細胞腫瘤高危遺傳學異常在多發性骨髓瘤危險度分層中的應用

李 燕 楊 濤 李 靜 楊 潔 羅建民 郝洪嶺 王素云 李 杰 袁 軍 王瑞倉 陳 華

(河北省人民醫院血液科，河北 石家莊 050051)

多發性骨髓瘤是骨髓內漿細胞異常增生的一種血液系統惡性腫瘤，在中、老年群體中具有較高的發病率，并以50～60歲之間為多，40歲以下罕見〔1〕?；颊吲R床大多表現出不同程度的貧血、骨痛、腎功能不全、反復感染、出血等。而各種分子遺傳學異?，F象會對疾病的發展產生一定的影響，并對其危險度分層和預后等產生較大的影響〔2〕。本研究利用熒光原位雜交法對初治多發性骨髓瘤及人多發性骨髓瘤細胞系的分子遺傳學異常進行檢測和比較，篩選細胞腫瘤高危遺傳學異常。

1 資料與方法

1.1一般資料 人多發性骨髓瘤細胞系7株分型與來源見表1。我院2011年12月至2014年12月83例初治多發性骨髓瘤患者設為對照組，其中男50例，女33例，年齡31～84歲，行骨髓穿刺抽取骨髓液。主要儀器和試劑包括DNA探針(北京中杉金橋生物技術有限公司)、離心涂片機(上海思伯明儀器設備有限公司)、雙色雙融合探針(上海信裕生物科技有限公司)、胃蛋白酶(湖北生物科技發展有限公司)、原位雜交儀(杭州奧盛儀器有限公司)。其中，雙色雙融合探針包括SpeetrunOrangeTM和SpeetmnGreenTM標記的IGH/CCND1和IGH/FGFR3及IGH/MAF雙色雙融合探針。

1.2處理標本 對玻片分別進行泡酸和酒精浸泡處理，然后對人多發性骨髓瘤細胞系進行復蘇，分析染色體核型，并利用PBS液進行細胞重懸。每張玻片加70 μl細胞懸液置于離心涂片機中予以5 min離心，離心結束利用甲醇、冰醋酸(3∶1)進行10 min固定后妥善保存，保存溫度設置為－20℃。梯度離心細胞，獲得骨髓單個核細胞后利用PBS液獲得細胞懸液備用。向細胞中添加 CD138磁珠，添加量為每5×106個細胞10 μl CD138磁珠，于4℃條件下進行15 min的孵育后進行過柱分離，得到漿細胞，取3×105個漿細胞，利用1 ml PBS液予以重懸將玻片擦干之后，每張玻片加70 μl細胞懸液置于離心涂片機中予以5 min離心。離心結束進行固定并保存備用，保存溫度設置為－20℃。

表1 7株人多發性骨髓瘤細胞系情況

1.3熒光原位雜交 對細胞涂片進行10 min的老化，條件設置:37℃ 2×SSC，然后置于37℃ 0.2 mg/ml的胃蛋白酶中進行10 min孵育后于室溫條件下，利用2×SSC進行3 min漂洗。然后分別利用75%、85%、100%的酒精脫水，每次脫水1 min。脫水完畢之后，在暗環境條件下，將1 μl去離子水和7 μl雜交緩沖液2 μl探針進行混合，并使之充分均勻。將10 μl反應體系加入每張標本中，添加完畢加蓋玻片，四周封牢。置于原位雜交儀中，于78℃條件下進行5 min的熱變性，并分別為42℃條件下復性16 h。將雜交后的玻璃片去掉蓋玻片，立即置于72℃條件下進行0.4×SSC/0.3×NP40中進行2 min清洗。并于常溫條件下進行再次清洗，晾干。然后將抗衰變劑及DAPI復染液添加到每一張片子上，并利用配有三色色濾光片的熒光顯微鏡計數500個細胞。

1.4統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件包進行χ2檢驗。

2結果

2.1初治多發性骨髓瘤和骨髓瘤細胞系遺傳學異常檢出情況初治多發性骨髓瘤細胞遺傳學總體檢出率為85.54%(71/83)，伴有 RB-1缺失 39例(45.88%)、出現 P53缺失 18例(21.18%)、伴有1q21擴增46例(54.12%)、存在IGH異常54例(63.53%)、IGH/CCND1 陽性 24 例(28.24%)、IGH/FGFR3陽性 22例(25.88%)、IGH/MAF 陽性3例(3.53%)。

