官廳水庫水質特征及水體微生物多樣性的響應

孫寓姣，陳 程，2，丁愛中*，趙曉輝，張惠淳（.北京師范大學水科學研究院，北京 00875；2.中國國際工程咨詢有限公司資源與環境業務部，北京 00048）

官廳水庫水質特征及水體微生物多樣性的響應

孫寓姣1，陳 程1，2，丁愛中1*，趙曉輝1，張惠淳1（1.北京師范大學水科學研究院，北京 100875；2.中國國際工程咨詢有限公司資源與環境業務部，北京 100048）

針對北京市原水源地官廳水庫，選擇了上下游共6個采樣點進行了不同季節的水質及環境因子特征分析.總體看來，4個季節水體氮磷碳營養物質濃度依次為:夏季＞秋季＞春季＞冬季，夏秋季出現明顯水華.上游媯水河水質要好于下游水庫庫區水質，尤其以夏秋季節最為明顯.夏季上游媯水河的總碳、總氮、氨氮、總磷平均濃度為26.5， 0.95， 0.55， 0.077mg/L，而水庫庫區響應平均濃度分別為111.47， 4.27， 3.16，0.25mg/L.結合PCR-DGGE對不同時期各點水體微生物進行了群落分析，發現上下游水體中細菌群落結構差異很大，水華嚴重區的細菌群落多樣性和豐度要低于比水質較好區域.CANOCA軟件分析了夏秋季水華時水體微生物群落變化與環境因子的響應關系，發現細菌群落結構與環境因子（T、pH值、DO、NFR、TP、Fe）之間存在較強的關聯.水質較好的上游水體夏秋細菌群落結構主要受溫度、DO影響較大；而水質較差的庫區水體夏秋季細菌群落結構變化與固氮速率、pH值、總磷的相關性較好.

官廳水庫；水華；環境因子；水質；微生物多樣性

官廳水庫位于北京市西北部，是新中國成立后興建的第一座大型水庫.從20世紀70年代起由于受上游工農業污染，官廳水庫水質惡化，富營養化嚴重，1997年退出北京市應用水體系［1-3］.而先前的監測數據顯示，總磷（TP）、氨氮（NH4+-N）、總氮（TN）是官廳水庫夏季富營養化的主要貢獻因子［4］.近年來，由于北京市飲用短缺，官廳水庫的水體修復即成為亟待解決的問題之一.水體中氮營養元素的來源主要有人為源及天然源，目前針對官廳水庫氮含量超標的人為來源研究很多，但是對其天然來源的研究則很少.

作為水生生態系統的一個重要組成部分，細菌數量巨大，具有很高的能量轉換效率，是水體生態系統能量流動、營養物質交換的重要環節.在水體環境發生變化時，細菌群落結構也會發生相應變化［5-6］.因此細菌群落對水環境質量相互關系十分密切.目前大量研究工作都是針對湖泊中的浮游動植物進行的［7］，而水華過程中水體細菌群落的變化應是研究水體性質變化的一個重要切入點.鄭小紅等［8］用PCR-DGGE技術對玄武湖的水體進行了細菌群落的變化分析，發現在水華暴發期細菌優勢種有16種，生物多樣性高，而進入衰退期后優勢菌減少，多樣性降低， 但細菌數量增大.

本文對官廳水庫不同季節水體水質理化指標進行跟蹤監測，探索水庫水質年度變化情況.監測的水質指標主要包括:溫度、pH、DO、、、、TN、TP、BOD5、COD和葉綠素a，以及自然界內源的氮輸入方式固氮作用的速率. 分析水體氮磷營養元素含量變化的原因.利用PCR-DGGE技術擴增細菌16srDNA基因來對官廳水庫不同區域水體中細菌的群落變化進行了研究，以期發現水體富營養化過程中微生物群落結構的響應關系.進而為水華水質變化及水體中微觀生態代謝過程深入討論提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 采樣點設置

水樣的采集于7月20日水華發生時進行，本次采樣共設6個采樣點（S1～S6）如圖1所示.其中S1、S2、S3位于官廳水庫上游媯水河，S4、S5、S6位于水庫庫區，采樣過程中使用GPS系統對每個采樣點進行精確定位，采樣點位置S1～S6經、緯度依次為115°46′5″，40°21′58″； 115°42′24″，40°20′51″；115°42′9″，40°20′15；115°36′75″，40°14′1 3；15°35′57″，40°14′7；115°25′39″， 40°14′58.

