Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)多胺的生理響應(yīng)

欒紅艷，趙衛(wèi)紅，苗 輝（.中國科學(xué)院海洋研究所，海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室，山東 青島 26607；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 00049）

Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)多胺的生理響應(yīng)

欒紅艷1，2，趙衛(wèi)紅1*，苗 輝1（1.中國科學(xué)院海洋研究所，海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室，山東 青島 266071；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

通過室內(nèi)添加Cd2+培養(yǎng)中肋骨條藻（Skeletonema costatum），開展了Cd2+脅迫對中肋骨條藻生長的影響及藻細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、二胺氧化酶（DAO）、多胺氧化酶（PAO）的活性以及丙二醛（MDA）和各形態(tài)多胺含量變化的實驗，以探究多胺對于海洋微藻在重金屬脅迫下的響應(yīng)及生理作用.結(jié)果顯示，Cd2+對中肋骨條藻的生長產(chǎn)生脅迫作用，且Cd2+濃度越大對藻細胞生長的抑制作用越強.Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)MDA含量略有升高，SOD活性顯著降低，DAO和PAO活性分別增強.隨著Cd2+脅迫作用的增強，藻細胞內(nèi)游離態(tài)腐胺（Put）、亞精胺（Spd）、精胺（Spm）含量先降低后升高；結(jié)合態(tài)Put、Spd和Spm含量先升高后降低；束縛態(tài)Put、Spm和Spd含量及Put總量和Spm總量升高.表明Cd2+脅迫會導(dǎo)致中肋骨條藻細胞產(chǎn)生氧化損害，同時細胞內(nèi)DAO和PAO活性的增強以及游離態(tài)Put、束縛態(tài)Spd和Spm、Put總量和Spm總量的升高可能會增強藻細胞抵抗Cd2+脅迫的能力.

Cd2+脅迫；中肋骨條藻（Skeletonema costatum）；多胺

多胺是一類含有兩個及兩個以上氨基的小分子含氮化合物，廣泛存在于動物、植物、藻類及微生物體內(nèi).常見的多胺有腐胺、亞精胺和精胺.根據(jù)其在高氯酸中的溶解性分為游離態(tài)、高氯酸可溶性結(jié)合態(tài)、高氯酸不溶性束縛態(tài)［1］.多胺在細胞內(nèi)以聚陽離子態(tài)存在，因此能與一些帶負電荷的大分子如核酸、蛋白質(zhì)或小分子如酚酸結(jié)合［2］，參與細胞的生長，衰老以及脅迫反應(yīng)等生理過程［3］，對于生物體的生長發(fā)育具有重要作用.目前對于多胺在高等植物體抵抗?jié)B透脅迫、溫度脅迫、鹽度脅迫、重金屬脅迫等方面都有深入的研究［4-7］，但是對于海洋微藻在重金屬脅迫下細胞內(nèi)多胺變化的研究很少.Cd2+是海洋中一種常見的重金屬污染物，對于海洋生物的生長具有嚴重的毒害作用，而中肋骨條藻（Skeletonema costatum）是海洋中常見的硅藻，分布較為廣泛，因此研究Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞的生理響應(yīng)及各種形態(tài)多胺的變化，對于了解海洋微藻在重金屬脅迫下的響應(yīng)機制，增進對多胺生理作用的認識具有重要的意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

培養(yǎng)用海水為人工海水，經(jīng)φ47mm GF/F（whatman）濾膜過濾，添加f/2配方，煮沸滅菌冷卻后備用.研究選取的中肋骨條藻（Skeletonema costatum）由中國科學(xué)院海洋研究所藻種庫提供，采自東海.培養(yǎng)于1L的錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強度為4000～5000lx，光暗比為L:D=12:12.

1.2 實驗設(shè)計

Cd2+濃度設(shè)置5個水平，分別為0， 0.5， 0.8，1.0， 1.2mg/L，每個水平設(shè)置3個平行樣.對照組Cd2+濃度設(shè)置為0mg/L.初始接種藻的密度為1.72×104cell/mL，培養(yǎng)至指數(shù)生長期時添加不同濃度的Cd2+溶液（分析純的CdCl2·2.5H2O配制1g/L的儲備液），每隔24h測定藻細胞密度，72h后停止培養(yǎng)，離心提取藻細胞以測定MDA、SOD、DAO、PAO及多胺.

