負性情緒應激大鼠模型的建立與評價

王慧霞 詹向紅 李 偉 劉勝利 王有杰 于華林 伍盼盼 孫前明 潘玉穎

(河南中醫學院，河南 鄭州 450008)

伴隨社會應激事件頻頻發生，人們感受到越來越多的緊張，由此引發的情緒問題也日益增多，情緒沖突已成為多種疾病發病率升高的重要原因之一，并在引起老年相關疾病的過程中起重要作用。國外報道顯示經常遭受負性情緒應激的個體記憶力更易減退〔1〕，本課題組前期研究結果也顯示，單一憤怒情緒可加速腦老化〔2〕。然而，有學者〔3〕對情志病患者研究發現，兩種或兩種以上負性情緒共同致病者占全部病例的88.97%，即多情交織共同致病更為常見。那么，多種負性情緒長期積累對腦老化進程會產生怎樣的影響，其機制如何?本課題以負性情緒為切入點，試圖建立負性情緒應激大鼠模型，為情緒應激動物模型的研制開拓新思路，并為情志內傷理論增添新的認識。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 Wistar大鼠70只，SPF級3月齡，雌雄各35只，雄鼠體重(360±10)g，雌鼠體重(300±10)g，購于山東魯抗公司(SCXK(魯)2013-0001)。在河南省中醫藥研究院動物實驗中心IVC環境動物實驗室(SYXK(豫)2012-0009)進行實驗，并由該實驗室提供標準實驗動物滅菌墊料。所有的實驗過程經河南中醫學院動物倫理委員會批準進行。正常飼養1 w后，按體重和曠場實驗得分，剔除結果偏離大的個體，余下的大鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、D-半乳糖(D-gal)衰老及腦老化組(D-gal組)、負性情緒應激組(應激組)、D-gal+負性情緒應激組(應激D-gal組)，每組14只，雌雄各半，其余作為攻擊鼠。各組雌雄分籠飼養，自由飲食飲水。

1.1.2主要實驗儀器及試劑 曠場實驗箱(上海欣軟信息科技有限公司);Smart視頻圖像跟蹤分析系統(Media Cybernetics.Inc);Nikon單反數碼攝像機(日本尼康);PK-DS-112U頻閃儀(上海臨宜電氣設備有限公司);HY-2調速多用振蕩器(金壇市金城國勝實驗儀器廠);AES-340大鼠飲水沖突實驗系統(寧波市科技園區安來軟件科技有限公司);TDCG接觸式調壓器(金壇市環宇科學儀器廠);全波長自動酶標分析儀、1575自動酶標洗板機(美國Thermo Scientific公司);大鼠血漿NE酶免試劑盒、5-羥色胺(5-HT)酶免試劑盒(美國R＆D公司，批號:14-02);大鼠血漿多巴胺(DA)酶免試劑盒(美國R＆D公司，批號:13-12);D-gal(美國 Amresco公司，批號:20130806);生理鹽水(竹林眾生制藥廠，批號:20130915);蔗糖(北京化學試劑公司，批號:20131106)。

1.2方法

1.2.1衰老模型復制 參考文獻〔4〕方法:將大量的D-gal粉末溶于生理鹽水，配制濃度為2%D-gal，并滅菌以備用。采用頸背部皮下多點注射，注射容量為1 ml/100 g，1次/d;空白對照組注射同等體積生理鹽水，連續6 w。每周測1次體重，根據測得體重計算注射容量。

1.2.2負性情緒應激引入 采用不可預知性心理應激(CUMS)誘導方法，應激組、應激D-gal組分別接受28 d八種不同的應激，分別為束縛(6 h/d)、溫水游泳(水桶高50 cm，直徑30 cm，水深30 cm，溫度為 23℃ ±0.5℃，15 min/d)、間接電擊(電壓 40 V，1 ～2 次/min，15 min/d)、搖晃(160 次/min，30 min/d)、強光(300閃光/min，5 h/d)、潮濕墊料(每 100 g墊料灑入 250 ml水，12 h/d)、噪聲(90 dB，3 h/d)、懲罰性飲水(0.5 mA，10 min)，每天1種，隨機出現。