1.2 水樣采集

有機玻璃采樣器采集水深0.5m左右處水樣.用于測定固氮速率的水樣注入經鹽酸浸泡洗凈、水樣反復潤洗的玻璃瓶中，低溫避光帶回實驗室.

圖1 官廳水庫采樣點示意Fig.1 Location of sampling sites in Guanting Reservoir

1.3 水樣分析

1.3.1 水體理化參數的測定 水溫、pH值、溶解氧（DO）濃度現場測定，理化指標當天送樣品至北京譜尼測試公司測定，包括-N，-N，總氮（TN）， 總磷（TP）， CODcr， Fe等.葉綠素a（Chl-a）濃度測定在北京理化測試中心完成.

1.3.2 水體固氮速率測定 采用乙炔還原法測定水體固氮速率［9-10］.取1500mL水樣8500×g離心20min 后棄上清135mL即將水樣濃縮10倍， 取濃縮水樣50mL于65mL磨口三角瓶中，用注射器抽取頂端15%的空氣，并注入等量乙炔氣體，同時用無菌水設置對照.27℃溫育72h后加入0.1mL50%TCA終止反應.取100μL頂端氣體，氣相色譜檢測乙炔含量，換算成氮含量表示固氮速率.

1.3.3 總DNA提取及固氮16s基因擴增 水樣于24h內經0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾，濃縮生物樣品.使用Omega Water DNA Kit提取水體微生物的總DNA.

使用16SrDNA V3區通用引物341F-GC和907R（合成于上海生工生物公司）對水樣基因組總DNA擴增.在上游引物341f的5'端前面加了一段“GC發卡”結構使后續的DGGE能有更好的分辨率（Poly et al.， 2001）.引物序列（GC_341f:5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3'；907r:5'-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3'）.以1μL DNA樣品為模板，PCR擴增體系含有:5.0μL 10×PCR緩沖液（Takara），4.0μL 2.5mM dNTP混合液，20mM引物各1μL，0.25μL （0.5U/μL） Taq酶 （Takara），無菌水補齊至50μL.采用降落PCR技術擴增，擴增程序為:95℃/5min；94℃/30s，63℃/60s，72℃/90s，8個循環，每個循環降低1℃至56℃；94℃/30s，56℃/60s，72℃/ 90s； 25個循環，72℃/7min.用Omega PCR產物純化試劑盒對產物進行切膠回收［6］.

1.3.4 16s基因擴增片段變性梯度凝膠電泳（DGGE） 聚丙烯酰胺的變性梯度范圍為35%～65%，DNA擴增產物上樣量約為200ng，60℃恒溫，80V恒壓條件下電泳13～15h，電泳完畢后采用銀染技術染色，白光成像.隨后使用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行分析，分析各泳道條帶數目及灰度. 16s基因的多樣性使用Shannon-Weaver指數H進行表征.計算公式為:

式中: Pi為每條泳道中第i條條帶灰度占該樣品總灰度的比率；S為泳道中含有的條帶總數.

所有實驗數據均在SPSS for windows （15.0）統計軟件上進行處理.

2 結果與分析

2.1 基本理化指標全年變化

官廳水庫水體溫度全年變化較大，春季水體平均溫度為4.9℃，夏季為25.9℃，秋季降低到21.9℃，冬季冰面下水體平均溫度為3.6℃.水體pH值全年呈堿性，平均值在8.7～9之間，其中秋季水體堿性最大.水體溶解氧春、冬季平均值較高，分別為7.9mg/L，8.7mg/L.，夏季為6.6mg/L，為全年最低，其中媯水河溶解氧平均濃度為7.16mg/L，水庫庫區僅為6.04mg/L.秋季水體溶解氧濃度相對夏季略有上升，媯水河溶解氧平均濃度上升到8.01mg/L，庫區平均濃度上升到6.89mg/L.

2.2 水體葉綠素a全年變化

在飲用水源地和景觀娛樂水體，發生水華的界限通常為葉綠素a（Chl-a）含量超過10mg/m3或藻類細胞密度大于20000個/mL［11］.通過對Chl-a濃度的監測，反映了水庫全年藻類的生長情況.由圖2可以看到，官廳水庫4個季節Chl-a的平均濃度分別為1.87，41.79，29.82，2.86mg/m3，夏季秋季水庫Chl-a含量超高，水華嚴重.