1.3 生理指標的測定

1.3.1 藻細胞密度和相對增長率（K） 通過721E型分光光度計測定藻液在440nm （對含中肋骨條藻細胞的藻液進行光譜掃描所得的最大吸收波長）的吸光值，然后根據(jù)預(yù)實驗中做出的一系列稀釋藻液的藻細胞數(shù)（N）與對應(yīng)吸光值（A）關(guān)系的標準曲線: N（105cell/mL）=8.075A-0.007，（n=5，R=0.998）計算得到藻細胞密度（105cell/mL）.相對增長率的計算:K=（lnNt-lnN0）/t，其中，Nt為t時刻藻細胞密度（cell/mL），N0為初始細胞密度（cell/mL），t為培養(yǎng)時間（d）.以藻細胞密度及細胞相對增長率來表示藻的生長狀況.

1.3.2 丙二醛（MDA）含量 丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸（TBA）法［8］并略有改動.取50mL藻液3000r/min離心10min，去上清液，沉淀中加入2mL磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH7.8），超聲波破碎藻細胞（冰浴），然后3000r/min，4℃下離心10min，取上清液作酶活分析.取1.5mL酶提取液，加入2.5mL含0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸溶液，混合物于沸水浴中反應(yīng)30min，迅速冰浴冷卻，4000r/min離心10min，上清液分別在532nm，600nm測定吸光度值.MDA含量以mol/cell表示.

1.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性 SOD測定采用氮藍四唑光化學(xué)還原反應(yīng)法［9］.粗酶液的提取同1.3.2 丙二醛的提取方法 反應(yīng)液包括2mL磷酸緩沖液（0.05mol/L， pH7.8）， 0.3mL甲硫氨酸溶液（130mmol/L），0.3mL氮藍四唑溶液（750μmol/L）， 0.3mLEDTA溶液（100μmol/L），0.3mL核黃素溶液（20μmol/L），再加入0.1mL酶液后于4000lx光照下反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后采用TU-1810型紫外-可見分光光度計在560nm處測定吸光度值.以能引起反應(yīng)初速度（指不加酶時）半抑制時的酶用量為1個酶活單位（U）.

1.3.4 DAO和PAO活性 DAO和PAO采用汪天等［10］改進的方法并略有改動.反應(yīng)混合液包括

2.5mL磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH6.5）、0.2mL顯色液（0.1mol/L， pH6.5磷酸緩沖液配制，100mL磷酸緩沖液中含有25μL N，N-二甲基苯胺、10mg氨基安替吡啉）、0.1mL過氧化物酶溶液（250U/mL）、0.2mLDAO或PAO提取液. DAO和PAO分別用0.1mLPut（20mmol/L）， 0.1mLSpd（20mmol/L）啟動反應(yīng)，30℃水浴反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束后用TU-1810型紫外-可見分光光度計測定550nm處的吸光值，以0.001△OD550/（min×cell）為1個酶活單位（U）.

1.3.5 三種形態(tài)多胺 多胺的測定采用高效液相色譜法［11］，色譜條件采用付敏等［12］的測定條件.取50mL藻液， 3000r/min離心10min，去上清液，沉淀中加入2mL 5%的高氯酸溶液，超聲波破碎細胞，然后在4000r/min離心10min.上清液中包含游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多胺，沉淀用來測定束縛態(tài)多胺.取1mL上清液進行游離態(tài)多胺的測定，加入10μL 1，6-己二胺標液（10-5mol/L），渦旋振蕩30s，加入70μL硼酸緩沖液和適量的2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使pH值達到9.8左右，渦旋混勻，再加入2mL丹磺酰氯的丙酮（5mg/mL）溶液，渦旋混勻，40℃下水浴避光衍生45min，加入25%的濃氨水100μL中止反應(yīng)并除去多余的丹磺酰氯，渦旋混勻30s，避光靜置30min，用乙醚萃取，氮氣吹干，加入500μL乙腈溶解殘留物，最后用0.22μm有機針頭微孔濾膜過濾，進樣分析.將另1mL上清液及沉淀，分別用等體積的12mol/L 的HCl混合，封裝于安瓿瓶中，在110℃水解18h后，70℃旋轉(zhuǎn)蒸干，再用1mL 5%高氯酸溶解，然后按游離態(tài)多胺的測定方法測定結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)多胺.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行ANOVA，用Origin8.5作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 過量Cd2+對中肋骨條藻生長的影響

圖1A表明添加過量Cd2+能抑制中肋骨條藻的生長.培養(yǎng)至72h，Cd2+濃度大于0.8mg/L時藻細胞密度均顯著低于對照組（P＜0.01）.

