水稻幼苗對納米氧化銅的吸收及根系形態生理特征響應

劉 濤，向 壘，2*，余忠雄，莫測輝*，李彥文，2，趙海明，2，蔡全英，李 慧（.暨南大學環境學院，廣東省高校水土環境毒害性污染物防治與生物修復重點實驗室，廣東 廣州 50632；2.暨南大學生態學系，廣東 廣州 50632）

水稻幼苗對納米氧化銅的吸收及根系形態生理特征響應

劉 濤1，向 壘1，2*，余忠雄1，莫測輝1*，李彥文1，2，趙海明1，2，蔡全英1，李 慧1（1.暨南大學環境學院，廣東省高校水土環境毒害性污染物防治與生物修復重點實驗室，廣東 廣州 510632；2.暨南大學生態學系，廣東 廣州 510632）

以納米氧化銅nano-CuO（10， 100mg/L）為研究對象，以微米氧化銅micron-CuO（10， 100mg/L）及銅離子Cu2+（1.4， 2.3mg/L）為對照，通過水培實驗，探討水稻對nano-CuO的吸收積累及其根系形態和生理特征響應.結果表明，各濃度（10， 100mg/L）nano-CuO處理條件下，水稻根部及地上部銅含量（根351～1444mg/kg dw；地上部9～45mg/kg dw）總體高于micron-CuO處理（根248～817mg/kg dw；地上部1.57～1.60mg/kg dw）及Cu2+處理（根147～220mg/kg dw；地上部14～26mg/kg dw），且在水稻幼苗根及莖透射電鏡圖片中均觀察到nano-CuO的存在，指示水稻可通過納米顆粒的形式吸收、轉運nano-CuO. Nano-CuO在水稻根細胞中主要存在于核內體中，指示內吞作用是其進入根細胞的主要方式. Nano-CuO對水稻幼苗根系有較強的毒性作用，對各根系形態指標的抑制率為28%～74%，其中總根長、根體積和比表面積為最敏感；nano-CuO的吸收累積及納米效應是其水稻根系毒性的主要原因.低濃度nano-CuO （10mg/L）脅迫時，水稻幼苗根系活力顯著提高，總吸收面積和活躍吸收面積無顯著差異；高濃度nano-CuO （100mg/L）脅迫時，水稻幼苗根系活力和總吸收面積顯著降低.

納米氧化銅；水稻；根系；形態；生理特征

由于尺度（1～100nm）和結構方面的特點，工程納米材料（ENPs）具有優越的導電性、反應活性以及光學特性等，被廣泛應用于工業、農業和商業各領域［1-4］.大規模生產、使用，導致ENPs不斷進入環境［5-6］，其潛在的環境安全風險已引發人們廣泛關注［7］.植物是生態系統的重要組成部分，進入環境的ENPs可被其吸收、積累，并造成嚴重的毒害效應［5，8］.根系是植物吸收水分和礦質元素的重要器官［9-10］，也是植物暴露和吸收ENPs的主要通道［5］，其形態和生理指標特征決定了植物獲取養分的能力［10-11］以及受ENPs毒害的程度［12］.大量研究顯示［12-14］，多數ENPs可嚴重抑制植物根系的生長，但具體對植物根系形態及生理指標影響的研究卻鮮見報道［15-17］.

納米氧化銅（nano-CuO）是一種重要的納米金屬材料，被作為涂覆材料、催化劑、潤滑劑以及殺菌劑等廣泛應用.水稻是我國主要糧食作物，也是評價污染物富集和毒性效應的模式生物［18］.但目前有關其吸收積累納米金屬材料及毒性效應的研究鮮見報道［15］.為此，本文以nano-CuO為研究對象，以微米氧化銅（micron-CuO）及銅離子（Cu2+）為對照，通過水培實驗，探討水稻對nano-CuO的吸收積累及其根系形態和生理特征響應，以期為nano-CuO的生態風險評估提供基礎數據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水稻品種為天優3618（廣泛種植于華南地區）發芽率為95%，購自廣東省農業科學院水稻研究所；納米氧化銅（nano-CuO），純度≥99.5%，購自Sigma-Aldrich公司，經場發射掃描電鏡（JSM-6330F型，日本株式會社）觀察，其粒徑在20～70nm之間（平均粒徑40nm），為橢球狀；微米氧化銅（micron-CuO），分析純，購自廣州化學試劑廠，經場發射掃描電鏡觀察，其粒徑在1～8μm之間（平均粒徑2.6μm），為塊狀、團聚體等.硫酸銅（CuSO4·5H2O）、30% H2O2、硝酸、甲烯藍、氯化三苯基四氮唑（TTC）、乙酸乙酯、磷酸等均為分析純，購自廣州化學試劑廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 培養液制備 將一定量的nano-CuO或micron-CuO粉末分別加入1/4全營養液［7］（以1mol/L氫氧化鈉調節pH值為6.8）中，超聲（100W，40kHz）分散30min，制得含nano-CuO及micron-CuO（10， 100mg/L）的培養液備用.銅離子處理培養液（1.4， 2.3mg/L）由CuSO4·5H2O溶于1/4全營養液制備.