圖2 官廳水庫葉綠素a全年變化Fig.2 Chl-a concentration of different water samples

2.3 有機物濃度全年變化

圖3 官廳水庫全年COD變化Fig.3 COD concentration of different water samples

從時間上看，官廳水庫四季水質變化較大（如圖3），尤其是夏季，各項水質指標均嚴重超標.其中夏季6個采樣點 CODcr平均值為68.99mg/L，庫區S5采樣點處CODcr值最高達到245mg/L，明顯高于其他3個季節.從空間上看，媯水河流域采樣點（S1、S2、S3）和庫區采樣點（S4、S5、S6）水質差異明顯.庫區CODcr濃度遠高于媯水河流域.其中夏季媯水河流域采樣點平均CODcr濃度為26.5mg/L，而庫區采樣點濃度值高達111.47mg/L.

2.4 氮、磷營養濃度全年變化

圖4 官廳水庫總氮，氨氮及總磷全年變化Fig.4 Concentration of total nitrogen， ammonia， and total phosphorus of different water samples in Guanting resevior

官廳水庫已經長期處于富營養狀態，氮、磷是水庫水體主要營養污染物（圖4）.通過全年監測發現，春夏秋冬水體總氮的平均濃度分別為:1.14，2.61， 1.29， 0.62mg/L，冬季總氮含量最低，夏季最高，已超過地表V類水標準（圖4A）.乙炔還原法對官廳水庫4個季節所采水樣進行了固氮速率的檢測，只有夏季6個采樣點監測到固氮速率，水華爆發的采樣點S5處固氮速率最高，達到9.35nmolN/（m3·d），其他5個采樣點的固氮速率都小于1nmolN/（m3·d）.相比之下，富營養化水平低的媯水河流域固氮速率較庫區低很多，最小值0.172nmolN/（m3·d）出現在媯水河S3處.

官廳水庫無機氮主要以氨氮形式存在，春季水體氨氮平均濃度為0.33mg/L，夏季上升至1.86mg/L（圖4B），最大值為8.18mg/L在S5點處測得；秋季水體氨氮平均濃度又降至0.63mg/L，最大值2.77mg/L仍在S5測得；冬季氨氮濃度平均濃度降低為0.16mg/L.

通過對水體總磷濃度的監測可知（圖4C），官廳水庫4個季節各采樣點總磷平均濃度分別為0.06， 0.16， 0.14， 0.058mg/L.即使在冬季，水庫濃度都超過地表Ⅲ類水標準，夏季總磷濃度超過地表Ⅳ類水標準.4個季節水體氮磷營養物濃度依次為:夏季＞秋季＞春季＞冬季.另外從空間分布看，庫區采樣點總氮、氨氮、總磷濃度明顯高于媯水河各點.例如，在三者平均濃度最高的夏季，上游媯水河3個采樣點的總氮、氨氮、總磷平均濃度為0.95，0.55，0.077mg/L，表明媯水河水質介于地表湖庫Ⅱ類-Ⅲ類水之間.而水庫庫區3個采樣點的總氮、氨氮、總磷平均濃度則分別達到了4.27，3.16， 0.25mg/L，均超過地表湖庫Ⅴ類水標準.這表明，官廳水庫庫區水體水質及營養狀態比媯水河嚴重，尤其以夏秋季最為明顯.

2.5 水樣DNA的提取及16s基因PCR-DGGE結果擴增分析

為了增加DNA的提取效率，在使用試劑盒提取水體DNA樣品的過程中增加了機械力細胞破碎的步驟使水體微生物DNA盡量多的釋放.提取出的DNA樣品經過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，片段長度均在23kb左右， OD260/280在1.6～1.8之間.細菌16S rDNA PCR目標片段的條帶清晰，位置正確，擴增產物可用于后續DGGE分析.樣品的PCR產物經DGGE分析后，官廳水庫細菌群落DGGE結果見圖5.

圖5 官廳水庫四季細菌群落DGGE圖譜Fig.5 DGGE band profiles of 16s gene iamplified using four seasons genomic DNA

從圖5可以看到，21個樣品的PCR擴增產物經DGGE分析后，各泳道中均分離出了不同的條帶，表明DGGE可以很好的將樣品中不同菌種區分開來.泳道條帶數目代表各采樣點微生物豐度，21個采樣點形成了數目不同的條帶，且條帶的亮度和遷移速率不同，表示官廳水庫不同采樣點細菌豐度和群落結構不同.