由圖1B可見，中肋骨條藻細胞的相對增長率會隨著培養(yǎng)液中添加Cd2+濃度的增大而降低.添加濃度到1.0mg/L時藻細胞相對增長率降低了37.8%.由此看來向培養(yǎng)液中添加過量Cd2+對中肋骨條藻的生長產(chǎn)生了脅迫作用.

圖1 Cd2+對中肋骨條藻細胞密度和相對生長率的影響Fig.1 The effect of Cd2+on the cell density and relative growth rate of Skeletonema costatum

2.2 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)MDA含量與SOD活性的變化

向培養(yǎng)液中添加Cd2+培養(yǎng)中肋骨條藻72h后，藻細胞內(nèi)MDA含量略有升高（P=0.619）.添加Cd2+濃度為0.8mg/L時MDA含量比對照組升高了12.1%（圖2A）.相反，添加Cd2+后，中肋骨條藻細胞內(nèi)SOD活性比對照組顯著降低（P＜0.001）.添加1.0mg/L Cd2+時SOD活性比對照組降低了37.3%；添加1.2mg/L Cd2+時SOD活性比對照組降低74.7%（圖2B）.

MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量可以作為衡量細胞所受的氧化損害程度大小的指標.Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)MDA含量略有升高，表明添加Cd2+對藻細胞產(chǎn)生了一定的氧化損害.有研究表明，重金屬脅迫能夠影響電子正常的易位遷移，導(dǎo)致大量的自由基產(chǎn)生，從而引起膜脂過氧化［13］.SOD是細胞自身的一種抗氧化酶，能夠通過歧化反應(yīng)清除自由基，降低活性氧對細胞所產(chǎn)生的氧化損害，從而減少細胞內(nèi)MDA的產(chǎn)生.實驗中Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)SOD活性隨Cd2+濃度的增大而降低，表明藻細胞抵抗氧化損害的能力減弱，從而導(dǎo)致MDA的積累.

圖2 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)MDA含量及SOD活性變化Fig.2 Changes of intracellular MDA contents and SOD activity of Skeletonema costatum under Cd2+stress

2.3 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)DAO與PAO活性變化

添加Cd2+培養(yǎng)72h后中肋骨條藻細胞內(nèi)DAO和PAO活性升高，且PAO活性變化較DAO明顯.Cd2+濃度為0.5mg/L組DAO活性比對照升高34.5%，其他組DAO活性較對照組升高幅度較小（圖3A）.PAO活性隨Cd2+濃度增加而升高，與對照組相比，Cd2+濃度為1.2mg/L組比對照組升高61.7%（圖3B）.

Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)DAO和PAO活性增強對于Put、Spd及Spm的氧化分解起著重要作用.Besford 等研究發(fā)現(xiàn)，DAO和PAO活性增強時，可能會促進多胺的分解反應(yīng)，通過生成1，3-二氨基丙烷來調(diào)節(jié)滲透脅迫下燕麥葉類囊體膜的穩(wěn)定性［14］.因此，DAO和PAO的活性對于維持膜的穩(wěn)定性及改善藻細胞抵抗Cd2+脅迫的能力具有重要意義.

圖3 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)DAO， PAO活性變化Fig.3 Changes of intracellular DAO， PAO activity of Skeletonema costatum under Cd2+stress

2.4 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)各形態(tài)多胺含量及所占百分比的變化

由圖4A可見，中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)Put的含量隨添加Cd2+濃度的增加先降低后升高，呈U型變化；結(jié)合態(tài)Put含量隨添加Cd2+濃度的增大先升高后降低，呈峰型變化，Cd2+濃度為0.5mg/L組結(jié)合態(tài)Put含量比對照組升高了58.1%；束縛態(tài)Put含量隨添加Cd2+濃度的增加而升高.中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)Put所占Put總量的比例隨Cd2+濃度的增大呈先降低后升高的趨勢，束縛態(tài)Put所占比例的變化趨勢與游離態(tài)Put相似，而結(jié)合態(tài)Put所占比例的變化趨勢與兩者相反.

圖4 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)各形態(tài)Put， Spd，Spm含量與所占百分比Fig.4 Histogram of different forms of intracellular Put，Spd， Spm contents and the line charts for their percentage of Skeletonema costatum under Cd2+stress

圖4B表明，中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)Spd含量隨添加Cd2+濃度的增加先降低后升高，呈U型變化；結(jié)合態(tài)Spd含量隨Cd2+濃度的增大先升高后降低，呈峰型變化；束縛態(tài)Spd含量比對照組略有升高.藻細胞內(nèi)游離態(tài)Spd所占Spd總量的比例隨Cd2+濃度的增大呈先降低后升高的趨勢，而結(jié)合態(tài)Spd所占比例的變化趨勢與之相反；束縛態(tài)Spd所占Spd總量的比例最低.