1.2.2 水培實驗 選取大小均勻且籽粒飽滿的水稻種子，經2% H2O2浸泡（10min）消毒后，用去離子水沖洗5遍，置于恒溫培養箱（PYX-300G-B型，科力儀器）中避光發芽，待水稻幼苗根伸長至40mm左右時，移至1/4營養液中（pH值為6.8）培養，直至兩葉一心時，移至不同濃度nano-CuO （10，100mg/L）、micron-CuO（10， 100mg/L）或Cu2+（1.4，2.3mg/L）及對照（未加污染物）培養液中（共7個處理）開始水培實驗.培養液盛放于培養桶中（高14cm，上內徑17cm，底徑12cm），每桶培養液體積為2L，種植6株水稻（用泡沫板固定），每濃度處理設置3個平行.為避免光照影響，培養桶外壁依次覆蓋一層錫紙和一層牛皮紙.水培實驗于2013年10月20日開始在暨南大學環境學院溫室進行，溫度控制為（25±5）℃，每3d更換一次培養液（包括nano-CuO、micron-CuO及Cu2+處理）.水培14d后，收獲水稻植株進行各項指標測定.

1.3 測定項目及方法

1.3.1 培養液中納米氧化銅及微米氧化銅溶出Cu2+的測定 分別取新鮮配制的nano-CuO（10，100mg/L）及micron-CuO培養溶液（100mg/L）置于暗處，于0， 1， 3， 8， 16， 24， 72， 120h取上層清夜，離心（8000轉/min，30min），過0.22 μm濾膜后，采用火焰原子吸收光度計（AA7000型，日本島津）測定其Cu2+濃度［7］.

1.3.2 水稻體內銅含量測定 用去離子水多次沖洗水稻植株樣品，之后將其切分為根系及地上部分，置于105℃烘箱殺青（15min），并于70℃下烘干至恒重；以硝酸（HNO3）為消解劑，于微波消解儀（MARS型，美國CEM）消解后，用火焰原子吸收光度計測定其銅含量.

1.3.3 水稻根表吸附納米氧化銅及微米氧化銅的觀察 水培結束后，取水稻根尖樣品1～2cm，置于載玻片制成根尖切片，用光學顯微鏡（CX31型，奧林巴斯）在4倍放大條件下觀察水稻根表對nano-CuO及micron-CuO的吸附情況［7］.

1.3.4 水稻體內納米氧化銅的觀察 水培結束后，用雙面刀片切取清洗干凈的水稻根尖樣品（1mm）、莖部樣品（1mm×1mm），用4%戊二醛（pH 7.2）于4℃條件下固定5h，再用1%鋨酸固定2h，之后經磷酸緩沖液（pH 2）漂洗，乙醇梯度脫水，環氧樹脂包埋，醋酸鈾染色，超薄切片（70～100nm）后，置于鎳網，用場發射透射電鏡（JEM-2100F型TEM，日本電子）觀察水稻體內的nano-CuO［5，7］，并用X射線能譜儀（EDS）進行元素分析.

1.3.5 水稻根系形態指標測定 采用根系掃描儀（LA-4800型，上海鑫態）采集水稻根系圖像后，用根系圖像分析軟件WinRHIZO （Regent instruments Inc， 加拿大）進行分析，以此獲得水稻總根長、根表面積、根直徑、根尖數及根體積等參數［11］.

1.3.6 水稻根系生理指標測定 采用甲烯藍法測定水稻根系表面積、總吸收面積和活躍吸收面積，采用三苯基氯化四氮唑（TTC）還原法［19］測定水稻根系活力.

1.4 數據處理

采用Excel 2007 進行數據統計及圖形繪制，采用SPSS 17.0進行顯著性分析和相關性分析.數據結果表示為平均值±標準偏差（Mean±SD），差異顯著水平為P ＜ 0.05.

