柚皮素緩解小鼠金黃色葡萄球菌肺炎的損傷作用及其機制

吳文偉 鄭世翔 翁欽永 陳冬梅 (福建醫科大學附屬協和醫院重癥醫學科，福建 福州 35000)

金黃色葡萄球菌肺炎臨床上主要表現為支氣管膿性分泌物增多、寒戰、高熱、呼吸困難等癥狀〔1〕。據調查統計，金黃色葡萄球菌肺炎占肺炎的2% ～3%，尤其是兒童、年老體弱者發病率較高。研究發現〔2〕，柚皮素能夠改善金黃色葡萄球菌肺炎病情，本文通過觀察柚皮素治療金黃色葡萄球菌肺炎小鼠的情況，探討其作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 健康成年清潔級雄性C57BL/6J小鼠90只，體重18～25 g，購自上海斯萊克實驗動物生產有限公司。采用抽簽法隨機分為對照組、模型組以及干預組，每組30只。實驗操作嚴格依據中國科學技術委員會提出的《實驗動物管理條例》進行。各組實驗動物的體重、飼養方式、鼠齡無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2主要試劑及儀器 柚皮素(購自中國藥品生物制品檢定所);金黃色葡萄球菌8325-4菌(購自愛爾蘭學院);小鼠白細胞介素(IL)-6、IL-1β以及腫瘤壞死因子(TNF)-α的ELISA試劑盒(購自Biolegend有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、電子天平、紫外可見分光光度計、光學顯微鏡、低溫高速離心機均由福建醫科大學附屬協和醫院中心實驗室提供。

1.3制備模型 雄性的C57BL/6J小鼠，體重18～25 g，均飼養于干凈的代謝籠中，每日給予充足的水源以及標準實驗室內動物飼料，室內環境控制在12/12 h黑白交替，溫度控制在20℃ ～25℃，濕度控制在55% ～60%范圍內。小鼠1 w適應后建立金黃色葡萄球菌肺炎模型。將金黃色葡萄球菌8325-4菌液15 μl經模型組及干預組小鼠鼻孔緩慢滴入小鼠鼻腔內。

1.4方法 隨機選取已造模的C57BL/6J小鼠60只，隨機分為模型組和干預組，每組30只。另外隨機選取正常C57BL/6J小鼠30只作為對照組。干預組小鼠給予柚皮素100 mg/kg，1次/12 h，皮下注射。2 d后，運用頸椎脫臼方法處死小鼠，每組取10只小鼠，對肺內菌落進行計數;每組取10只小鼠，處理肺臟組織制作成病理切片，進行病理學研究;每組取10只小鼠，對細胞因子IL-6、IL-1β以及TNF-α進行測定。

1.5檢測方法

1.5.1菌落計數 在實驗2 d后對每組10只小鼠頸椎脫臼處死，在無菌操作下取出肺臟，稱重、組織勻漿、稀釋，固定于培養基表層，恒溫箱培養24 h后顯微鏡下進行菌落計數。

1.5.2病理學觀察 在實驗2 d后對每組10只小鼠頸椎脫臼處死，在無菌操作下取出肺臟，制作組織切片，光學顯微鏡下觀察病理情況，并進行采集圖像。

1.5.3IL-6、IL-1β以及TNF-α測定 在實驗2 d后對每組10只小鼠頸椎脫臼處死，運用ELISA方法對肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β 以及 TNF-α 進行測定，用 IL-6、IL-1β 以及 TNF-α ELISA試劑盒。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1菌落計數 2 d后，模型組(5.9×106CFUs/mg)與干預組(2.3×104CFUs/mg)肺內菌落計數較對照組(1.0×102CFUs/mg)均有所增加(P＜0.05);與模型組比較，干預組肺內菌落計數均有所改善(P＜0.05)。

2.2病理學觀察 HE染色后觀察到，對照組中肺內組織結構完整，肺泡邊緣整齊，肺泡腔內無異常;金色葡萄球菌8325-4肺炎模型組中的肺內組織結構模糊，無法識別，大量細菌彌漫在整個肺內，無肺泡結構，部分炎性細胞破裂壞死，細支氣管上皮細胞部分壞死，其腔內有大量的炎性細胞，同時血管周圍水腫，并有纖維組織滲出;柚皮素干預組小鼠肺內組織中，部分肺泡腔融合，肺泡壁毛細血管呈現略有擴張、少量的充血以及炎性細胞的浸潤。見圖1。