Quantity One 軟件對DGGE所得圖譜經過泳道識別、去除背景、識別條帶、高斯模型分析之后得到各泳道的條帶數量（即豐度S），同時得出各條帶的光密度（即條帶灰度），最后根據Shannon-Weaver公式可以計算出多樣性指數H.得到官廳水庫全年細菌豐度和多樣性的變化如圖6.各采樣點微生物多樣性的計算結果顯示，各點微生物多樣性差別較大.H的數值在1.47～2.79之間.

圖6 官廳水庫細菌豐度與多樣性變化Fig.6 Richness and diversities of bacteria in different water samples of Guanting resevior

夏季隨著水體氮磷營養的升高，水體細菌豐度和多樣性上升，總體看來，水質較好的媯水河水體中細菌的多樣性和豐度都好于水華嚴重的庫區水體.9月份秋季水華期間大多數點的細菌豐度和水體多樣性均有所下降.

2.6 夏、秋季細菌群落與環境因子相關性

在獲得官廳水庫全年細菌群落變化的基礎上，重點分析7月和9月水華期間細菌群落結構的變化，并利用CANOCO軟件分析其與環境因子的相關性.結果見圖7.

由圖7可見，媯水河采樣點（S1，S2，S3）在夏、秋季細菌群落結構非常相似，被歸為一支，6個樣品之間的相似度大于57.4%.其中夏季媯水河S2、S3采樣點細菌群落結構更為相似（75.3%），秋季媯水河S1、S3采樣點細菌群落結構更為相似.庫區采樣點夏、秋兩季細菌群落結構較為相似，夏季S4、S5細菌群落結構相似度為48.6%.秋季S5、S6群落相似度為48%.由此可見夏季官廳水庫S6點細菌群落結構較為特殊，秋季S4點細菌群落結構較為特殊.

圖7 官廳水庫夏季、秋季細菌群落DGGE指紋圖譜UPGMA聚類分析Fig.7 UPGMA of DGGE fringerprint of summer and autumn water samples of Guanting resevior

總體來看，夏秋季水華期間媯水河和庫區細菌群落結構差異一直很大，而各自的細菌結構在兩次水華期間也有所不同，尤其庫區采樣點7月和9月的細菌群落結構差異很大.

對7月、9月官廳水庫水華期間細菌群落進行聚類分析之后，利用CANOCO for Windows 4.5軟件對DGGE結果和環境因子進行多變量統計分析.首先利用DCA對DGGE圖譜代表的細菌群落信息進行分析，得到的最長的梯度長度值為2.639，表明應選擇線性模型RDA對樣品進行排序分析.水樣理化指標剔除膨脹因子大于30的指標之后，進行了標準化處理［12］.典型對應分析結果概括于表1.

根據膨脹因子選擇了溫度（T）、pH值、DO、固氮速率（NFR）、總磷（TP）、Fe作為環境因子表征水體環境變化情況，Monte Carlo檢驗顯示6個環境參數與AX1軸（P=0.026）及全部排序軸（P=0.022）均有顯著的相關性.具體對應結果（表1）表明第1排序軸解釋了樣本中24.4%的變異，第2和第3排序軸分別解釋了樣本中41.2%和49.3%的變異，前4個排序軸共解釋了55.5%的樣本總變異，表明排序圖能很好的解釋官廳水庫夏季和秋季的細菌變異情況.從物種-環境的相關性看，第1和第2排序軸的種?環境相關系數分別為0.970和0.984，同時，前4個排序軸的物種?環境累積百分率高達85.9%，這說明水樣中細菌群落結構與環境因子間存在較強的關聯.水樣中微生物群落結構主要與DO、T、TP、NFR相關聯，其中DO（R2=0.5306）、T（R2=0.3708）與第1排序軸正相關，TP（R2=-0.4699）與第1排序軸負相關；T（R2=0.7490）、NFR（R2=0.6848）與第2排序軸正相關，pH（R2=-0.6005）與第2排序軸負相關，鐵與第1、2個排序軸均有一定的正相關性（R2= 0.1466， 0.3207），但相關程度不高.