2 結果與討論

2.1 納米氧化銅培養液中銅離子溶出量

納米金屬材料的生物毒性與其溶出金屬離子密切相關［20］.為此，本文以micron-CuO（100mg/L）為對照，考察了不同靜置時間（0～240h）培養液（pH 6.8）中nano-CuO（10， 100mg/L）的銅離子（Cu2+）溶出量.結果顯示，靜置0～72h，nano-CuO及micron-CuO處理的Cu2+溶出量均隨靜置時間增加而顯著增加（圖1）；靜置72h后，二者的Cu2+溶出量逐漸達到平衡，100mg/L nano-CuO溶出2.3mg/L Cu2+，顯著高于對應濃度（100mg/L）micron-CuO（1.4mg/L， P ＜0.05），后者Cu2+溶出量與10mg/L nano-CuO（1.3mg/L）處理相當.據此，以1.4mg/L Cu2+對應10mg/L nano-CuO和100mg/L micron-CuO的Cu2+溶出量，以2.3mg/L Cu2+對應100nano-CuO的Cu2+溶出量進行后續實驗.

圖1 不同靜置時間培養液中nano-CuO溶出Cu的含量Fig.1 Time-dependent dissolution of nano-CuO in nutrient solution

2.2 水稻根系對納米氧化銅的吸附及吸收

由于粒徑小，表面能大，納米材料可通過機械粘附及根系分泌物包裹等方式吸附于植物根表［21］.從根尖切片可見，nano-CuO及micron-CuO均可在水稻根表吸附，且前者吸附量明顯高于后者（圖2）.吸附于植物根表的納米材料可被植物根系吸收，并向地上部轉運［22］.由圖3可見，各處理水稻根系銅含量均隨其暴露濃度增加而顯著提高（P＜0.05），大小順序為nano-CuO（351～1444mg/kg dw） ＞ micron-CuO（248～817mg/kg dw） ＞ Cu2+（147～220mg/kg dw）.各處理水稻根系吸收銅后均可向地上部分轉運，但轉運能力及地上部分含量差異顯著.就nano-CuO處理水稻而言，隨暴露濃度的增加，其地上部分銅含量顯著提高，在9～45mg/kg之間，轉運系數（地上部與根部銅含量之比）則變化不大（0.026～0.031）.Nano-CuO對應Cu2+處理在較低濃度下（1.4mg/L）高于nano-CuO處理（10mg/L）水稻地上部銅含量（14mg/kg dw），在較高濃度下（2.3mg/L時銅含量為26mg/kg dw）則低于nano-CuO處理；但銅離子處理的轉運系數（0.095～0.118）遠高于納米氧化銅處理，指示兩種處理銅元素的轉運方式不同，前者以Cu2+方式轉運，后者除可以Cu2+轉運外，還可能以nano- CuO顆粒形態直接轉運.相比nano-CuO和Cu2+處理，micron-CuO處理水稻地上部分銅含量較低，且隨濃度變化不大，為1.57～1.60mg/kg；其轉運系數也較低，僅為0.002～0.006，指示micron-CuO難以向水稻地上部分轉運，這可能與其粒徑較大有關.

圖2 nano-CuO及micron-CuO在水稻根表的吸附Fig.2 The sorption of nano-CuO and micron-CuO in the root surface of rice A-100mg/L nano-CuO，B-100mg/L micron-CuO，C-空白

圖3 水稻根部及地上部銅含量Fig.3 Copper contents in root/shoot of rice

為進一步證實水稻根系對顆粒態nano-CuO的吸收、轉運，取100mg/L nano-CuO處理水稻根尖及莖部樣品分別制備透射電鏡（TEM）切片觀察.結果表明，水稻樣品根部及莖部細胞質、細胞壁及細胞間隙中均可觀察到“黑色顆粒狀物質”，能譜分析顯示這些顆粒物有較高的Cu元素峰和O元素峰，指示其為nano-CuO［7］（圖4）.圖4中較高的Ni元素峰和C元素峰分別是由于TEM切片觀察時使用鎳網支持膜以及植物組織背景元素造成的.根部及莖部同時存在nano-CuO，指示其可被水稻根系以顆粒態形式向地上部轉運.在根部及莖部細胞中，nano-CuO（20～120nm）主要以核內體（初級核內體及次級核內體）形式存在（圖4A，B）.核內體為囊泡結構，是真核細胞內吞作用的主要運輸載體［7］，其可分為初級核內體和次級核內體，前者主要以單囊泡形式存在，后者以密集空腔狀囊泡存在［23］.物質以內吞作用進入細胞時，首先與初級核內體融合，之后初級核內體逐漸長成次級核內體，并與溶酶體結合釋放內吞物質［24］.因此，大量nano-CuO顆粒被包裹存在于水稻根部及莖部初級核內體及次級核內體結構內，指示其主要通過內吞作用進入水稻根細胞和莖細胞.前人研究玉米對nano-CuO的吸收時也得到類似結果［7］.