1.2.3曠場實驗 應激結束后，一個實驗人員握住大鼠尾根部1/3處，小心放入曠場正中格，另一個實驗人員電腦操作Smart視頻跟蹤系統，自動記錄動物3 min的行為變化及得分:①水平得分:動物穿越底面方格(四爪均進入的方格計數);②垂直得分:直立次數(兩前爪騰空或攀附墻壁);③曠場實驗得分=①+②。同時記錄中央格停留時間、修飾次數、糞便粒數。實驗過程中及時用酒精擦拭其運動軌跡，防止殘留氣味線索。

1.2.4糖水消耗實驗 大鼠單籠飼養，實驗前訓練動物適應蔗糖水;第一個24 h，給予每只大鼠一瓶1%蔗糖水;第2天禁食禁水23 h，之后進行正式實驗，即給予每只大鼠一瓶200 ml的1%蔗糖水，1 h后取走并用量筒稱取剩余糖水量，計算應激前后每只動物的糖水消耗量〔5〕。

1.2.524 h攝食量測定 于應激前和應激結束后測量，早上8:00給每籠大鼠添加飼料200 g，選擇顆粒較大的飼料，以防止飼料過小掉入鼠籠引起實驗誤差，次日8:00稱量剩余飼料量，計算24 h各組大鼠攝食量〔6〕。

1.2.6標本采集與制備 實驗第47天取材，按照0.3 ml/100 g注射10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后經腹主動脈取血4～5 ml，裝于含乙二胺四乙酸(EDTA)鈉的抗凝管中，靜置、離心，吸取上清液，－70℃保存，用于測定大鼠血漿促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質酮(CORT)、去甲腎上腺素(NE)、5-HT。

1.3統計學方法 應用SPSS13.0軟件，多組間均數比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);組間兩兩比較，方差齊的資料采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗。

2結果

2.1大鼠的行為表現 應激前期，應激組和應激D-gal組大鼠精神緊張，毛發豎立，尖叫，個別大鼠與同伴打斗、撕咬;隨著應激時間延長，大鼠毛發零亂，目光無神，籠內大鼠緊挨，頭部蜷縮于身體中，飲水及攝食量明顯減少，夜間時有細聲尖叫。

2.2曠場實驗結果 各組曠場實驗基線得分無統計學差異(P＞0.05)。造模后，與空白對照組相比，應激組大鼠曠場實驗水平得分、垂直得分及總分下降，中央格停留時間增加(P＜0.05)。見表1。

2.3糖水消耗量及24 h攝食量比較果 各組基線糖水消耗量及24 h攝食量無統計學差異(P＞0.05)，與空白對照組相比，應激組大鼠造模后糖水消耗量、24 h攝食量減少(P＜0.05)。見表2。

2.4生化指標檢測結果 與空白對照組相比，應激組大鼠血漿ACTH、CORT、NE水平上升，5-HT水平下降(P＜0.05)。見表3。

表1 四組大鼠曠場實驗得分比較(x ± s，n=14)

表2 四組大鼠造模前后糖水消耗量及24 h攝食量比較(x ± s，n=14)

表3 四組大鼠血漿ACTH、CORT、NE、5-HT水平比較(x ±s，ng/L，n=14)

3討論

已有醫家將七情學說類比于應激理論〔7〕，國外有研究報道顯示〔8〕，有暴力和幼年虐待經歷會增加人們產生抑郁癥狀的風險，負性應激事件與不良的健康狀況相關〔9〕。這與中醫由情志不暢引起的肝郁證有相通之處，兩者共同闡述了在遭遇持續不良心理應激時，個體內部的心理及生理狀態發生變化，并最終累積形成肝氣郁結狀態的過程。情緒心理學中，抑郁比其他情緒都更為強烈持久，任何負性情緒體驗交織在心中長期積累并互相影響，最終會使機體處于壓抑、抑郁狀態中。