圖1 三組肺臟病理改變(HE，×400)

2.3各組IL-6、IL-1β以及TNF-α水平測定 2 d后，模型組與干預組IL-6、IL-1β以及 TNF-α均有所增加(P＜0.05);與模型組比較，干預組IL-6、IL-1β以及TNF-α均有所改善(P＜0.05)。見表1。

表1 各組小鼠IL-6、IL-1β以及TNF-α水平(s，pg/ml，n=10)

表1 各組小鼠IL-6、IL-1β以及TNF-α水平(s，pg/ml，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 IL-6 IL-1β TNF-α干預組 284.82±21.541)2) 80.23±12.361)2) 125.75±14.371)2)模型組 785.69±50.311) 289.33±26.361) 384.74±26.181)對照組134.25±25.36 46.36±8.23 51.36±9.75

3討論

金黃色葡萄球菌肺炎是肺炎中較重的一種，具有較高的死亡率和發病率〔3〕。而金黃色葡萄球菌主要致病力取決于外毒素，這些外毒素協助金黃色葡萄球菌侵入宿主〔4〕。α-溶血素就是其中主要的一種外毒素，是影響金黃色葡萄球菌致病力中主要的一種，特別是在肺炎的發病機制中必不可少。柚皮素是柚皮甙的甙元，屬于二氫黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、清除自由基、抗氧化等功能〔5〕。本實驗結果提示柚皮素對金黃色葡萄球菌肺炎有很好的抗菌作用，能夠抑制金黃色葡萄球菌的繁殖，對肺炎具有一定的療效。病理學改變提示柚皮素對金黃色葡萄球菌肺炎的肺內組織具有很好的保護作用，可能其機制與抑制α-溶血素有關〔6～9〕，從而阻止金黃色葡萄球菌的侵襲。并且柚皮素對于金黃色葡萄球菌肺炎小鼠肺泡灌液相關的細胞因子具有一定的改善作用。

柚皮素可顯著減少金葡菌肺炎感染小鼠肺組織中菌落數目，能夠明顯緩解金黃色葡萄球菌肺炎炎癥，值得推廣。

1 彭 洋，陳小鳳，畢嘉琦，等.利奈唑胺與替考拉寧比較治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌肺炎的Meta分析〔J〕.中國循證醫學雜志，2013;13(11):1340-6.

2 Peng X，Wu W，Zhu B.Activation of farnesoid X receptor induces RECK expression in mouse liver〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2014;443(1):211-6.

3 王麗春，李大江，熊中華，等.金黃色葡萄球菌醫院感染的臨床及耐藥性分析〔J〕.中華醫院感染學雜志，2008;18(10):1485-8.

4 陳道利，高 崢.凝固酶及核酸酶試驗綜合評價金黃色葡萄球菌致癌力的實驗研究〔J〕.中國衛生檢驗雜志，2001;11(3):257-8.

5 陳 彥，辛 然，陳良慧，等.柚皮素、橙皮素的大鼠在體腸吸收特性研究〔J〕.中國現代應用藥學，2013;5(6):465-9.

6 翟遠坤，潘亞磊，牛銀波，等.柚皮苷及其代謝物柚皮素對乳鼠顱骨成骨細胞分化成熟影響的比較研究〔J〕.中國藥學雜志，2013;48(10):1373-9.

7 孫國玲，錢大瑋，段金廒，等.大鼠灌胃毛橘紅醇提物血漿中柚皮苷、柚皮素及其代謝產物液質分析〔J〕.中國中藥雜志，2010;35(12):1580-5.

8 李桃園，王 昕，趙 旋，等.柚皮素對四氯化碳致小鼠化學性肝損傷中氧化應激介質生成影響的實驗研究〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2010;26(6):420-3.

9 李紅艷，梁 斌，陳志婷，等.不同劑量柚皮素對CNE2細胞生長的雙向調節作用及其機制研究〔J〕.中國藥學雜志，2013;48(23):2006-12.