2.3 納米氧化銅對水稻根系形態及生理特征的影響

根系形態指標是反映植物生長情況的重要參數，也是植物受迫響應的敏感指標［11］.與對照相比，nano-CuO（10， 100mg/L）顯著影響水稻根系生長，并導致其形態指標參數顯著變化，此變化隨nano-CuO濃度增大而增大（表1）.各形態指標中，根尖個數（抑制率58%～68%）和根尖分叉數（抑制率57%～74%）受nano-CuO抑制程度最大，其次為根體積（抑制率31%～54%）和總根長（抑制率31%～42%），根表面積所受抑制最小，抑制率在24%～28%.與之不同，根直徑和根比表面積受nano-CuO脅迫時顯著增加，二者分別為對照的1.1～1.6倍（根比表面積）和1.1～1.2倍（根直徑）.研究表明，納米材料可干擾植物根冠生長激素分布，破環根伸長區微管正常排列，并擾亂根分生區細胞分裂［25］，從而顯著抑制植物根系的生長和分叉.同時，由于根細胞分裂和縱向伸長受阻，導致其橫向堆積，從而使得根直徑顯著增加［7］.因此，水稻幼苗根系受nano-CuO脅迫時，根尖數顯著減少（P＜0.05），根體積和根伸長顯著萎縮（P ＜0.05），而根直徑顯著增大（P ＜0.05）.另外，由于根表面積受nano-CuO抑制作用較少；而根體積受抑制作用較大，故根比表面積（二者之比）在nano-CuO脅迫下有所增加.相關性分析顯示，水稻根系銅含量與其各形態指標（除根表面積外）均存在顯著相關關系（P ＜ 0.05），與根直徑及根比表面積為正相關，與其他指標為負相關（表1），指示吸收積累銅是nano-CuO導致水稻根系毒性的重要原因.值得注意的是，nano-CuO（10， 100mg/L）對水稻幼苗根系各指標的影響總體大于其對應濃度micron-CuO（10， 100mg/L）和Cu2+（1.4， 2.3mg/L）；其中總根長、根體積和比表面積是nano-CuO毒性的敏感指標，三者在nano-CuO脅迫下的毒性效應顯著強于micron-CuO和Cu2+脅迫的毒性效應，（P ＜ 0.05）.上述結果指示，除化學成分（CuO）及溶出離子（Cu2+）外，納米效應可能也是nano-CuO對水稻幼苗根系毒性的重要原因.Nano-CuO粒徑小、比表面積較大，易被水稻幼苗根系吸附、吸收，且其表面存在缺陷，易形成電子-空穴對，誘導活性氧化物質（ROS）如O2-·，·OH等在水稻幼苗根系表面及體內產生［26-27］，從而產生納米效應并致毒.

