵體系條帶數目及位置變化不大，始終保持一個穩定的狀態，這可能與采用豬糞接種物有關，由于發酵原料相同，因此對原先的微生物群落沖擊不大，從而豬糞發酵體系產甲烷量及產甲烷濃度可以始終保持穩定.牛糞發酵體系的條帶及數目和發酵初期相比減少很多，而牛糞的產甲烷量及產甲烷濃度一直處于下降趨勢，表明發酵體系原有的微生物系統平衡遭到嚴重破壞，始終沒能建立起一個新的穩定的微生物群落.

圖6 不同發酵原料古菌PCR-DGGE 指紋圖譜Fig.6 16S rDNA PCR-DGGE gene patterns of archaea about different materials

通過UPGMA聚類算法對古菌DGGE圖譜進行分析，生成系統進化樹，由圖7可以看出，雞糞發酵中期和發酵前期、后期的相似性僅有63%、66%，在發酵的整個周期相似性差異比較明顯；豬糞古菌群落結構相似度較高，群落結構變化不明顯；秸稈11#樣品獨分一支，與其它發酵原料的相似程度僅有60%，而且在不同的發酵時期被聚到不同的分支，說明秸稈發酵系統群落結構不斷變化；牛糞發酵各階段的相似性不高，大多被聚在不同的分支，說明群落結構在不斷變化并進行調整.

從圖6中選取5個條帶進行切膠克隆送至上海生工測序，所測序列提交GenBank數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），并將測序結果通過BLAST程序在GenBank數據庫（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast）中查找比對，測序結果見表4.在所有6個條帶中，除了條帶a外，其余條帶與對比序列的相似度在98%以上.包括不可培養古菌甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），其余部分屬于兔甲烷球菌屬（Methanosphaeracuniculi）、斯氏甲烷球菌屬（Methanosphaera stadtmanae）.產甲烷菌群是整個沼氣發酵的重中之重，嚴格專性厭氧，甲烷球菌屬于食氫產甲烷菌，甲烷八疊球菌和斯氏甲烷球菌屬于食乙酸產甲烷菌［28］.Zhang等［23］在秸稈沼氣發酵反應器中微生物群落特征研究中表明秸稈反應器中甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）為優勢種群，相對豐度為69.2%～71.9%，在秸稈中添加豬糞的反應器中，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為優勢種群，相對豐度為73.1%，甲烷鬃菌屬（Methanosaeta），屬于極端嚴格厭氧菌，最適生長溫度為40℃，可利用氫氣或甲酸鹽，還原二氧化碳生成甲烷，不能利用乙酸和甲基胺，在富含纖維的原料厭氧消化中發揮著重要作用.何志剛等［26］在研究牛糞沼氣產甲烷菌多樣性時，甲烷八疊球菌（Methanosarcina sp.）為優勢微生物，占總數的42%.甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）是僅能的以乙酸為代謝底物產甲烷的菌屬，同時也是地球生物圈CH4來源最大的貢獻者，甲烷巴疊球菌科（Methanosarcinaceae）的其他物種均可利用甲醇和甲胺產甲烷［27］.

圖7 不同發酵原料古菌聚類分析Fig.7 Cluster analysis of archaea about different materials 1～5:雞糞；6～10:豬糞；11～15:秸稈；16～20:牛糞

表4 DGGE條帶克隆測序結果Table 4 Sequence of cloned DGGE bands

圖8 不同發酵原料古菌PCR-DGGE指紋圖譜Fig.8 Diversity index of archaea about different materials