有學者〔10〕采用束縛、居住入侵〔11〕制作肝郁模型，但存在軀體應激及模型復制成功率低等缺點，且應激方法多為單一應激方式持續作用于動物。本實驗發現，同一種刺激方式可使動物能預測到下一個刺激的產生并逃避，減弱應激模型復制效果，應激因子的不可預測性是動物逃避反應缺失的關鍵〔12〕。

慢性輕度CUMS模型能較成功地誘發出以抑郁為主的負性情緒，應激因子多樣化且不可預測，能避免單一刺激引起的適應性，可應用于慢性心理應激的神經生物學和行為心理學研究，但其中的電擊、禁水禁食對動物產生軀體應激。因此，篩選出間接電擊、懲罰性飲水、噪聲、強光、搖晃、潮濕墊料、溫水游泳和束縛八種應激因子，建立一個新的CUMS的誘導方法，每種應激方式最大限度地減少了軀體應激成分，所產生的心理應激反應相對純粹。應激時間的長短可使模型所產生的情緒反應類型不同，有文獻報道證實，短時間的應激條件下動物產生的反應以焦慮為主，長時間的應激作用會使動物的抑郁成分顯著增加〔13〕。本實驗目的旨在研究長期負性情緒應激對D-gal大鼠的影響，因此在模型的制備方面側重于將單一應激因子的作用時間適當延長。對于應激動物的選擇，雄性動物容易受到社會等級等社會心理因素影響，而雌性動物較少感受到，雌性動物的生理條件對較弱的應激更為敏感，因此，基于雌雄動物的應激反應差異以及女性的高情緒障礙罹患率，有必要將性別因素納入情緒應激動物模型的研究設計中，以均衡性別對實驗結果產生的影響。

本文結果提示慢性負性情緒應激降低了大鼠的興奮性和探究趨勢及認知功能。應激組糖水消耗量減少，這與任利翔等〔14〕的研究結果一致。大鼠有嗜甜食的習慣，糖水消耗量下降反映出大鼠的“快感缺失”狀態，這與人類在負性情緒狀態下，對通常令人感到愉悅的事物缺乏愉快的情緒反應相似。應激組24 h攝食量減少，這與人類在負性情緒狀態時表現的食欲下降等癥狀相符，該現象可能為大鼠受到各種應激因子作用致作息規律紊亂所致。

應激反應是指在應激源的刺激下，個體所產生的生理、心理及行為反應。在日常生活中，應激源多種多樣，如社會環境、生活事件、自然災害等。當各種應激源作用于人體時，機體會產生一系列以下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸為核心的神經內分泌反應，參與其中的激素包括促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、ACTH和糖皮質激素(GC)。HPA軸激活，下丘腦釋放的CRH升高，CRH的高分泌促進了垂體ACTH水平上升，后者又作用于腎上腺皮質，引起GC水平升高，應激學說與中醫七情理論接近〔15〕，長期應激導致抑郁可能是通過HPA軸功能持續亢進，皮質醇升高并激動糖皮質激素受體，最終破壞海馬神經細胞，導致海馬體積縮小而發生的〔16〕。中樞單胺類神經遞質包括NE，5-HT，DA。NE與應激時情緒反應相關，是交感-腎上腺-髓質激活的主要指標，血漿NE水平可反映外周交感神經的功能。5-HT參與調節睡眠、情緒、記憶等行為，當機體受到各種心理應激時，大腦5-HT的合成和代謝產生變化，大量不同的受體系統相互協調介導5-HT參與情緒的抑制控制過程，因此5-HT及其受體功能失調與抑郁等精神疾患相關。DA參與調控運動、動機與獎賞、內分泌等過程，DA能系統更多地涉及愉悅等正性心理過程，傳遞愉悅、興奮等信息。三類神經遞質參與不同的系統，它們之間相互制約，相互協調以維持機體正常的情緒活動和記憶功能，在一定程度上血漿中單胺類神經遞質的改變可以反映中樞單胺類神經遞質的濃度變化。