如圖4C所示，中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)Spm含量隨著Cd2+濃度的增大先降低后升高，呈U型變化，1.2mg/L組游離態(tài)Spm比0.5mg/L組含量增加了80%（P＜0.05）；結(jié)合態(tài)Spm含量隨Cd2+濃度的增大先升高后降低，呈峰型變化；束縛態(tài)Spm含量隨Cd2+脅迫的增強而升高.添加Cd2+濃度為1.2mg/L組束縛態(tài)Spm含量比對照組升高了近2倍，比0.5mg/L組增加了20% （P＜0.05）.藻細胞內(nèi)游離態(tài)Spm所占Spm總量的比例先降低后升高，結(jié)合態(tài)Spm所占比例的變化趨勢與之相反，束縛態(tài)Spm所占比例隨Cd2+濃度的增大呈升高趨勢.

對于多胺的總量而言，Cd2+脅迫下Put總量較對照組升高，Spd總量隨Cd2+濃度的增大呈降低趨勢，Spm總量隨添加Cd2+濃度的增大先降低后升高.添加Cd2+濃度為0.5mg/L組的Put總量比對照組升高了27%；1.2mg/L組Spm總量比對照組升高了31.3%.

中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)Put、束縛態(tài)Spd和Spm以及Put總量和Spm總量隨Cd2+脅迫的增強呈升高趨勢，對于藻細胞抵抗Cd2+脅迫，降低活性氧傷害具有重要作用［15］.Wang［16］和李陽［17］等研究發(fā)現(xiàn)重金屬對植物細胞產(chǎn)生毒害作用的方式可能有以下幾種:（1）降低細胞內(nèi)抗氧化酶的活性，導(dǎo)致大量的活性氧物質(zhì)產(chǎn)生（2）導(dǎo)致膜脂過氧化（3）破壞膜的穩(wěn)定性和完整性（4）破壞細胞內(nèi)多胺的內(nèi)穩(wěn)態(tài).而多胺由于其在細胞內(nèi)以聚陽離子態(tài)存在，因此能夠與帶負電荷的核酸、蛋白質(zhì)及膜上的磷脂等結(jié)合，對于維持膜的穩(wěn)定性和完整性發(fā)揮著積極的作用［18］.此外研究表明，多胺能夠有效清除自由基，降低膜脂過氧化的傷害，增強植物體抵抗脅迫的能力［19］.因此，Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)Put、束縛態(tài)Spd和Spm以及Put總量和Spm總量的升高，對于提高藻細胞對Cd2+脅迫的耐受力具有一定的積極作用.

2.5 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)多胺含量與酶活性變化的相關(guān)關(guān)系

圖5 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)多胺含量與酶活性的相關(guān)性Fig.5 The relationship between intracellular polyamines contents and enzyme activities of Skeletonema costatum under Cd2+stress

由圖5可知，Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)束縛態(tài)Put含量與DAO活性呈顯著指數(shù)負相關(guān)（R=-0.8779， P＜0.01），隨著DAO活性增強，束縛態(tài)Put含量呈降低趨勢；而Spd總量與PAO活性，MDA含量與游離態(tài)Put含量，束縛態(tài)Spd含量與SOD活性，束縛態(tài)Spm含量與SOD活性均呈顯著線性負相關(guān).

Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)MDA含量與游離態(tài)Put含量呈顯著線性負相關(guān)，隨著添加Cd2+濃度的增大，游離態(tài)Put含量的增加會抑制MDA含量的升高，表明游離態(tài)Put能夠緩解細胞的膜脂過氧化損害.

隨著添加Cd2+濃度的增大，藻細胞內(nèi)束縛態(tài)Spd及束縛態(tài)Spm含量均比對照組升高，且均與SOD活性呈顯著線性負相關(guān)，可能是Cd2+脅迫下藻細胞內(nèi)SOD活性降低，進而刺激了束縛態(tài)Spd和Spm含量的升高.Lomozik等認為，束縛態(tài)多胺以共軛或交聯(lián)的方式與核酸、蛋白質(zhì)等大分子結(jié)合可以增強核酸和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，對于植物抵抗外界脅迫能起到積極作用［20］；也有研究發(fā)現(xiàn)，Spd和Spm能分別提高水鱉葉對銅脅迫及荇菜對汞脅迫的耐受性［19，21］；Besford等［14］研究發(fā)現(xiàn)Spd，Spm，丙二胺或它們的代謝物含量升高，對于膜的穩(wěn)定性具有保護作用.而且Spm在脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其通過調(diào)節(jié)離子通道活性或是在病菌感染及其他脅迫時生成H2O2傳遞信號的方式起作用［22-23］.因此Cd2+脅迫下束縛態(tài)Spd和Spm含量的升高可能會增強藻細胞抵抗Cd2+脅迫的能力.