2.2初治多發性骨髓瘤和骨髓瘤細胞系遺傳學異常比較 利用不同的DNA探針進行檢測，可以發現所有人多發性骨髓瘤細胞系以及大部分初治多發性骨髓瘤中均存在分子遺傳學異常，但二者無統計學差異(P＞0.05)。且人多發性骨髓瘤細胞系同時合并多種遺傳學異常的情況較為多見。1例為人多發性骨髓瘤細胞系伴有IGH/CCND1，且IGH/FGFR3陽性檢出率顯著高于初治多發性骨髓瘤(P＜0.05)。6例人多發性骨髓瘤細胞系具有1q21的擴增，但與初治多發性骨髓瘤之間無統計學意義(P＞0.05)。在RB-1缺失方面，人多發性骨髓瘤細胞系與初治多發性骨髓瘤之間的差異無統計學意義(P＞0.05)，但在P53缺失方面有統計學差異(P＜0.05)，IGH/MAF陽性有統計學差異(P＜0.05);但在1q21擴增和IGH異常、IGH/CCNDl陽性均無統計學差異(P＞0.05)。

3討論

多發性骨髓瘤是一種血液系統惡性腫瘤，可以對人體的各臟器造成損害。隨著疾病的進展，多發性骨髓瘤可出現髓外侵犯，甚至轉化為漿細胞白血病。整個過程中，細胞和分子遺傳學的異常事件的積累發揮了出重要的作用。在正常狀態下，漿細胞會生成各種抗體，并發揮出強大的抗感染作用。但是，當漿細胞發生癌變的時候，正常的細胞功能會受到較大的影響，且出現異常的增殖現象，無法發揮正常的生理功能〔3，4〕。而這些大量增殖功能異常的漿細胞侵犯到人體各臟器，引發重要器官病變。臨床對多發性骨髓瘤患者進行治療的時候，大多采用化療等方式。為了提高化療效果，需要做好對疾病的準確分期，其中，細胞遺傳學檢查是一種常見的檢查方式〔5〕。通過對患者進行細胞遺傳學檢查，在細胞里發現染色體異?！?〕。多發性骨髓瘤常伴有細胞遺傳學的異常，大部分人多發性骨髓瘤細胞系來源于骨髓外漿細胞腫瘤，其遺傳學異?？梢詫Ω鞣N高度侵襲性漿細胞腫瘤的遺傳學特征予以較好反映〔7，8〕。多發性骨髓瘤常伴有細胞遺傳學的異常，其遺傳學異常分為非超二倍體和超二倍體兩類，其中超二倍體被列為低危組，伴有超二倍體的患者常常預后較好，表現出更好的生存優勢〔9，10〕。漿細胞腫瘤的顯著特征便是基因組高度不穩定。本研究中，人多發性骨髓瘤細胞系和初治多發性骨髓瘤在IGH異常檢出率不存在統計學差異;分析出現這一結果的原因，可能是因為IGH易位出現于多發性骨髓瘤的早期病變階段，因此，對于是否存出現了IGH異常，并不會隨著疾病的發展而出現相應的改變〔11〕。本次研究結果中，有1例為人多發性骨髓瘤細胞系伴有IGH/CCND1，且IGH/FGFR3陽性檢出率顯著高于正常多發性骨髓瘤。分析出現這一結果的原因，可能是受到本次研究所檢測細胞學數量相對較少的影響，選擇存在偏移。因此，還需要在擴大樣本分析。1號染色體不穩定是惡性漿細胞腫瘤的重要特征，疾病的發展可能與定位于1號染色體的基因異常之間存在一定的關系〔12，13〕。13號染色體異常是多發性骨髓瘤常見的遺傳學異常。p53是一種抗癌基因，因編碼一種分子質量為53 kD的蛋白質而得名〔14〕。p53蛋白質能夠遏制細胞的增殖，具有遏制癌細胞的作用，可以作為重要的轉錄因子調控150多種基因的表達。p53是機體內最重要一種抑癌因子，當p53正常發揮功能時，它參與細胞分裂的調控。而當某些原因例如基因突變使得p53蛋白功能出現異常時，則會引起失控性細胞分裂最終有可能導致癌癥發生〔15〕。位于染色體17p13的抑癌基因p53的缺失會對多發性骨髓瘤的預后效果產生較大的影響，如果出現p53缺失的伴隨情況，則多發性骨髓瘤常常和循環漿細胞梳理的增加相關，提示腫瘤細胞容易與骨髓微環境出現分離，產生單獨存在的情況。而絕大多數大部分人多發性骨髓瘤細胞系來源于骨髓外漿細胞腫瘤，p53缺失是人多發性骨髓瘤細胞系的顯著特征。

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