2.4.3 不同發酵原料古菌群落多樣性分析 不同發酵原料古菌菌群的多樣性指數見圖8.從圖8可知，雞糞的多樣性指數介于3.03～3.55，豬糞的多樣性指數介于3.31～3.47，秸稈的多樣性指數介于3～3.47，牛糞的多樣性指數介于3.26～3.45.雞糞和秸稈的多樣性指數期初較低，后來有明顯升高的趨勢，表明這兩個發酵體系的古菌微生物群落結構發生了很大的變化，秸稈的基本成分主要包括木質素、纖維素、半纖維素等［29］，微生物首先要將這些大分子有機物降解成小分子有機物后才能提供給產甲烷菌進一步利用，因此秸稈發酵系統的啟動器較長，發酵初期微生物群落多樣性指數比豬糞、牛糞組低；雞糞的氨氮含量高，低質量濃度的氨氮可以為微生物生長提供氮源，且有利于維持穩定的pH值，但是高質量濃度的氨氮會抑制產甲烷［30］，發酵初期主要是一些硝化細菌利用轉化氨氮，因此抑制了甲烷菌的生長.豬糞和牛糞發酵體系的多樣性指數變化不大，表明這兩個發酵體系的古菌群落結構相對穩定.

3 結論

3.1 日產甲烷量整體趨勢為豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞，它們的日平均產甲烷量分別為2.67、2.24、0.99、0.49L，除了牛糞其他3組的日產氣量都呈現出先緩慢上升最后保持一個相對穩定的狀態.日產甲烷濃度整體趨勢為豬糞＞雞糞＞秸稈＞牛糞，豬糞、雞糞、秸稈的日產甲烷濃度在整個發酵周期大多可維持在50%以上，牛糞的日產甲烷濃度大部分時間低于30%.

3.2 細菌優勢菌群有擬桿菌屬（Bacteroidetes）、密螺旋體屬（Treponema）、厭氧繩菌科（Anaerolineaceae）等，新增優勢菌群有梭菌屬（Clostridium）、脫硫葉菌屬（Desulfobulbus）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、醋弧菌屬（Acetivibrio）等.雞糞的細菌Shannon-Wiener指數（H）介于3.59～3.73，豬糞介于3.5～3.8，秸稈介于3.4～3.63，牛糞介于3.45～3.56.

3.3 古菌優勢菌群有古菌甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），新增優勢菌群有斯氏甲烷球菌屬（Methanosphaera stadtmanae）.雞糞的古菌Shannon-Wiener指數（H）介于3.03～3.55，豬糞介于3.31～3.47，秸稈介于3～3.47，牛糞介于3.26～3.45.

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Studies on microbial community of different materials and anaerobic fermentation.

LI Hai-hong1， BA Qi-yue1， YAN Zhi-ying2*， LIU Xiao-feng2（1.Department of Environmental Science， Xi'an Polytechnic University， Xi'an 710048，China；2.Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology， Chengdu Institute of Biology， Chinese Academy of Sciences， Chengdu 610041， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1449～1457

PCR-DGGE analysis was used to study the diversity of the microbial community in different anaerobic fermentation systems using chicken dung， pig manure， cow dung and straw as substrate respectively. Methane biogas production and methane concentration were measured daily. Slurry was sampled at different fermentation stage and used for DGGE analysis. The results showed that the overall trend of daily biogas production appeared pig＞ chicken＞ straw＞cow dung and their average biogas production was 2.67， 2.24， 0.99， 0.49L. Daily methane concentration of pig， chicken manure and straw was above 50% during the whole fermenting period， while the methane concentration of cow was less than 30% most of the time. Dominant bacterial groups were Bacteroidetes， Treponema， Anaerolineaceae and the newly developed bacterial groups were Clostridium， Desulfobulbus， Lachnospiraceae and Acetivibrio. Dominant archaeal groups were Methanobacteriaceae， Methanosarcina and Methanosarcinales. A newly developed group was Methanosphaera stadtmanae.

chicken dung；pig manure；cow dung；straws；anaerobic fermentation；PCR-DGGE；bacterial diversity

X705

A

1000-6923（2015）05-1449-09

李海紅（1971-），女，陜西西安人，教授，碩士，從事固體廢物處理及資源化利用研究.發表論文14篇.

2014-09-19

國家重點基礎研究發展計劃（973）項目（2013CB733500）；國家國際科技合作專項項目（2013DFA61260）；四川省應用基礎研究計劃項目（2013JY0050）

* 責任作者， 副研究員， Yanzy@cib.ac.cn