2.6 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)（Spd+Spm）/Put比值的變化

培養(yǎng)液中添加少量的Cd2+，會使中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)（Spd+Spm）/Put比值比對照組降低，0.5mg/L組比對照組降低了43.8%，然而隨著添加Cd2+濃度的繼續(xù)增加， （Spd+Spm）/Put的比值又有所回升，1.0mg/L組和1.2mg/L組的（Spd+Spm）/ Put比值又回升到對照組的水平.

有文獻報道， （Spd+Spm）/Put比值的減小對于滲透脅迫下谷類葉片組織具有毒害作用［4，24］.本實驗添加少量Cd2+會使中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)（Spd+Spm）/Put比值降低，這可能會對藻體生長產(chǎn)生不利影響，但隨著添加Cd2+濃度的增大，（Spd+Spm）/Put比值又有所回升以緩解這種不利影響.

圖6 Cd2+脅迫下中肋骨條藻細胞內(nèi)游離態(tài)（Spd+Spm）/Put比值的變化Fig.6 Changes of the intracellular free （Spd+Spm）/Put ratio of Skeletonema costatum cells under Cd2+stress

3 結(jié)論

3.1 在培養(yǎng)過程中，隨著向培養(yǎng)液中添加Cd2+濃度的增大，中肋骨條藻的生長受到抑制.藻細胞內(nèi)MDA含量略有升高，而SOD活性顯著降低，藻細胞可能遭受到一定程度的膜脂過氧化損害.

3.2 添加過量Cd2+后，中肋骨條藻細胞內(nèi)DAO和PAO活性升高，對于多胺的氧化分解起到一定的促進作用，從而對提高藻細胞抵抗Cd2+脅迫的能力具有一定的積極作用.

3.3 隨著添加Cd2+濃度的增大，中肋骨條藻細胞內(nèi)各形態(tài)多胺的變化不同，其中游離態(tài)Put，束縛態(tài)Spd和Spm以及Put總量和Spm總量升高，可能會提高藻細胞抵抗Cd2+脅迫的能力.

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致謝：本實驗的樣品測定是在王江濤教授實驗室進行的，在此表示感謝.

Polyamines response to Cd2+stress and their physiological roles in Skeletonema Costatum.

LUAN Hong-yan1，2，ZHAO Wei-hong1*， MIAO Hui1（1.Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences， Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266071， China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1487～1494

Culture experiments were carried out about the effects of Cd2+stress on the growth of Skeletonema costatum， in the meanwhile， the activity of dismutase （SOD）， diamine oxidase （DAO）， polyamine oxidase （PAO）， and the contents of malondialdehyde （MDA） and various forms of polyamines extracted from algae cells were monitored. It aimed to explore the response and physiological roles of polyamines to the heavy metal stress in microalgae. The results showed that Cd2+inhibited the growth of Skeletonema costatum， and the greater the concentration was， the stronger the inhibition would be. With the enhancement of Cd2+stress， MDA content in the Skeletonema costatum cell increased slightly， SOD activity reduced significantly and DAO， PAO activity enhanced respectively. As the effect of Cd2+stress strengthen， the contents of free putrescine （Put）， spermidine （Spd） and spermine （Spm） decreased firstly and increased subsequently； conjugated Put， Spd and Spm contents increased at first and then decreased. However， bound Put， Spm and Spd as well as total Put and total Spm kept increasing. It suggested that Cd2+stress caused oxidative damage to Skeletonema costatum cells. Meanwhile， the enhancement of DAO and PAO activity as well as the increasement of free Put， bound Spd and Spm， total Put and total Spm would enhance the resistance ability of Skeletonema costatum to Cd2+stress.

Cd2+stress；Skeletonema costatum；polyamines

X503.23

A

1000-6923（2015）05-1487-08

欒紅艷（1988-），女，山東青島人，中國科學(xué)院海洋研究所碩士研究生，主要研究方向為海洋化學(xué).

2014-10-08

國家自然科學(xué)基金項目（41276118）

* 責(zé)任作者， 研究員， whzhao@qdio.ac.cn