應激組大鼠血漿ACTH、CORT、NE水平升高，可能是因為負性情緒應激狀態下，大鼠的HPA軸和交感-腎上腺-髓質的激活使體內ACTH、CORT、NE大量釋放入血，該結論印證了嚴燦等〔17〕的研究結果;另外，許多學者認為肝郁證是由5-HT功能低下所致〔18〕，由此可推斷大鼠在應激之后的狀態為肝郁證。

1 Miller DB，O'Callaghan JP.Aging，stress and the hippocampus〔J〕.Ageing Res Rev，2005;4(2):123-40.

2 詹向紅，李 偉，趙君玫，等.慢性憤怒應激對大鼠衰老進程及其神經內分泌免疫機制的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2010;25(1):111-3.

3 祝玉慧.情志交織致病與傷臟規律研究-多情交織致情志病證流行病學調查〔D〕.濟南:山東中醫藥大學博士學位論文，2009:28.

4 陳可冀，李春生.新編抗衰老中藥學〔M〕.北京:人民衛生出版社，1998:153-62.

5 Willner P.Validity，reliability and utility of the chronic mild stress model of depression:a 10-year review and evaluation〔J〕.Psychopharmacology，1997;134(4):319-29.

6 Grippo AJ，Moffitt JA，Johnson AK.Evaluation of baroreceptor reflex function in the chronic mild stress rodent model of depression〔J〕.Psychosom Med，2008;70(4):435-43.

7 周象賢，周 萍.七情學說與應激理論之特征比較〔J〕.醫學與哲學，2001;22(6):49-50.

8 Dwivedi Y，Mondal AC，Shukla PK，et al.Altered protein kinase a in brain of learned helpless rats:effects of acute and repeated stress〔J〕.Biol Psychiatr，2004;56(1):30-40.

9 Seib C，Whiteside E，Humphreys J，et al.A longitudinal study of the impact of chronic psychological stress on health-related quality of life and clinical biomarkers:protocol for the Australian Healthy Aging of Women Study〔J〕.BMC Public Health，2014;14:9.

10 賀立娟，王玉來，郭蓉娟，等.肝氣郁結證大鼠模型的建立及評價〔J〕.北京中醫藥大學學報(中醫臨床版)，2013;20(6):10-3.

11 魏 盛，王海蘋，喬明琦.慢性束縛應激及居住入侵法制備經前期綜合征肝氣郁證大鼠模型的行為學觀測與分析〔J〕.世界科學技術(中醫藥現代化)，2012;14(4):1848-52.

12 Murua VS，Gomez RA，Andrea ME，et al.Shttle-box deficits induced by chronic variable stress:reversal by imipramine administration〔J〕.Pharmacol Biochem Behav，1991;38(1):125-30.

13 亓曉麗，林文娟.焦慮和抑郁動物模型的研究方法和策略〔J〕.心理科學進展，2005;13(3):327-32.

14 任利翔，羅軼凡，高 威.知母總皂苷對慢性溫和應激小鼠的保護作用及機制研究〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2011;22(4):414-7.

15 周象賢，周 萍.七情學說與應激理論之特征比較〔J〕.醫學與哲學，2001;22(6):49-50.

16 Caetano SC，Fonseca M，Hatch JP，et al.Medical temporal lobe abnormalities in pediatric unipolar depression〔J〕.Neurosci Lett，2007;427(3):142-7.

17 嚴 燦，徐志偉，李 艷，等.調肝、補腎、健脾方藥對慢性心理應激大鼠單胺類神經遞質影響的比較研究〔J〕.中國中西醫結合雜志，2002;22(12):925-8.

18 趙彬元，李玉霞，明海霞，等.電刺激單、雙側迷走神經對肝郁證大鼠模型腦內 NE、DA、5-HT和5-HIAA的影響〔J〕.中醫研究，2013;26(1):64-6.