表1 水稻幼苗根系形態特征Table 1 Morphological characteristics of rice seedling roots

2.4 納米氧化銅對水稻根系生理指標的影響

根系生理指標是反映其吸收能力和代謝強度的重要參數，其在污染物脅迫下的特征響應是評價污染物毒性效應的重要指標［11，19］.水稻幼苗根系生理指標對 nano-CuO（10，100mg/L）及其對應micron-CuO（10，100mg/L）和Cu2+（1.4，2.3mg/L）的脅迫響應較為復雜（表2）.就根系活力而言，與空白相比，低濃度nano-CuO（10mg/L）及Cu2+（1.4mg/L）處理條件下顯著增加（P＜0.05），而高濃度nano-CuO（100mg/L）處理條件下顯著降低（P＜0.05），其余處理條件下無顯著變化；就總表面積而言，與空白相比，高濃度micron-CuO處理條件下顯著提高（P＜0.05），而高濃度nano-CuO處理條件下顯著降低（P＜0.05），其余處理條件下無顯著變化；就活躍吸收面積而言，與空白相比， micron-CuO各濃度及低濃度Cu2+處理條件下均顯著提高（P ＜0.05），而其余處理條件下無顯著變化；就活躍吸收面積比率而言，除高濃度nano-CuO較空白處理顯著提高外（P＜0.05），其余處理較空白處理差異不顯著.上述結果表明，在低濃度nano-CuO或micron-CuO及Cu2+脅迫下，水稻幼苗根系防御系統被激活，產生應激反應，并通過提高（或維持）根系活力、總吸收面積或活躍吸收面積，以加快自身新陳代謝，為防御系統抵御污染脅迫提供能量，并加快污染物在其體內外的轉運，從而緩解污染物脅迫造成的損害［28］.然而，高濃度nano-CuO脅迫下，水稻幼苗根系受到嚴重損傷，難以構建有效的防御機制抵御脅迫，從而嚴重影響其吸收、代謝能力，并使其根系活力和總吸收面積顯著下降.

表2 水稻幼苗根系生理特征Table 2 Physiological characteristics of rice seedling roots

3 結論

3.1 水稻幼苗根系可吸收、積累納米氧化銅（nano-CuO），并轉運至地上部.

3.2 Nano-CuO在水稻根細胞中主要存在于核內體中，指示內吞作用是其進入根細胞的主要方式.

3.3 Nano-CuO對水稻幼苗根系有較強的毒性作用，其敏感指標為總根長、根體積和比表面積.Nano-CuO的吸收累積及納米效應是其水稻根系毒性的主要原因.

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Responses of morphological and physiological characteristics in rice （Oryza sativa L.） seedling roots to its uptake of CuO nanopaticles.

LIU Tao1， XIANG Lei1，2*， YU Zhong-xiong1， MO Ce-hui1*， LI Yan-wen1，2， ZHAO Hai-ming1，2， CAI Quan-ying1， LI Hui1（1.Key Laboratory of Water/Soil Toxic Pollutants Control and Bioremediation of Guangdong Higher Education Institutions， School of Environment， Jinan university， Guangzhou 510632， China；2.Department of Environmental Engineering， Jinan University， Guangzhou 510632， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1480～1486

Responses of morphological and physiological characteristics in rice （Oryza sativa L.） seedling roots to its uptake of nano-CuO （10， 100mg/L） were investigated using hydroponic experiments by setting micron oxide copper（micron-CuO） and copper ions （Cu2+） as control. Results showed that total copper contents in roots and shoots （roots 351～1444mg/kg dw； shoots 351～1444mg/kg dw） of rice seedlings in nano-CuO treatments （10， 100mg/L） were higher than those in micron-CuO treatments （roots 248～817mg/kg dw； shoots 1.57～1.60mg/kg dw） and Cu2+treatments（roots147～220mg/kg dw； shoots 14～26mg/kg dw）， and furthermore， nano-CuO was observed in TEM images of both root and stem cells， indicating rice seedling can uptake and transfer nano-CuO by the form of nano-CuO. A large amount of nano-CuOs observed in endosomes of rice seedling cells indicated that nano-CuO mainly relied on endocytic pathways to enter cell. The nano-CuO had toxic effects on rice seedling roots and the inhibitory rates on roots morphologies of nano-CuO ranged from 28% to 74%， and root length， root volume and root specific surface area were most sensitive indicators for nano-CuO toxicity. Both nano-CuO bioaccumulation in rice and nanoeffects resulted in toxicities of nano-CuO to rice seedling roots. Under low concentration of nano-CuO strees （10mg/L）， root activities of rice seedlings significant improved but no significant differences were observed in its total roots absorbing area and actively absorbing area， compared with the control. Under high concentration of nano-CuO strees （100mg/L）， root activities and total roots absorbing area of rice seedlings significantly decreased， compared with control.

CuO nanopaticels；rice；roots；morphology；physiological characteristics

X503.231

A

1000-6923（2015）05-1480-07

劉 濤（1991-），男，江西上饒人，暨南大學環境學院碩士研究生，從事納米金屬材料安全性評價.發表論文1篇.

2015-01-26

國家自然科學基金項目（41173101，41301337）；廣東省高校高層次人才項目；東莞市科技計劃項目（201210815000399）；暨南大學優秀博士研究生攀登計劃項目

* 責任作者， 莫測輝， 教授， tchmo@jnu.edu.cn； 向壘， 博士， wuxian622622@163.com