表1 官廳水庫夏季、秋季細菌群落與環境因子典型對應分析結果Table 1 Data of cooresponding relations between bacterial community and environmental factors

圖8 官廳水庫夏季、秋季細菌群落與環境因子典型對應分析Fig.8 Typical cooresponding relations between bacterial community and environmental factors

物種環境排序圖中2個樣品距離的遠近表明樣品物種群落的相似程度（圖8），環境因子的箭頭方向與采樣點之間的夾角表示其和該點物種群落之間的相關性，夾角越小表示相關性越高，兩者箭頭若同向，表明正相關，反向表明負相關.從圖8可以看到，夏季官廳水庫上游媯水河3個采樣點距離較近，而其和庫區3個采樣點的距離遠，表明7月水庫上游媯水河和下游庫區的細菌群落結構差異很大，這和DGGE聚類分析的結果一致.由于夏季水溫較高，營養物質較豐富的環境中微生物生長較旺盛，會導致不同環境出現較大的微生物群落差異.從采樣點和環境因子的夾角來看，夏季7月媯水河細菌群落受水溫的影響較大，庫區細菌群落和NFR相關性較好.秋季9月水庫6個采樣點較為分散，表明9月水庫細菌群落結構差異大，其中媯水河細菌群落受DO影響較大，庫區細菌群落受pH值和TP影響較大.可見在水質較好地水域，非人為因素（溫度等）是影響水體中的微生物群落的關鍵；而存在營養化污染區域的水體，TP、pH值等相關人為因素的指標，成為影響微生態群落變化的主導因子.

3 結論

3.1 官廳水庫四季水質變化較大，庫區水質劣于上游媯水河水質，夏季媯水河水質介于地表湖庫Ⅱ類-Ⅲ類之間，而庫區水質超過地表湖庫Ⅴ類水標準.夏季和秋季庫區均存在大量的水華.

3.2 用綜合營養狀態指數法對官廳水庫的富營養狀況進行評價，結果表明官廳水庫全年水體均已經富營養化.水質較好的媯水河水體中細菌的多樣性和豐度都好于水華嚴重的庫區水體. 9月秋季水華期間大多數點的細菌豐度和水體多樣性均比夏季有所下降.

3.3 對7月和9月水華期間細菌群落和環境因子進行典型對應分析，結果表明細菌群落結構和環境因子（T、pH值、DO、NFR、TP、Fe）之間存在較強的關聯.樣品中微生物群落結構主要與DO、T、TP、NFR相關，pH值、鐵與細菌群落結構關聯度最小.7月水華期間媯水河和庫區的細菌群落結構差異很大，媯水河細菌群落受水溫的影響較大.9月水庫各點的細菌群落較為分散，群落差異大，其中媯水河細菌群落受DO影響較大，庫區細菌群落受pH值和TP影響較大.

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The corresponding of microbial diversity on water quality and environmental variables of Guanting Reservoir.

SUN Yu-jiao1， CHEN Cheng1，2， DING Ai-zhong1*， ZHAO Xiao-hui1， ZHANG Hui-chun1（1.College of Water Science，Beijing Normal University， Beijing 100875， China；2.China International Engineering Consulting Corporation Resources and Environment Business Department， Beijing 100048， China）. China Environmental Science， 2015，35（5）：1547～1553

The water quality and environmental factors of Beijing Guanting Reservoir in different seasons were analyzed based on the characterization of the data from six sampling sites. Generally， the concentrations of the nutrients including carbon， nitrogen， and phosphorus were in the orders of: summer ＞ autumn ＞ spring ＞ winter， and the outbreaks of water-blooms occurred in summer and autumn. The water quality in the upstream （Gui River）， was better than that of the downstream （reservoir area）， especially in summer and autumn. In summer， the average concentrations of total carbon，total nitrogen， ammonia nitrogen， total phosphorus in upstream were 26.5， 0.95， 0.55， 0.077mg/L respectively， while that of downstream were 111.47， 4.27， 3.16， 0.25mg/L respectively. Microbial community of the water was analyzed employing PCR-DGGE technique. The result showed that bacterial community structures varied considerably between the upstream and the downstream. The upstream water behaved the higher level of bacterial community diversity and richer degree than that of downstream water serious bloom area. In addition， CANOCA software was used to explore the response relationship between microbial community and environmental factors in summer and autumn bloom periods. The result showed strong correlation in response of bacterial community structure with environmental factors （T， pH， DO，NFR， TP， Fe）. For upstream water， the better water quality was in the bacterial community structures mainly affected by the temperature and DO factor； while for the downstream， the poor water quality was with the bacteria community structures effected mainly by environmental factors of pH， TP and NFR.

Guanting Reservoir；water bloom；environmental factors；water quality；microbiological diversity

X703.5

A

1000-6923（2015）05-1547-07

孫寓姣（1975-），女，哈爾濱人，副教授，博士，主要從事環境微生態學及環境污染生物處理技術研究.發表論文30余篇.

2014-09-31

國家自然科學基金（51178048，51378064）；北京師范大學自主基金（2014KJJCB22）

* 責任作者， 教授， ading@bnu.edu.cn